BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CHỊU NHIỆT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY TOLUENE CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS TS.NGUYỄN HỮU HIỆP SINH VIÊN THỰC HIỆN VÕ NGỌC THẢO NGUYÊN MSSV:3082615 LỚP:CNSHTT K34 Cần Thơ, Tháng 05/2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS TS Nguyễn Hữu Hiệp Võ Ngọc Thảo Nguyên DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Qua trình thực luận văn, em học hỏi nhiều Lần đầu tiên, em trải nghiệm trình nghiên cứu khoa học thật đầy thú vị Cũng nhờ trình này, em hiểu quý trọng tình cảm, giúp đỡ người Em xin gởi lời cám ơn chân thành đến người Đầu tiên, em xin chân thành cám ơn toàn thể thầy cô thuộc Viện Nghiên cứu Phát triển Công Nghệ Sinh Học mang đến cho em chân trời tri thức, giúp đỡ em trình học tập nghiên cứu Em xin gởi lời tri ân sâu sắc đến thầy Nguyễn Hữu Hiệp, người vừa cố vấn học tập, quan tâm, giúp đỡ em suốt 05 năm đại học, vừa thầy hướng dẫn tận tụy Nhờ giúp đỡ tận tình thầy mà em hoàn thành luận văn Ngoài ra, em xin chân thành cám ơn anh, chị bạn thuộc phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật, phòng Sinh học Phân tử thực vật hỗ trợ em trình thực luận văn Cuối cùng, em xin gởi lời tri ân đến gia đình Nơi hạnh phúc an lành cho em Võ Ngọc Thảo Nguyên Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT TÓM LƢỢC Nền công nghiệp ngày phát triển giúp sống người ngày tốt Tuy nhiên, công nghiệp hóa không liền với bảo vệ mội trường dẫn tới ảnh hưởng tiêu cực lên Trái Đất sức khỏe người Nhiễm độc Toluene, loại dung môi hữu sử dụng phổ biến ngành công nghiệp sơn thuộc da, vấn đề nhà nghiên cứu khoa học quan tâm Mục tiêu đề tài phân lập tuyển chọn dòng vi khuẩn chịu nhiệt có khả phân hủy Toluene Mẫu đất thu 04 nguồn: mẫu dất gần Nhà máy thuộc da Tây Đô, Xí nghiệp nhựa Cần Thơ, hồ Xáng Thổi, ruộng lúa có nguy nhiễm độc Toluene cao địa bàn thành phố Cần Thơ tăng sinh khối vi khuẩn cách ủ với Toluene nồng độ 1% 10% 45oC hai pha khí pha lỏng sử dụng môi trường MSB (mineral salt basal) để phân lập Các dòng vi khuẩn có khả phát triển với Toluene nguồn carbon khả tạo enzyme protease, cellulase, amylase lipase giải trình tự chứng minh khả phân hủy phương pháp đếm mật số phát triển với Toluene nguồn carbon nồng độ 0%, 1%, 1,5%, 2% Từ 04 nguồn đất phân lập 09 dòng vi khuẩn Hầu hết dòng vi khuẩn có khả tổng hợp enzyme Ba dòng tuyển chọn T14, T38 T50 Kết giải trình tự so sánh BLAST cho biết dòng vi khuẩn có độ tương đồng cao với dòng vi khuẩn Bacillus licheniformis (T14), Bacillus subtilis (T38) Acinetobacter sp (T50) Dòng T38 (Bacillus subtlis) chọn để kiểm tra khả sử dụng Toluene nguồn carbon chứng minh phát triển nổng độ Toluene 1% 1,5% Từ khóa: Dung môi hữu cơ, nhiễm độc Toluene, phân lập, phân hủy, vi khuẩn Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT ii LỜI CẢM TẠ iii TÓM LƢỢC i MỤC LỤC ii DANH SÁCH HÌNH vii CHỮ VIẾT TẮT viii CHƢƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 2.1 Sơ lƣợc dung môi hữu 2.1.1 Định nghĩa 2.1.2 Phân loại 2.2 Độc tính dung môi hữu 2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng phân hủy dung môi hữu 2.3.1 Biện pháp xử lý sinh học gì? 2.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng phân hủy sinh học dung môi hữu 2.4 Cơ chế phân hủy dung môi hữu .10 2.4.1 Phân hủy hiếu khí 10 2.4.2 Phân hủy kỵ khí 11 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT 2.5 Tình hình nghiên cứu 12 2.5.1 Ngoài nước 12 2.5.2 Trong nước 13 CHƢƠNG .14 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu .14 3.1.1 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 14 3.1.2 Hóa chất 15 3.1.3 Vật liệu 16 3.1.4 Thời gian địa điểm thực đề tài 16 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .16 3.2.1 Chuẩn bị thí nghiệm 16 3.2.2 Phân lập vi khuẩn 17 3.2.3 Nghiên cứu số đặc tính sinh học vi khuẩn 17 3.2.4 Tuyển chọn dòng vi khuẩn có khả phân hủy Toluene 19 3.2.5 Khảo sát khả tạo số enzyme 19 3.2.6 Định danh vi khuẩn kỹ thuật sinh học phân tử 20 3.2.7 Thí nghiệm chứng minh khả phân hủy dung môi hữu 20 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Kết phân lập vi khuẩn 23 4.2 Một số đặc tính dòng vi khuẩn phân lập đƣợc 23 4.3 Kết tuyển chọn dòng vi khuẩn chịu nhiệt có khả phân hủy Toluene 26 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT 4.4 Kết khảo sát khả tạo số enzyme dòng vi khuẩn đƣợc phân lập 27 4.4.1.Khảo sát khả tạo enzyme protease ………………………………… 27 4.4.2 Khảo sát khả tạo enzyme lipase …………………………………… 28 4.4.3 Khảo sát khả tạo enzyme amylase………………………………… 29 4.4.4 Khảo sát khả tạo enzyme cellulase………………………………… 30 4.5 Kết giải trình tự .32 4.6 Thí nghiệm chứng minh khả phân hủy Toluene 35 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 5.1 Kết luận 36 5.2 Đề nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết Kết trả cứu BLAST dòng T14 Kết tra cứu BLAST dòng T38 Kết tra cứu BLAST dòng T50 Phụ lục 2: Kết Bảng 13: Kết thí nghiệm tuyển chọn vi khuẩn có khả phân hủy Toluene (OD 600nm) Bảng 14: Kết thí nghiệm khả nẳng tạo enzyme dòng vi khuẩn Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT Phụ lục 3: Kết thống kê Kết thống kê khả tạo enzyme protease Kết thống kê khả tạo enzyme lipase Kết thống kê khả tạo enzyme cellulase Kết thống kê khả tạo enzyme amylase Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1: Một số nhóm dung môi hữu thường gặp……………………………… …3 Bảng 2: Những chất ô nhiễm có tiềm áp dụng biện pháp xử lý sinh học .8 Bảng 3: Điều kiện môi trường ảnh hưởng đến phân hủy Bảng 4: Các nghiệm thức sử dụng thí nhiệm 21 Bảng 5: Nguồn gốc dòng vi khẩn phân lập 23 Bảng 6: Đặc điểm khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập .24 Bảng 7: Đặc điểm tế bào dòng vi khuẩn phân lập .24 Bảng 8: Khả tạo enzyme protease dòng vi khuẩn phân lập 28 Bảng 9: Khả tạo enzyme lipase dòng vi khuẩn phân lập 29 Bảng 10: Khả tạo enzyme amylase dòng vi khuẩn phân lập 29 Bảng 11: Khả tạo enzyme cellulase dòng vi khuẩn phân lập .30 Bảng 13: Mật số vi khuẩn dòng T38 35 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1: Nguyên tắc trình phân hủy hiếu khí hydrocarbon gắn với trình tăng trưởng 10 Hình 2: Nguyên tắc pha loãng.…………………………………………… … 22 Hình 3: Đặc điểm khuẩn lạc số dòng vi khuẩn sau ngày…………… ……25 Hình 4: Kết nhuộm gram số dòng vi khuẩn 26 Hình 5: Chỉ số đo OD dòng vi khuẩn ngày 0, ngày 02 ngày 04 27 Hình 6: Vòng sáng tạo môi trường CMC tinh bột số dòng vi khuẩn 31 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT GAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCA CGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCT GCAGCAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGA AACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTT AATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAA CCCTAGAGATAGGGCCTTCC Trình tự dòng T14 có độ tương đồng cao với dòng vi khuẩn Bacillus licheniformis mức 99% Bacillus licheniformis dòng vi khuẩn biết tới dòng vi khuẩn đầy tiềm phân hủy dung môi hữu lẫn dầu thô (Das Chandran, 2010; Reda Ashraf, 2010) Theo Das Chandran (2010), Bacillus licheniformis phân lập từ nước ô nhiễm phân hủy dầu thô Ngoài ra, Reda Ashraf (2010) có nghiên cứu cho thấy Bacillus licheniformis có tiềm cao phân hủy Toluene *Kết giải trình tự dòng T38 (784 nucleotide) TCACCGGGGAGCTAAATGCAGTCGAGCGGAAGAGGGAGCTTGCTCCC TGTATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAAGACGTGGGAAACCTGCCTGTAA GACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAA CCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTTTGCTATCTCTTTTAGATGGAC CCCCCGCGCATTTGCTAGTTGGGGAGGGAAAGGCTCCCCCAAGGAACGAT GCGGAGCCGACCTGAGAGGGGGATCGGCCCCACTGGGGGTGAGAAACCG GCCAGACTCCTACGGGGGGGAGCAGTGGGGAATCTTCCCCAATGGGCGAA AGTCTGACCGAGCGACCCCCCGTGGGTGATGAAAGGTTTTGGATCTTAAA GCTCTGTTGTTAGGGGAGAACAAATACCGTTCGAATAGGGCGGGACCTTG ACGGGACCCAACCAGAAAGCCCCGGCTAACTACCTGCCCACCACCCCGGG AATACGTAAGGGGGAAGGGTTTTCCGGAATTTTTGGGCGTAAAGGGCTCG CAGGGGGTTTTTTTAATTTGATGTGAAAACCCCCGGCTCCACCCGGGAGGG TCATTGGAAACTGGGGAACTTTAGTGGAAAAAAAGAAAGTGGAATTTCCC CTGTAGCGGTGAAATGGGTAAAGATGTGGAGGAACACCCGTGGCCAAAGG GACTTTTTGGGCTGTAACTGACACTGAAGAGCGAAAACGTGGGGAGCGAA CAGGATTTAATACCCTGGGTAT Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 33 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT Dòng T38 có độ tương đồng 89% với dòng Bacillus subtilis Mặc dù dòng Bacillus subtilis không sinh trưởng có có mặt loại dung môi hữu 10% (Abe et al., 1995), nghiên cứu gần Navacharoen Vangnai (2011) cho thấy Bacillus subtilis sử dụng Diethyl Phthalate nguồn carbon Theo Das Chandran (2010) dòng Bacillus subtilis có khả phân hủy dầu thô Vidhya Thatheyus (2013) Bacillus subtilis có khả phân hủy Dimethylformamide *Kết giải trình tự dòng T50 (957 nucleotide) CGGTGGGCCGGCCAAAAATGCAGTCGAGCGGGCGAGGTTGCTTCTGT TCTGAGCTAGCGGCGGAGGGTGAGTAATGAATAGGAATCTGCCTATTATG GGGGGAGGCATTCCTTAAGGGAAGCTAATACCACATACGTCCTACTGGAG AAAGCCAGGGCTCATTATGAACTTGCGCTAATAGATGACCCTTACTCAGAT TCCCTAGGTGGTGGGGTTAAGGGCTACCAAGGCGACTATCTGTAGCGGGT CTGAGAGGATGATCCGACAGGGTGGGACTGAAACACGGGCCAGACTCCTA CCGGAGGCTCCTACGGGGAATATTGGACAATGGGCGGAACCCTGATCCAA CCATGCCACGGGTGTGAAGAACGTCTTTTGGGTGTGAATTACTTTAAGAGA GGAGGAGGGTTACCTGAGAAATACCTGGGCTAAGTGGACGTTACCCACAA AATAACCACCGGCTAACTCTGTGCCAAACTCCGCGGTAATACAGAGGGTG CGAGCGTTAATCGGATTTACTGGGCGAAAAGCGCGCGTAGGTGGTTAATT AAGTCAAATCTTAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTTGGAACTG GTTGGAAACTGTATGGGAGAGGATGGTAGAATTCCAGGTGTAATTCCACA AATGCCTATAAAATTGGAAGAATTCCGAAGGAACACGCATGCCTCTGGCC TAATTCTGACCCTTAAGTGACACTGAATGGGGAGCACACAGGAATAAAAA CCGAGGAAATACATGGCGTAAACAATGCCTACTAGACGATTGCTGATTGG AACATGTAGTCCGCCCTCTAACGCTGATAAGTAAACCATCTGGACAGTACC GTGCGCAAGTACTAACTCAGACTGAAATGACAGGGGCTCGCACGAGCCCC GCACCATGTGGTTTAACATCGTATGTTTACGTCAAAACCACTGACGCTAGG AACTT Sau tra cứu BLAST, dòng T50 có độ tương đồng 85% với dòng vi khuẩn Acinetobacter sp Nhóm vi khuẩn Acinetobacter có tiềm việc phân hủy carbonhydrate xử lý tới 70% alkane mạch trung bình (Malatova, 2005) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 34 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT Walker et al (1976) phân lập dòng Acinetobacter từ đất nước ô nhiễm dầu Dòng vi khuẩn phân hủy lượng lớn hợp chất cycloalkanes hợp chất vòng thơm (Walker et al., 1975) 4.6 Thí nghiệm chứng minh khả phân hủy Toluene Để chứng minh khả phân hủy Toluene vi khuẩn, ta tiến hành thí nghiệm chứng minh theo phương pháp nhỏ giọt đếm số, theo dõi qua ngày 2, 4, Do thời gian có hạn nên dòng vi khuẩn T38 (Bacillus subtilis) chọn cho thí nghiệm Lý ta chọn dòng vi khuẩn Bacillus subtilis dòng vi khuẩn tiềm chứng minh có khả sử dụng diesel, n-decan naphthalene nguồn carbon (Al-Sharidah et al., 2000) Mật độ chủng vào nghiệm thức ngày 2.102 CFU/ml Qua ngày phát triển ta nhận thấy dòng T38 phát triển nồng độ Toluene 1% 1,5% Điều tương thích với kết thi nghiệm tuyển chọn phần trước Dòng T38 (Bảng 13), mật độ vi khuẩn tăng dần tới ngày 04 giảm sau ngày thứ Ở nghiệm thức (2%) vi khuẩn giảm dần phát triển ngày 04 ngày 06 Điều tương ứng với kết đo OD Như dòng T38 có khả sử dụng Toluene nguồn carbon nồng độ thấp từ 1% đến 1,5% Bảng 13: Bảng mật số vi khuẩn dòng T38 (CFU/ml) Nghiệm thức Nghiệm thức (0%) Nghiệm thức (1%) Nghiệm thức (1,5%) Nghiệm thức (2%) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Ngày Ngày 200 200 200 200 337 95 26 35 Ngày 5,3.107 1,93.108 Ngày 0 0 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ 04 mẫu đất có nguy nhiễm độc Toluene, 09 dòng vi khuẩn có khả chịu nhiệt sử dụng Toluene nguồn carbon phân lập Trong đó, 03 dòng với khả phân hủy trội có khả tạo enzyme protease, lipase, amylase, cellulase 09 dòng vi khuẩn tuyển chọn để giải trình tự gen 16S rRNA định danh ba dòng vi khuẩn Bacillus licheniformis (T14), Bacillus subtilis (T38), Acinetobacter sp (T50) Trong dòng T14 T50 có khả sử dụng Toluene nguồn carbon nồng độ 2% T38 nồng độ 1% 1,5% 5.2 Đề nghị Do thời gian kinh phí giới hạn nên thí nghiệm kiểm tra khả phân hủy Toluene chưa hoàn chỉnh Trong tương lai, nghiên cứu khả phân hủy Toluene dòng vi khuẩn môi trường ô nhiễm Toluene nên thực Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 36 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp 2002 Bài giảng thực tập vi sinh vật đại cương Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ Trần Thị Xuân Mai 2010 Giáo trình thực tập sinh học phân tử Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ Vũ Thành Công 2010 Phân lập số dòng vi khuẩn có khả kháng benzene.Luận văn tốt nghiệp Đại học chuyên ngành Công nghệ sinh học, Đại học Cần Thơ Tiếng Anh Abe, A., A Inoue, R Usami, K Moriya and K Horikoshi 1995 Degradation of polyaromatic hydrocarbons by organic solvent-tolerant bacteria from deep sea Bioscience Biotechnology Biochemistry, 59: 1154-1156 Al-Sharidah, A., A Richardt, J R Golecki, R Dierstein and M H Tadros 2000 Isolation and characterization of two hydrocarbon-degarding Bacillus subtilis strains from oil contaminated soil of Kuwait Microbiological Research, 155: 157-164 Atlas, R M 1981 Microbial degradation of petroleum hydrocarbons: an environmental perspective Microbiological Reviews, 45: 180-209 Baker, E.L 1988 Organic solvent neurotoxicity Public Health, 9: 223-232 Boll, M and J Heider 2010 Anaerobic degradation of hydrocarbons: Mechanisms of C-H bond activation in the absence of oxygen In Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology, ed K.N Timmis, Berlin- Heidelberg: Springer- Verlag, pp 1011-1024 Burlage, R.S., S.W Hooper, and G.S Sayler 1989 The TOL (pWW0) catabolic plasmid Appl Environ Microbiol 55:1323–1328 Das, N and P Chandran 2010 Microbial degradation of petroleum hydrocarbon contaminants: An overview Biotechnology Research International, 2011: 1-10 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 37 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT Faizal, I., K Dozen, C.S Hong, A Kuroda, N Takiguchi, H Ohtake, K Takeda, H Tsunekawa and J Kato 2005 Isolation and characterization of solvent-tolerant Pseudomonas putida strain T-57, and its application to biotransformation of toluene to cresol in a two-phase (organicaqueous) system Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 32: 542-547 Fritsche, W and M Hofrichter 2008 Aerobic Degradation by Microorganisms In Biotechnology: Environmental Processes II, Volume 11b, Second Edition, ed H.J Rehm and G Reed Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, Germany Goldman, S.M., P.J Quinlan, G.W Ross, C Marras, C Meng, G.S Bhudhikanok, K Comyns, M Korell, A.R Chade, M Kasten, B Priestley, K.L Chou, H.H Fernandez, F Cambi, J.W Langston and C.M Tanner 2012 Solventt exposures and Parkinson disease risk in twins Ann Neurol.,71: 776-784 Hazen, T C 2010 13 In Situ: Groundwater Bioremediation In “Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology”, ed Timmis, K N., Berlin Heideberg Springer- Verlag Berlin, pp 2683-2594 Heider, J., A.M Spormann and H.R Beller, F Widdel 1999 Anaerobic bacterial metabolism of hydrocarbon Federation of European Microbiology Reviews, 22: 459-473 Hussein, E I 2006 Investigation into the mechanisms which permit the high-rate, degradation of PAHS and related petroleum hydrocarbon in sequencing batch reactors by attached cells in a controlled mixed bacterial community In “Biology Dissertations”, Georgia State University Inoue, Akira and K Horikoshi 1989 A Pseudomonas thrives in high concentrations of toluene Nature, 338: 264- 266 Lau, P.K.W and A Koenig 2001 Management, disposal and recycling of waste industrial organic solvents in Hong Kong Chemosphere, 44: 9-15 Leahy, J.G., K.D Tracy and M.H Eley 2003 Degradation of mixtures of aromatic and chloroaliphatic hydrocarbons by aromatic hydrocarbon-degrading bacteria Federation of European Microbiology Ecology, 43: 271-276 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 38 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT Malatova, K 2005 Isolation and characterization of hydrocarbon degrading bacteria from environmental habitats in Western New York State Marchant, R and I M Banat 2010 The genus geobacillus and hydrocarbon utilization In Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology, ed Timmis, K N Verlag Berlin Heidelberg, Springer- Verlag Berlin, pp 1887-1894 Matsumoto, M., J.A.M De bont and S Isken 2002 Isolation and characterization of the solvent-tolerant Bacillus cereus strain R1 Journal of Bioscience and Bioengineering, 94: 45-51 Moriya, K and K Horikoshi 1993 Isolation of a Benzene-tolerant bacterium and its hydrocarbon degradation Journal of Fermentation and Bioengineering, 76: 168173 Na, Kyung-su, Akio Kuroda, Noboru Takiguchi, Tsukasa Ikeda, Hisao Ohtake and Junichi Kato 2005 Isolation and characterization of benzene-tolerant Rhodococcus opacus strain Journal of Bioscience and Bioengineering, 99: 378382 Navacharoen, A and A S Vangnai 2011 Biodegradation of diethyl phthalate by an organic-solvent-tolerant Bacillus subtilis strain 3C3 and effect of phthalate ester coexistence International Biodeterioration and Biodegradation, 65: 818-826 Ogino, H., K Miyamoto and, H Ishikawa 1994 Organic solvent-tolerant bacterium which secretes organic solvent-stable lipolytic enzymes Applied Environment Microbial, 60: 3884-3886 Ogino, H., K Yasui, T Shiotani, T Ishihara and H Ishikawa 1995 Organic solventtolerant bacterium which secretes an organic solvent-stable proteolytic enzyme Applied Environment and Microbial, 60: 4258-4262 Ogino, H., T Uchiho, J Yokoo, R Kobayashi, R , Ichise and H Ishikawa 2001 Role of intermolecular disulfide bonds of the organic solvent-stable PST-01 Protease in its organic solvent stability Applied Environment Microbiology, 67: 942-947 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 39 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT Rahman, R N Z R A, N H A Kamarudin, J Yumus, A B Salleh and M Basri 2010 Expression of an organic solvent stable lipase from Staphylococcus epidermidis AT2 International Journal of Molecula Sciences, 11: 3195-3208 Reda, A B and T A Ashraf 2010 Optimization of bacterial biodegradation of Toluene and Phenol under different nutritional and environmental conditions Journal of Applied Sciences Research, 6: 1086-1095 Sardessai, Y and S Bhosle 2003 Isolation of an organic-solvent-tolerant cholesterol transforming Bacillus species, BC1, form coastal sediment Biotechnology, 5: 116-118 Seo, J., Y Keum and Q X Li 2009 Bacterial degradation of aromatic compounds International Journal of Environmental Research and Public Health, 6: 278-309 Shen, Y., L G Stehmeier and G Voordouw 1998 Identification of Hydrocarbondegrading bacteria in soil by reverse sample genome probing Applied and Environmental Microbiology, 64: 637-645 Sikkema, J J A de Bont and B Poolman 1995 Mechanisms of membrane toxicity of hydrocarbons Microbiology and Molecular Biology Reviews, 59: 201-222 Thenmozhi, R., D Praveenkumar, E Priya, A Nagasathy and N Thajuddin 2012 Evaluation of aromatic and polycyclic hydrocarbon degrading abilities of selected bacterial isolates Journal of Microbiology and Biotechnology Research 2: 445-449 Trivedi, N., V Gupta, M Kumar, P Kumari, CR Reddy and B Jha 2011 Solvent tolerant marine bacterium Bacillus quimaris secrecting organic solvent stable alkaline cellulase Chemosphere, 83: 706-712 Tyson, M 1992 In Practical Guidelines for the Safe Use of Organic Solvent Wellingtton-New Zealand: Ocupational Safety and Health Searvice- Departtment of Labour, pp Vidali, M 2001 Bioremediation An overview Pure Application chemistry, 73: 11631172 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 40 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT Vidhya, R and A J Thatheyus 2013 Biodegradation of Dimethylformamide using Bacillus subtilis American Journal of Microbiological Research, 1: 10-15 Walker, J.D., R R Colwell, and L Petrakis 1975 Evaluation of petroleum-degrading potential of bacteria from water and sediment Applied Microbiology, 30:10361039 Walker, J.D., R R Colwell, and L Petrakis 1976 Biodegradation of petroleum by Chesapeake Bay sediment bacteria Canada Journal of Microbiology, 22:423428 Zeyaullah, M., A Mohammed, I Badrul, S.A Azza, P Sultan , A Mohamed and A Arif 2009 Bioremediation: A tool for environmental cleaning African Journal of Microbiology Research, 3: 310-314 Trang web http://tnmtphutho.gov.vn/index.php/vi/news/Moi-truong/Cac-dung-moi-huu-co-vasuc-khoe-con-nguoi-325/ (ngày 10/01/2013) http://www.cdc.gov/niosh/topics/organsolv/ (ngày 10/01/2013) http://www.cdc.gov/niosh/docs/87-104/default.html#WHO 1985 (ngày 10/01/2013) http://aquaticpath.umd.edu/appliedtox/organics.pdf (ngày 11/01/2013) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 41 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết Kết trả cứu BLAST dòng T14 Kết tra cứu BLAST dòng T38 Kết tra cứu BLAST dòng T50 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT Phụ lục 2: Kết Bảng 13: Kết thí nghiệm tuyển chọn vi khuẩn có khả phân hủy Toluene (OD 600nm) Dòng T3 (0) Ngày 0,1075 Ngày 0,0616 Ngày 0,0426 T3 (1) 0,0646 0,0623 0,0426 T3 (1.5) 0,0673 0,0563 0,044 T3 (2) 0,059 0,0606 0,0486 T4 (0) 0,1035 0,075 0,053 T4 (1) 0,0823 0,061 0,053 T4 (1.5) 0,0813 0,0656 0,059 T4 (2) 0,09 0,059 0,0526 T9 (0) 0,089 0,063 0,07 T9 (1) 0,064 0,048 0,0613 T9 (1.5) 0,0753 0,0613 0,058 T9 (2) 0,0913 0,0476 0,0673 T12 (0) 0,0793 0,0646 0,0613 T12 (1) 0,086 0,0646 0,0773 T12 (1.5) 0,0646 0,064 0,0613 T12 (2) 0,0593 0,0596 0,0746 T14 (0) 0,107 0,074 0,0623 T14 (1) 0,071 0,076 0,098 T14 (1.5) 0,076 0,088 0,115 T14 (2) 0,0796 0,16 0,0916 T34 (0) 0,0805 0,06 0,1025 T34 (1) 0,081 0,0596 0,076 T34 (1.5) 0,0806 0,0575 0,0643 T34 (2) 0,0983 0,0566 0,061 T38 (0) 0,0905 0,0713 0,0523 T38 (1) 0,0823 0,0926 0,1226 T38 (1.5) 0,0766 0,0866 0,0796 T38 (2) 0,0756 0,0636 0,0673 T50 (0) 0,0925 0,0766 0,0656 T50 (1) 0,0566 0,0596 0,0716 T50 (1.5) 0,0773 0,0593 0,0803 T50 (2) 0,0723 0,1173 0,107 T51 (0) 0,093 0,0433 0,0693 T51 (1) 0,062 0,063 0,08 0,0563 0,063 0,0863 0,063 0,071 0,0746 T51 (1.5) T51 (2) *Ghi chú: (0), (1), (1,5), (2): nồng độ Toluene 0%, 1%; 1,5% 2% Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 14: Kết thí nghiệm khả nẳng tạo enzyme dòng vi khuẩn Số lần lặp Enzyme amylase 0,5 Enzyme protease 0,5 cellulase 1,5 Lipase 0,168 T3 0,4 0,4 1,3 0,166 T3 0,6 0,6 1,7 0,17 T4 2,8 2,4 0,064 T4 2,7 2,3 0,065 T4 2,9 2,5 0,063 T9 0,2 1,2 0,9 0,143 T9 0,1 1,4 0,8 0,14 T9 0,3 1 0,146 T12 1,6 2,5 0,042 T12 1,3 2,4 0,046 T12 1,9 2,6 0,038 T14 1,2 1,3 0,9 0,256 T14 1,1 1,5 0,7 0,25 T14 1,3 1,1 1,1 0,062 T34 0,6 0,3 0,8 0,135 T34 0,5 0,4 0,6 0,137 T34 0,7 0,2 0,133 T38 1,8 0,4 0,28 T38 1,6 0,5 0,27 T38 0,3 0,273 T50 0,9 1,1 1,95 T50 1,1 1,3 1,93 T50 0,7 0,9 1,97 T51 0,6 1,4 0,6 0,153 T51 0,5 1,6 0,5 0,15 T51 0,7 1,2 0,7 0,156 Dòng T3 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT Phụ lục 3: Kết thống kê Kết thống kê khả tạo enzyme protease Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT Kết thống kê khả tạo enzyme lipase Kết thống kê khả tạo enzyme cellulase Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT Kết thống kê khả tạo enzyme amylase Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học [...]... có khả năng phân hủy dung môi hữu cơ với hiệu suất cao nhằm nâng cao hiệu quả của biện pháp xử lý sinh học Vi t Nam với những quần thể vi sinh vật phong phú sẽ là địa điểm đầy tiềm năng để có thể phân lập được những dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy Toluene với hiệu quả cao Do đó, đề tài Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy Toluene được đề xuất Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Vi n... dịch Iodine và đo đường kính vòng sáng xuất hiện quanh khuẩn lạc vi khuẩn 3.2.6 Định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử Căn cứ vào kết quả của thí nghiệm tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy dung môi hữu cơ và các kiểm tra sinh hóa để chọn ra 03 dòng vi khuẩn có tiềm năng cao 03 dòng vi khuẩn này sẽ được gởi giải trình tự tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử của Vi n Nghiên cứu và Phát triển... QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Sau quá trình phân lập tách ròng, 9 dòng vi khuẩn chịu nhiệt có khả năng phân hủy được Toluene đã được phân lập từ 4 mẫu đất được lấy từ các 04 nguồn (Nhà máy thuộc da Tây Đô, xí nghiệp nhựa Cần Thơ, hồ Xáng Thổi, ruộng lúa) có nguy cơ nhiễm Toluene trên địa bàn thành phố Cần Thơ Trong đó, 07 dòng có nguồn gốc từ nhà máy thuộc da Tây Đô và 02 dòng có nguồn... đục OD(600 nm) để xác định dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy Toluene trong các ngày 0, 2, 4 3.2.5 Khảo sát khả năng tạo một số enzyme Sau khi tuyển chọn các dòng vi khuẩn, tiếp tục tiến hành khảo sát hoạt tính của một số enzyme như: protease, cellulase, amylase và lipase * Khảo sát khả năng tạo enzyme protease - Môi trường: MSB agar có skim milk (2%) - Cách tiến hành: Vi khuẩn nuôi trong môi trường LB... 3.2.4 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy Toluene Các dòng vi khuẩn sau khi phân lập từ các mẫu khác nhau được nhân giống và cấy chuyển ra các ống thạch nghiêng Tiến hành nuôi lắc từng dòng trên môi trường MSB lỏng chứa 0,01% yeast extract, ở 45oC, tốc độ lắc 120 vòng/phút với tỉ lệ 1% giống để tăng sinh vi khuẩn Chủng vi khuẩn đã nuôi lắc vào môi trường MSB có chứa Toluene ở các nồng độ... trường MSB agar Sau khi phân lập và tách ròng các dòng vi khuẩn trên môi trường MSB agar, tiến hành quan sát các khuẩn lạc rời và mô tả các đặc điểm: kích thước, hình dạng khuẩn lạc, độ nổi, màu sắc của khuẩn lạc… (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002) Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn Sau khi tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát sự chuyển động của vi khuẩn trong môi trường... chứng minh là có vai trò trong vi c điều khiển sự phân hủy của m- and p-toluate, m-and p-xylene (Burlage, 1989) Tiếp theo đó vào năm 1992, Aono et al cũng đã công bố về vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa cũng có khả năng kháng toluene Ogino et al (1994) đã nêu lên khả năng tạo ra lipolytic enzyme của Pseudomonas aeruginosa Ngoài P putida, P aeruginosa, Bacillus pumilus cũng có khả năng phân hủy dung môi... 5μl dung dịch vi khuẩn lên môi trường MSB agar có skim milk (2%) và ủ ở 45oC Đo đường kính vùng sáng quanh khuẩn lạc sau 1, 2, 3 ngày để xác định khả năng tổng hợp enzyme protease của vi khuẩn * Khảo sát khả năng tạo enzyme lipase - Môi trường: MSB lỏng có bổ sung dầu ăn (2%) - Cách tiến hành: chủng vi khuẩn vào môi trường MSB lỏng có bổ sung dầu ăn Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 19 Vi n NC&PT Công... học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn chịu nhiệt có khả năng phân hủy Toluene Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG 2 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc về dung môi hữu cơ 2.1.1 Định nghĩa Trung tâm ngăn ngừa và kiểm soát dịch bệnh (Centers for Disease Control... 2.4.2 Phân hủy kỵ khí Mặc dù, phân hủy hiếu khí được xem như là con đường chủ yếu trong phân hủy hydrocarbon Khả năng phân hủy hydrocarbon theo con đường kỵ khí của vi khuẩn cũng là một mảng nghiên cứu đầy hứa hẹn vì ngày càng nhiều hợp chất hydrocarbon được chứng minh là có thể được phân hủy bởi những vi sinh vật hiếu khí (Heider, 1999) Thay vì, sử dụng enzyme oxygenases như trong quá trình phân hủy ... học Vi t Nam với quần thể vi sinh vật phong phú địa điểm đầy tiềm để phân lập dòng vi khuẩn có khả phân hủy Toluene với hiệu cao Do đó, đề tài Phân lập tuyển chọn vi khuẩn có khả phân hủy Toluene ... mẫu vi khuẩn có màu tím xanh Crystal violet vi khuẩn Gram dương, có màu hồng đỏ Fushin vi khuẩn Gram âm 3.2.4 Tuyển chọn dòng vi khuẩn có khả phân hủy Toluene Các dòng vi khuẩn sau phân lập từ... 4: Kết nhuộm Gram số dòng vi khuẩn 4.3 Kết tuyển chọn dòng vi khuẩn chịu nhiệt có khả phân hủy Toluene Các dòng vi khuẩn phân lập theo dõi phát triển môi trường có chứa Toluene nguồn carbon với