BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ACID LACTIC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM MỐC TỪ NEM CHUA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS NGÔ THỊ PHƯƠNG DUNG TRẦN HỒNG VÂN MSSV: 3082646 LỚP: CNSH TT K34 Cần Thơ, Tháng 05/2013 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013 Trường Đại học Cần Thơ PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS Ngô Thị Phương Dung Trần Hồng Vân DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng 05 năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm tạ hướng dẫn giúp đỡ TS Ngô Thị Phương Dung giúp đỡ, hỗ trợ góp ý ThS Huỳnh Xuân Phong suốt trình thực đề tài luận văn Xin cám ơn anh Nguyễn Ngọc Thạnh, anh Phạm Hồng Quang – quản lý phòng thí nghiệm CNSH thực phẩm quý thầy cô, anh chị quản lý phòng thí nghiệm Viện NC&PT CNSH hỗ trợ, tạo điều kiện thuận lợi, đóng góp ý kiến cho việc hoàn thành đề tài nghiêm cứu Xin gửi lời tri ân đến thầy cô giảng dạy suốt trình học tập rèn luyện Xin cám ơn hướng dẫn cố vấn học tập PGS TS Nguyễn Hữu Hiệp Xin cám ơn anh chị học viên cao học, bạn sinh viên lớp CNSH TT K34 CNSH K35 phòng CNSH thực phẩm trực tiếp giúp đỡ thực đề tài Xin cám ơn động viên hỗ trợ từ gia đình bạn bè thời gian qua Xin trân trọng cám ơn! Trần Hồng Vân Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013 Trường Đại học Cần Thơ TÓM LƯỢC Vi khuẩn acid lactic đóng vai trò quan trọng bảo quản thực phẩm nhờ khả kháng nấm bên cạnh chức kháng khuẩn bacteriocin Sản phẩm thịt lên men nói chung nem chua nói riêng thường chịu nhiều ảnh hưởng từ nấm mốc quy trình sản xuất thủ công, bảo quản điều kiện thường sử dụng trực tiếp Đề tài tiến hành nhằm khảo sát khả kháng nấm mốc vi khuẩn acid lactic phân lập từ nem chua Năm mẫu nem chua thu thập để đánh giá cảm quan với kết tốt, đạt tổng điểm 7/10 Chỉ số pH trung bình xác định 4,7 lượng acid lactic trung bình 1,6 g/100 g mẫu Kết phân tích cho thấy mẫu nem chua có tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí nấm mốc nằm giới hạn cho phép (lần lượt 3,0.107 CFU/g 3,3.103 CFU/g) Mật số vi khuẩn acid lactic mẫu tương đương trung bình 2,2.107 CFU/g Từ mẫu nem chua khác nhau, 19 dòng vi khuẩn acid lactic dòng nấm mốc phân lập Kết khảo sát tính kháng nấm mốc cho thấy hầu hết dòng vi khuẩn acid lactic thể tính kháng mốc, dòng vi khuẩn (47%) cho kết kháng tốt 7/9 dòng nấm mốc có tính kháng mạnh (trên 10+) P32B, P41A, V13A, P21B, P31B, R11B, R14B, R22B K34B Trong số đó, dòng vi khuẩn acid lactic P32B, V13A P41A cho kết tốt xác định Lactobacillus plantarum (P32B V13A) Pediococcus pentosaceus (P41A) Từ khóa: kháng nấm mốc, nấm mốc, nem chua, vi khuẩn acid lactic Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC TÓM LƯỢC i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG iv DANH SÁCH HÌNH v TỪ VIẾT TẮT vi CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu vi khuẩn acid lactic 2.2 Ứng dụng vi khuẩn acid lactic sản phẩm thịt lên men 2.3 Khái quát nem chua Việt Nam 2.3.1 Quy trình sản xuất 2.3.2 Hệ vi sinh vật nem chua 10 2.4 Sự xâm nhiễm nấm mốc độc tố sản phẩm thịt lên men 11 2.5 Vi khuẩn acid lactic với khả kháng nấm 13 CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Phương tiện nghiên cứu 17 3.1.1 Địa điểm thời gian 17 3.1.2 Vật liệu 17 3.1.3 Thiết bị dụng cụ 17 3.1.4 Hóa chất môi trường 17 3.2 Phương pháp nghiên cứu 18 3.2.1 Thu thập mẫu 18 3.2.2 Phân tích tiêu cảm quan, số pH, định lượng acid lactic 18 3.2.3 Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí, vi khuẩn acid lactic nấm mốc 19 3.2.4 Phân lập định danh sơ vi khuẩn acid lactic từ nem chua 21 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013 Trường Đại học Cần Thơ 3.2.5 Phân lập nấm mốc từ nem chua 22 3.2.6 Khảo sát khả kháng nấm vi khuẩn acid lactic với dòng nấm phân lập 23 3.2.7 Định danh cấp độ loài dòng vi khuẩn tuyển chọn 24 3.2.8 Phương pháp phân tích xử lý số liệu 24 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Thu thập mẫu 25 4.2 Phân tích tiêu đánh giá cảm quan, số pH, định lượng acid lactic 25 4.2.1 Đánh giá cảm quan 25 4.2.2 Phân tích số pH 26 4.2.3 Định lượng acid lactic 28 4.3 Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí, vi khuẩn acid lactic nấm mốc 29 4.4 Kết phân lập vi khuẩn acid lactic từ nem chua 32 4.5 Kết phân lập nấm mốc từ nem chua 37 4.6 Khả kháng nấm mốc dòng vi khuẩn acid lactic 40 4.7 Kết định danh cấp độ loài dòng vi khuẩn tuyển chọn 44 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 45 5.1 Kết luận 45 5.2 Đề nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Phân biệt vi khuẩn acid lactic phân loài ……………………….4 Bảng 2: Chỉ tiêu tổng vi sinh vật sản phẩm thịt …………………………………….8 Bảng 3: Nhiệt độ phát triển số vi khuẩn acid lactic phổ biến ……………… Bảng 4: Chỉ tiêu cho phép vi sinh vật thịt lên men, nem chua .…………… 11 Bảng 5: Kết đánh giá cảm quan nem chua………………………………………… 25 Bảng 6: Giá trị pH năm mẫu nem chua ngày lên men thứ tư …………………… 27 Bảng 7: Độ chua Therner lượng acid lactic mẫu nem chua ……………… 28 Bảng 8: Mật số tổng vi sinh vật hiếu khí, vi khuẩn acid lactic nấm mốc ………… 29 Bảng 9: Nguồn mẫu ký hiệu dòng vi khuẩn acid lactic phân lập … 32 Bảng 10: Đặc điểm hình thái dòng vi khuẩn acid lactic phân lập …………… 33 Bảng 11: Đặc điểm sinh hóa tế bào dòng vi khuẩn acid lactic …………… 36 Bảng 12: Nguồn mẫu ký hiệu dòng nấm mốc phân lập ……………………… 37 Bảng 13: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc dòng nấm mốc phân lập …………… 38 Bảng 14: Đặc điểm vi học dòng nấm mốc quan sát kính hiển vi ……… 40 Bảng 15: Khả kháng dòng nấm mốc 19 dòng vi khuẩn acid lactic phân lập ……………………………………………………………………………….41 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Cây phát sinh loài vi khuẩn acid lactic ……………………………………….4 Hình 2: Một vài hình thái vi khuẩn acid lactic tiêu biểu ……………………………….5 Hình 3: Hình thái Penicillium sp (trái) Aspergillus sp (phải) ….…………………13 Hình 4: Những chất kháng nấm phân lập từ L amylovorus L plantarum … 14 Hình 5: Sơ đồ tiến hành thí nghiệm ……………………………………………………18 Hình 6: Màu sắc mẫu nem chua ………………………………………………… 26 Hình 7: Sự tương quan số pH lượng acid lactic nem chua ………… 29 Hình 8: Sự tương quan mật số vi khuẩn acid lactic lượng acid lactic ……… 31 Hình 9: Các dạng khuẩn lạc dòng vi khuẩn acid lactic phân lập …………… 34 Hình 10: Hình dạng tế bào vi khuẩn acid lactic độ phóng đại 1000 lần ………… 34 Hình 11: Kết nhuộm Gram vi khuẩn acid lactic phân lập ……………… 34 Hình 12: Thử nghiệm catalase mẫu vi khuẩn …………………………………… 35 Hình 13: Thử nghiện oxydase mẫu vi khuẩn …………………………………… 35 Hình 14: Khả phân giải CaCO3 dòng vi khuẩn R13A …………………… 36 Hình 15: Nấm mốc quan sát kính hiển vi độ phóng đại 400 lần ………… 39 Hình 16: Các mức độ kháng nấm mốc vi khuẩn acid lactic phân lập …………… 41 Hình 17: Kết định danh dòng vi khuẩn P32B …………………………………….45 Hình 18: Kết định danh dòng vi khuẩn V13A ……………………………………45 Hình 19: Kết định danh dòng vi khuẩn P41A …………………………………….45 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013 Trường Đại học Cần Thơ TỪ VIẾT TẮT ATP Adenosine triphosphate aw Water activity CFU Colony forming unit Kcal Kilocalorie LAB Lactic acid bacteria MEA Malt extract agar MRS De Man, Rogosa and Sharpe NAD+ Nicotinamide Adenine Dinucleotide NADH Nicotinamide Adenine Dinucleotide Hydrogen PCA Plate count agar rRNA Ribosomal ribonucleic acid rDNA Ribosomal deoxyribonucleic acid SDA Sabouraud dextrose agar SPW Saline peptone water WQA Woolworths Quality Assurance Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Sản phẩm thịt lên men biết đến từ lâu nhờ việc bổ sung muối đường vào thịt để thu loại thực phẩm thơm ngon có giá trị dinh dưỡng cao Trên thực tế, việc bổ sung tạo điều kiện thuận lợi cho phát triển vài loài vi sinh vật có sẵn sản phẩm để tạo sản phẩm có hương vị đặc biệt có tác dụng bảo quản sản phẩm lâu bị hỏng Nem chua sản phẩm lên men thịt truyền thống tiếng Việt Nam làm từ thịt heo, bì số phụ liệu khác Nem chua sản xuất nhiều vùng đất nước với thương hiệu tiếng như: nem Bình Dương, nem Thủ Đức, nem Lai Vung,… Phần lớn nem chua sản xuất quy mô hộ gia đình theo phương thức lên men tự nhiên, không sử dụng giống chủng nên chất lượng sản phẩm thường không ổn định Mặt khác, nem chua sản phẩm thường tiêu thụ sau đến ngày lên men mà không qua chế biến, nên vấn đề vệ sinh thực phẩm mối quan tâm người tiêu dùng lẫn nhà sản xuất Hiện trạng phổ biến nem chua bị nhiễm nấm mốc, nguyên nhân làm hư hỏng, mùi vị, chí gây ngộ độc Ngày nay, việc sử dụng chất hóa học kháng vi sinh vật thực phẩm thường bị người tiêu dùng từ chối tác động hóa chất lên sức khỏe Do đó, việc tìm chủng vi sinh vật vừa có khả định hướng trình lên men, đảm bảo tính ổn định cải thiện chất lượng sản phẩm vừa có khả sinh chất có khả kháng lại vi sinh vật gây bệnh cần thiết Vi khuẩn acid lactic nhóm vi khuẩn quan tâm nhiều chế biến bảo quản thực phẩm Những vi khuẩn sử dụng phổ biến với mục đích lên men, acid hóa nguyên liệu thông qua việc sản sinh acid hữu cơ, đặc biệt acid lactic Bên cạnh đặc tính tiêu biểu sinh bacteriocin kháng khuẩn, vi khuẩn acid lactic có khả kháng nấm hiệu Chúng sinh hợp chất kháng nấm quan trọng bảo quản thực phẩm như: acid hữu cơ, hydrogen peroxide, diacetyl, reuterin, reutericyclin, hợp chất phenolic, hydroxyl fatty acid,… Đề tài “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn acid lactic có khả kháng nấm mốc từ nem chua” thực nhằm phân lập dòng vi khuẩn acid lactic ứng dụng cải thiện chất lượng sản phẩm lên men đánh giá khả kháng nấm mốc dòng phân lập Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC BẢNG ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN NEM CHUA Chỉ tiêu điểm điểm điểm Màu sắc Trắng hồng/ đỏ Hồng tươi Đỏ thẫm Mùi Không mùi Thơm Nồng Vị Nhạt Chua Quá chua/ đắng Mốc Không mốc Không mốc Mốc Độ dính Rời thịt Dính thịt Dính nhớt Cho điểm theo tiêu điểm: chấp nhận điểm: đạt điểm: không đạt Nếu 3/5 tiêu trở lên đạt điểm mẫu nem chua coi có giá trị cảm quan tốt (không áp dụng cho tiêu mốc) Nguồn: Nguyễn Thị Kim Chung (2010) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Đếm mật số vi sinh vật buồng đếm hồng cầu Nguyên tắc Lắc ống nghiệm chứa mẫu pha loãng, dùng ống hút hút giọt vào mặt kính, đậy kính lên lưới đếm Chú ý không để tạo thành bọt khí lưới đếm tràn dịch mẫu xuống rãnh Đặt buồng đếm lên bàn kính hiển vi, sau tiến hành đếm tế bào ô lớn góc Trong ô lớn, đếm từ ô thứ đến ô thứ 16 Chỉ đếm tế bào nằm bên ô tế bào nằm cạnh liên tiếp chiều Ghi số lượng tế bào đếm ô lớn Đếm buồng đếm sau lấy giá trị trung bình Sau dùng xong buồng đếm lamen phải đem rửa lau khô Tính kết Số lượng tế bào mL mẫu dịch tính công thức: Số tế bào/ mL = (a*4000*103*c)/b Trong đó: a – số tế bào ô lớn b – số ô ô lớn 103 – chuyển mm3 mL (1000 mm3 = 1ml) c – độ pha loãng (100 lần) Nhuộm Gram Nguồn: Cao Ngọc Điệp et al (2002) Các dòng phân lập nuôi ủ sau 48 30oC cố định thực nhuộm Gram Quy trình nhuộm Gram - Lấy sinh khối môi trường thạch MRS, cho vài giọt nước vô trùng miếng lam vô trùng Dùng que cấy trải dịch mẫu, làm khô tự nhiên hơ nhẹ miếng lam cách đưa miếng lam qua lại đầu lửa (khoảng - lần) - Nhỏ khoảng - giọt crystal violet lên dịch mẫu khô, để yên phút, rửa nước, để khô tự nhiên Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013 Trường Đại học Cần Thơ - Tiếp tục, nhỏ - giọt dung dịch Iod vào dung dịch mẫu, để yên khoảng phút, rửa nước, để khô tự nhiên - Nhỏ dung dịch khử màu (ethanol aceton theo tỷ lệ 1:1) giọt dung môi màu, rửa bẳng nước, để khô tự nhiên - Nhỏ khoảng - giọt Fushin, để yên phút, rửa nước, để khô tự nhiên - Xem mẫu sau nhuộm kính hiển vi vật kính X100 Kết quả: Vi khuẩn Gram (–): bắt màu hồng (fushin) Vi khuẩn Gram (+): bắt màu tím xanh (violet - iod) Vi khuẩn lactic Gram dương xác định vi khuẩn bắt màu phức violet – iod Thử nghiệm catalase Quy trình - Lấy sinh khối tâm khuẩn lạc môi trường thạch MRS sau 24 - 48 ủ Chuyển sinh khối lên miếng lam, nhỏ lên sinh khối giọt H2O2 3% (dùng ống nhỏ giọt hay pippette) - Quan sát hình thành bọt khí ghi nhận kết Kết quả: Dương tính: Có hình thành bọt khí (O2) Âm tính: không hình thành bọt khí Vi khuẩn lactic xác định vi khuẩn có catalase âm tính Thử nghiệm oxidase Quy trình - Thuốc thử oxydase công ty Nam Khoa Biotek sử dụng thí nghiệm - Đặt sản phẩm giấy lọc có tẩm sẵn thuốc thử lên miếng lam vô trùng, nhỏ giọt nước cất lên vị trí đặt giấy lọc cho vừa thấm ướt giấy - Dùng que cấy, lấy sinh khối vi khuẩn sau 18 - 24 ủ, đặt lên giấy lọc thấm nước trước đó, Quan sát phản ứng đến phút Kết quả: Dương tính: Giấy lọc đổi màu xanh dương đậm Âm tính: Giấy lọc không đổi màu Vi khuẩn lactic xác định dòng phân lập có kết oxydase âm tính Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013 Trường Đại học Cần Thơ Phân giải CaCO3 Những dòng phân lập cấy chuyển môi trường MRS agar có bổ sung 1,5% CaCO3 Vi khuẩn lactic có khả sinh acid lactic phân giải CaCO3 nên tạo vùng sáng quanh khuẩn lạc Sau ủ chọn dòng vi khuẩn có khả tạo vùng sáng quanh khuẩn lạc Ly trích DNA vi khuẩn * Phương pháp trích nhanh (Phòng CNSH Phân Tử - ĐHCT): - Lấy khuẩn lạc cho vào eppendorf - Nghiền ủ với mL lysine buffer 10 phút - Ly tâm 14000 v/p phút, chuyển phần qua tuýp - Thêm 1,5 mL ethanol 95%, ly tâm 12000 v/p phút - Bỏ phần dung dịch, rửa cặn lần mL ethanol 70% (đảo ngược tuýp để hòa tan) - Ly tâm 12000 v/p phút - Gõ nhẹ miệng ống giấy thấm, sấy khô 2-3 phút - Hòa tan DNA 100-150 µL TE Môi trường sử dụng 7.1 Môi trường MRS (de Man, Rogosa, Sharpe) Thành phần (trong lit) g Peptone 10,0 Beef extract 8,0 Yeast extract 4,0 D-Glucose 20,0 Tween 80 1,0 mL K2HPO4 2,0 Sodium acetate 3H2O 5,0 Triammonium citrate 2,0 Magnesium sulphate 7H2O 0,2 Manganese sulphate 4H2O 0,05 Agar 15,0 pH 6,2 ± 0,2 25°C Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013 Trường Đại học Cần Thơ 7.2 Môi trường PCA (Plate Count Agar) Thành phần (trong lit) g Peptone từ casein 5,0 Yeast extract 2,5 D-Glucose 1,0 Agar 14,0 pH 7,0 ± 0,2 25°C 7.3 Môi trường SDA (Sabouraud Dextrose agar) Thành phần (trong lit) g Peptone 10,0 Glucose 40,0 Agar 15,0 pH 5,6 ± 0,2 25°C 7.4 Môi trường MEA (Malt Extract Agar) Thành phần (trong lit) g Malt extract 30,0 Peptone 5,0 Agar 15,0 pH 5,4 ± 0,2 25°C Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC HÌNH THÁI KHUẨN LẠC VÀ TẾ BÀO VI KHUẨN ACID LACTIC STT Dòng VK V11B V13A V21B V31B O22A Hình thái khuẩn lạc Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Hình thái tế bào Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013 O32A O33A P21B P31B 10 P32B 11 P41A Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Trường Đại học Cần Thơ Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013 12 R11B 13 R13A 14 R14B 15 R22B 16 R33B 17 K21A Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Trường Đại học Cần Thơ Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013 18 K32A 19 K34B Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Trường Đại học Cần Thơ Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ DNA CỦA VI KHUẨN Kết giải trình tự gene 16S rDNA dòng vi khuẩn P32B AATTGCGAGGCAGCTATCTGCAGTCGACGACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACAT TTGAGTGAGAGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCT GGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCG GCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAA TGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTA CGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGT GAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAG GTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGG TGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGA AAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGT GGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTG TCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAG TCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGC ATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCG CACAAGCGGTGGAGCATGTGGTT Kết giải trình tự gene 16S rDNA dòng vi khuẩn V13A TCCCCCGTCTCCTTGAGGGGGCGCGGGGGTCCTATCTGCAGTCGACGAACTCTGGTATTGATTGGT GCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGAGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCA GAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCG AGCTTGAAAGATGGCTTTGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGG TAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGA GACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGAT GGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACAT ATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAG CAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGC GGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACT TGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAAC ACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAA CAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCC C Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013 Trường Đại học Cần Thơ Kết giải trình tự gene 16S rDNA dòng vi khuẩn P41A ATCAGCGGAGCTATAATGCAGTCGAACGAACTTCCGTTAATTGATTATGACGTACTTGTACTGATT GAGATTTGTGAAGAGTGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGAAAAGCCCAGAAGTAGGGG ATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGTATAACAGAGAAAACCGCATGGTTTTCTTTTAAAAGA TGGCTCTGCTATCACTTCTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACC AAGGCAGTGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAG ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCG CGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACGTGGGTAAGAGTAA CTGTTTACCCAGTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAA TACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTC TAATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAG AGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAA GGCGGCTGTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATA CCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGATTACTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCA GCTAACGCATTAAGTAATCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAAGAATTGACG GGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCT TGACATCTTCTGACAGTCTAAGAGATTAGAGGTTCCCCTTTCGGGGGACAGAATGACAAGGTGGGT GCAATTGGGATTGGTCGGTTCAGCATTCGATGGTCGCTGCAGCAATTGCATCTGGCGGGCCTTA Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC SỐ LIỆU PHÂN TÍCH THỐNG KÊ Kết phân tích thống kê số pH ANOVA Table for pH by Mau VT Source Sum of Squares Between groups 2.39637 Within groups 0.0664667 Total (Corr.) 2.46284 Df 10 14 Mean Square 0.599093 0.00664667 F-Ratio 90.13 P-Value 0.0000 Multiple Range Tests for pH by Mau VT Method: 95.0 percent LSD Mau VT Count Mean XK 4.23333 TK 4.64667 CP 4.74 NT 5.18667 TO 5.35333 Homogeneous Groups X X X X X Kết phân tích thống kê lượng acid lactic ANOVA Table for acid by Mau VT Source Sum of Squares Between groups 4.43259 Within groups 0.0131625 Total (Corr.) 4.44575 Df 10 14 Mean Square 1.10815 0.00131625 F-Ratio 841.90 P-Value 0.0000 F-Ratio 841.90 P-Value 0.0000 Multiple Range Tests for acid by Mau VT Method: 95.0 percent LSD Mau VT Count Mean TO 1.11 NT 1.1475 CP 1.35 TK 2.085 XK 2.46 Homogeneous Groups X X X X X Kết phân tích thống kê độ Therner ANOVA Table for Do Therner by Mau VT Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 54723.3 13680.8 Within groups 162.5 10 16.25 Total (Corr.) 54885.8 14 Multiple Range Tests for Do Therner by Mau VT Method: 95.0 percent LSD Mau VT Count Mean TO 123.333 NT 127.5 CP 150.0 TK 231.667 XK 273.333 Homogeneous Groups X X X X X Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC SỐ LIỆU THÔ Kết đánh giá cảm quan Màu sắc Vị Mùi Độ dính Mốc Lần lặp 3 3 Nem Tu Kien - Lai Vung 1 0 2 2 2 2 2 Nem Thu Oanh - Cai Rang 2 2 2 2 2 2 Nem Co Phuc - Cai Rang 2 2 2 2 2 2 2 Nem Trang - Cai Rang 2 2 2 1 2 2 2 Nem cho Xuan Khanh 1 1 2 2 1 2 2 Kết pH chuẩn độ acid Mẫu TK TK TK TO TO TO CP CP CP NT NT NT XK XK XK Lần lặp 3 3 pH 4,64 4,6 4,7 5,31 5,38 5,37 4,76 4,73 4,73 5,1 5,23 5,23 4,2 4,4 4,1 NaOH (mL) 4,7 4,6 4,6 2,5 2,5 2,4 3,0 3,0 3,0 2,6 2,5 2,55 5,5 5,3 5,6 Kết đếm mật số vi sinh vật Vi khuẩn acid lactic Độ pha loãng 105 Tổng VSV hiếu khí 106 105 Nấm mốc 106 102 103 Đĩa lặp 2 2 2 Tư Kiên 130 208 25 16 302 246 37 32 17 14 Thu Oanh 112 139 30 22 217 233 16 24 20 12 Cô Phúc 115 196 15 36 242 219 35 14 14 11 5 Trang 312 201 24 62 311 334 117 92 64 77 10 12 Xuân Khánh 258 335 91 75 275 349 83 20 45 19 17 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013 Trường Đại học Cần Thơ Kết đo vùng kháng nấm mốc (d=mm) L41 -1 L41 -2 L41 -3 L42 -1 L42 -2 L42 -3 A11 -1 A11 -2 A11 -3 V11B 0 0 0 0 V13A 3 3 8 V21B 0 1 0 V31B 0 0 0 0 O22A 0 0 0 0 O32A 0 0 0 0 O33A 0 0 0 0 P21B 2 0 1 P31B 5 0 3 P32B 7 15 15 12 5 P41A 2 9 3 R11B 0 0 0 R13A 0 0 R14B 0 2 R22B 2 0 1 R33B 0 0 0 0 K21A 2 0 1 K32A 0 0 0 0 K34B 2 0 C21 -1 C21 -2 C21 -3 C32 -1 C32 -2 C32 -3 A24 -1 A24 -2 A24 -3 V11B 5 2 2 V13A 1 5 7 V21B 1 0 0 0 V31B 0 0 0 0 O22A 0 0 O32A 0 0 O33A 0 0 0 0 P21B 2 2 1 P31B 3 4 3 P32B 7 9 P41A 8 0 5 R11B 5 5 R13A 0 4 2 R14B 0 2 4 R22B 12 10 12 0 2 R33B 2 0 K21A 0 0 0 K32A 1 0 2 K34B 7 1 1 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013 Trường Đại học Cần Thơ T22 -1 T22 -2 T22 -3 T71 -1 T71 -2 T71 -3 X20 -1 X20 -2 X20 -3 V11B 5 12 15 14 0 V13A 10 10 10 13 12 2 V21B 0 2 0 V31B 0 12 15 15 0 O22A 0 12 10 12 0 O32A 2 10 0 O33A 0 0 P21B 13 13 10 0 P31B 15 12 13 0 P32B 9 12 14 14 P41A 12 10 10 10 7 3 R11B 11 10 11 5 1 R13A 3 0 0 0 R14B 2 15 10 15 2 R22B 14 14 11 0 R33B 0 12 11 11 0 K21A 2 12 10 13 2 K32A 1 0 K34B 8 0 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học [...]... tiêu phân lập vi khuẩn acid lactic từ sản phẩm nem chua, kiểm tra và tuyển chọn vi khuẩn acid lactic có khả năng kháng nấm mốc cao Để thực hiện mục tiêu này, đề tài được tiến hành với các nội dung sau: - Đánh giá sơ bộ nem chua với chỉ tiêu cảm quan, pH, lượng acid lactic, mật số vi khuẩn lactic, mật số nấm mốc, tổng vi sinh vật hiếu khí - Phân lập vi khuẩn acid lactic từ nem chua - Phân lập nấm mốc từ. .. khí, vi khuẩn lactic, nấm mốc Phân lập vi khuẩn acid lactic Phân lập nấm mốc Định danh sơ bộ Chuẩn bị dịch chủng nấm Tuyển chọn vi khuẩn kháng nấm Định danh dòng vi khuẩn có kết quả tốt Hình 5: Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 3.2.1 Thu thập mẫu Năm mẫu nem chua được thu thập từ chợ Xuân Khánh và các cơ sở sản xuất nem chua ở Cái Răng, bến xe Cần Thơ Mẫu sẽ được dùng để đánh giá cảm quan, phân tích lượng acid, ... từ nem chua - Kiểm tra tính kháng nấm mốc của vi khuẩn acid lactic được phân lập - Chọn lọc định danh những dòng vi khuẩn có khả năng kháng nấm mốc tốt Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về vi khuẩn acid lactic Vi khuẩn acid lactic (LAB, hay còn được gọi là vi khuẩn. .. đó: X: lượng acid lactic có trong 100 mL mẫu (g) N: số mL NaOH dùng chuẩn độ M: khối lượng mẫu (g) 0,009: là lượng acid lactic tương đương với 1 mL NaOH phản ứng 3.2.3 Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí, vi khuẩn acid lactic và nấm mốc a Mục đích: Khảo sát và đánh giá mật số tổng vi sinh vật hiếu khí, vi khuẩn acid lactic và nấm mốc trong các mẫu nem chua b Phương pháp: * Định lượng tổng vi sinh vật... acid lactic và các chất kháng vi sinh vật LAB được sử dụng trong lên men sản xuất sữa chua, phô mai, bơ, kem, xúc xích, rau cải muối chua, rượu, thịt lên men,… Khuẩn lạc của vi khuẩn acid lactic tròn nhỏ, trong bóng, màu trắng đục hoặc màu vàng kem; hoặc khuẩn lạc có đường kính to hơn, tròn nổi, trắng đục đặc biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid (Kandler và Weiss, 1986) Vi khuẩn acid lactic có khả. .. phân lập a Mục đích: Khảo sát và đánh giá khả năng kháng nấm của các dòng vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua b Phương pháp: * Chuẩn bị dịch chủng nấm mốc Các dòng thuần nấm mốc được cấy chuyển sang đĩa môi trường malt extract agar để tăng sinh ở nhiệt độ 25oC trong 5 - 7 ngày Tiến hành thu bào tử nấm mốc bằng dung dịch peptone tiệt trùng 0,2 % w/v Cho dung dịch peptone vào đĩa tăng sinh nấm mốc, ... 2.5 Vi khuẩn acid lactic với khả năng kháng nấm Vi khuẩn acid lactic có khả năng cạnh tranh với các vi sinh vật khác bằng cách tiết ra các chất ức chế hoặc kiểm soát môi trường sống bằng quá trình trao đổi chất của chúng Đã có nhiều nghiên cứu phân tích các hợp chất đó cũng như nguyên lý hoạt động của chúng Các chất chuyển hóa kháng vi sinh vật được chia thành hai nhóm chính: những hợp chất có phân. .. acid, chỉ số pH, phân lập vi khuẩn acid lactic và nấm mốc và mẫu sẽ được thu với trạng thái đồng đều từ các nguồn Tất cả mẫu thu về sẽ được mã hóa thành tên dòng vi sinh vật được phân lập 3.2.2 Phân tích chỉ tiêu cảm quan, chỉ số pH, định lượng acid lactic a Mục đích: Đánh giá chất lượng nem chua với chỉ tiêu cảm quan, chỉ số pH, lượng acid lactic Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 18 Vi n NC&PT Công nghệ... culmorum, và F sporotrichoides Các chất kháng nấm của vi khuẩn acid lactic có thể được phân nhóm thành các sản phẩm lên men, hợp chất giống protein, và các chất ức chế có phân tử lượng thấp Ngoài ra, trong nghiên cứu này cũng đề cập đến khả năng kháng nấm rất tốt của dòng vi khuẩn Lactobacillus plantarum MiLAB 14 tạo ra acid hydroxylated fatty (acid 3-Hydroxydecanoic, acid 3-hydroxydodecanoic, acid 3-... có hiệu quả cao với nấm mốc Rouse et al (2008) cũng từng khẳng định lại đặc điểm kháng nấm của vi khuẩn acid lactic với nấm mốc, và đưa ra kết quả dương tính cao trên nhiều loài Penicillium và Aspergillus nidulans Vách tế bào của một số loài vi khuẩn như Leuconostoc và Streptococcus được nghiên cứu và kết luận với khả năng bám dính các chất gây độc như acid amin Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 15 Vi n