BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP NẤM MEN TỰ NHIÊN LÊN MEN RƢỢU VANG XOÀI CÁT CHU CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS TS NGUYỄN VĂN THÀNH TRẦN THỊ KIM NGÂN MSSV: 3103966 LỚP: VSV K36 Cần Thơ, tháng 6/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP NẤM MEN TỰ NHIÊN LÊN MEN RƢỢU VANG XOÀI CÁT CHU CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS TS NGUYỄN VĂN THÀNH TRẦN THỊ KIM NGÂN MSSV: 3103966 LỚP: VSV K36 Cần Thơ, tháng 6/2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS TS Nguyễn Văn Thành Trần Thị Kim Ngân DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (Ký tên) LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Cần Thơ, Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ sinh học, tất quý Thầy Cô tận tình giảng dạy thời gian học tập vừa qua Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Văn Thành - người tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện tốt để thực đề tài Xin cảm ơn cố vấn học tập - cô Nguyễn Thị Pha - người giúp đỡ, động viên tôi gặp khó khăn học tập Chân thành cảm ơn anh Nguyễn Ngọc Thạnh, anh Huỳnh Xuân Phong, anh Phạm Hồng Quang - cán phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, anh chị cán phòng thí nghiệm Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học đặc biệt cô Nguyễn Thị Liên thầy Võ Văn Song Toàn hỗ trợ tận tình giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài Xin ghi ơn gia đình tất bạn bè lớp Vi sinh vật học khóa 36, chị Lê Thị Thảo anh chị cao học Công nghệ sinh học khóa 19 hỗ trợ giúp đỡ trình thực đề tài Kính chúc quý Thầy Cô nhiều sức khỏe có cống hiến quý báu cho nghiệp giáo dục đào tạo Xin chân thành cảm ơn! Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT TÓM TẮT Với mục đích tìm dòng nấm men chủng có đặc tính lên men rượu tối ưu từ dịch xoài góp phần làm đa đạng sản phẩm từ xoài Đề tài “Phân lập nấm men tự nhiên lên men rượu vang xoài Cát Chu” thực Kết nghiên cứu phân lập 27 dòng nấm men từ dịch ép xoài (lên men tự nhiên có bổ sung không bổ sung đường vỏ) Trong đó, dòng nấm men CKV1 phân lập từ dịch ép xoài lên men tự nhiên không bổ sung đường có bổ sung vỏ, mẫu thu Cần Thơ tuyển chọn, dòng thể hoạt lực lên men tốt thời gian làm đầy cột khí CO2 ống Durham sau giờ, cho hàm lượng ethanol cao (14,3% v/v) Rượu vang xoài lên men từ dòng nấm men tuyển chọn với dịch phối chế ban đầu 27oBrix, pH = mật số tế bào nấm men 105 tế bào/ml lên men nhiệt độ phòng (28 – 30oC) 11 ngày cho kết độ cồn cao (15,67% v/v) Từ khóa: lên men, nấm men, phân lập, rượu vang xoài, tuyển chọn Chuyên ngành Vi sinh vật học i Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ TÓM TẮT i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG v TỪ VIẾT TẮT vii CHƢƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dung thực CHƢƠNG LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Nguyên liệu xoài 2.1.1 Giới thiệu 2.1.2 Một số giống xoài có chất lượng cao nước ta 2.1.3 Thành phần hóa học giá trị dinh dưỡng 2.1.4 Độ chín xoài 2.1.5 Ý nghĩa kinh tế xoài 2.2 Enzyme pectinase 2.2.1 Giới thiệu 2.2.2 Sản xuất 2.2.3 Ứng dụng 2.3 Nấm men 10 2.3.1 Giới thiệu chung nấm men 10 2.3.2 Phân loại nấm men 10 2.3.3 Một số nấm men sản xuất rượu vang trái 15 2.3.4 Yêu cầu nấm men rượu vang 18 2.4 Khái quát rƣợu vang 19 Chuyên ngành Vi sinh vật học ii Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 2.4.1 Định nghĩa rượu vang 19 2.4.2 Thành phần hóa học rượu vang 19 2.5 Quá trình lên men 20 2.5.1 Khái quát trình lên men 20 2.5.2 Cơ chế trình lên men 20 2.5.3 Động học trình lên men 20 2.5.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men 22 2.6 Tình hình sản xuất rƣợu vang 24 2.6.1 Trên giới 24 2.6.2 Tại Việt Nam 25 2.6.3 Một số nghiên cứu rượu vang nước 26 CHƢƠNG PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 3.1 Phƣơng tiện – vật liệu 28 3.1.1 Địa điểm thời gian thí nghiệm 28 3.1.2 Nguyên vật liệu 28 3.1.3 Thiết bị dụng cụ 28 3.1.4 Hoá chất sử dụng 29 3.2 Nội dung bố trí thí nghiệm 30 3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 30 3.2.2 Phân lập tách ròng nấm men từ dịch xoài lên men tự nhiên 30 3.2.3 Tuyển chọn số dòng nấm men có hoạt lực lên men mạnh 32 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng mật số nấm men, độ Brix, pH ban đầu lên trình lên men rượu 34 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 4.1 Phân lập tách ròng nấm men từ dịch xoài lên men tự nhiên 37 4.1.1 Kết phân lập nấm men 37 4.1.2 Định danh sơ 40 4.2 Tuyển chọn số dòng nấm men có hoạt lực lên men mạnh 45 Chuyên ngành Vi sinh vật học iii Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 4.2.1 Kết chiều cao cột khí CO2 ống Durham 46 4.2.2 Khả lên men dòng nấm men phân lập 47 4.3 Khảo sát ảnh hƣởng mật số nấm men, độ Brix, pH ban đầu lên trình lên men rƣợu 48 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53 5.1 Kết luận 53 5.2 Đề nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC PHỤ LỤC CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỤ LỤC SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM PHỤ LỤC KẾT QUẢ THỐNG KÊ Chuyên ngành Vi sinh vật học iv Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1: Phân loại khoa học xoài Bảng 2: Thành phần giá trị dinh dưỡng 100 g xoài tươi Bảng 3: Giá trị dinh dưỡng loại xoài Cái Bè (Tiền Giang) Bảng 4: Hiệu xử lý nước dâu tây, mâm sôi enzyme 10 Bảng 5: Thành phần hóa học nấm men 13 Bảng 6: Thành phần hóa học rượu vang 19 Bảng 7: Sản xuất rượu vang giới năm 2007 24 Bảng 8: Tổng số nghiệm thức thí nghiệm 35 Bảng 9: Tổng hợp đặc điểm hình thái dòng nấm men phân lập .38 Bảng 10: Tổng hợp số dòng nấm men phân lập điều kiện nuôi cấy khác 39 Bảng 11: Tổng hợp dạng nấm men phân lập tỉnh Cần Thơ Đồng Tháp .40 Bảng 12: Khả lên men đường glucose saccharose 27 dòng nấm men phân lập 43 Bảng 13: Kết định danh sơ 27 dòng nấm men dựa đặc điểm hình thái đặc tính sinh lý .45 Bảng 14: Kết chiều cao cột khí CO2 ống Durham .46 Bảng 15: Độ cồn độ Brix sau lên men 15 dòng nấm men 47 Bảng 16: Độ cồn, độ Brix sau lên men dòng nấm men CKV1 49 Chuyên ngành Vi sinh vật học v Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình Các giống xoài trồng phổ biến Tiền Giang Đồng Tháp Hình Cơ chế trình lên men 21 Hình Độ chín xoài chọn để tiến hành thí nghiệm 28 Hình Sơ đồ quy trình tổng quát phân lập nấm men từ dịch xoài 30 Hình Sơ đồ thí nghiệm phân lập nấm men từ dịch xoài lên men 32 Hình Sơ đồ thí nghiệm tuyển chọn số dòng nấm men có hoạt lực lên men cao 33 Hình Sơ đồ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhân tố nồng độ nấm men, độ Brix, pH ban đầu lên trình lên men rượu 35 Hình 8: Hình dạng số dòng nấm men phân lập Cần Thơ Đồng Tháp 37 Hình Các nhóm hình dạng nấm men phân lập Cần Thơ Đồng Tháp .41 Hình 10 Tế bào nảy chồi số dòng nấm men 41 Hình 11 Khả đồng hóa urea môi trường Christensen 43 Hình 12 Độ cồn độ Brix sau lên men dòng nấm men 47 Hình 13 Hình dạng tế bào nấm men khuẩn lạc dòng CKV1 48 Hình 14 Độ cồn độ Brix sau lên men dòng nấm men CKV1 49 Hình 15 Biểu đồ mặt đáp ứng (a) biểu đồ đường mức (b) thể tương quan pH mật số nấm men ban đầu đến trình tạo ethanol 51 Hình 16 Quy trình lên men rượu vang xoài tốt đề nghị 54 Chuyên ngành Vi sinh vật học vi Viện NC&PT Công nghệ sinh học PHỤ LỤC PHỤ LỤC CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 1.1 Phƣơng pháp điều chỉnh độ Brix Để có độ Brix mong muốn, áp dụng công thức xác định độ khô cần cho dịch lên men bổ sung đường: b a+x 100 100 + x Tổng lượng đường bổ sung: c = md * x * 10 Trong đó: a: độ Brix ban đầu b: độ Brix cần đạt x: lượng đường bổ sung cho 100g dịch md: khối lượng dịch ban đầu Sau thêm đường, dùng đũa thuỷ tinh khuấy từ từ cho đường tan hoàn toàn, kiểm tra lại độ Brix chiết quang kế cầm tay 1.2 Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy nấm men (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004) Môi trường PGA có bổ sung khoáng: (khoai tây 20%-Glucose 2%-Agar 2%(NH4)2SO4 0,1%-nước cất vừa đủ 100%) Môi trường pha chế cách cắt 200g khoai tây gọt vỏ thành lát mỏng, đun sôi khoảng 20 phút nửa lít lọc Thêm 20g glucose, 20g agar, 1g (NH4)2SO4 nước vừa lít, khuấy cho agar tan ra, khử trùng nhiệt ướt 121oC 20 phút, song song tiến hành khử trùng đĩ petri Sau khử trùng để nguội môi trường khoảng 45oC cho vào đĩa petri thành lớp dày khoảng 1cm, để nguội cho agar đặc lại Đối với môi trường tăng sinh nấm men PYG, thành phần tương tự môi trường PGA, nhiên không bổ sung agar mà bổ sung thêm Yeast với mồng độ 2% 1.3 Phƣơng pháp đếm mật số nấm men (Nguyễn Xuân Thành, 2005) Chuẩn bị dịch nấm men: nuôi nâm men vừa phân lập môi trường PGA agar 30oC 24 Nấm men thị trường: hồi sinh nấm men khô nước cất, ủ 30 phút Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Lắc ống nghiệm chứa dịch nấm men, dùng ống hút hút giọt vào mặt kính, đậy kính lên lưới đếm Chú ý không để tạo thành bọt khí lưới đếm tràn dịch mẫu xuống rãnh Đặt buống đếm lên buồng kính hiển vi, sau tiến hành đếm tế bào ô lớn góc Trong ô lớn, đếm từ ô thứ đến ô thứ 16 Chỉ đếm tế bào nằm ô tế bào nằm cạnh liên tiếp chiều Ghi số lượng tế bào đếm ô lớn Đếm buồng đếm sau lấy giá trị trung bình Sau dùng xong buồng đếm, kính phải đem rửa lau khô Số lượng tế bào ml mẫu tính theo công thức: Số tế bào/ml = (a * 4000 * 103 * c)/b Trong đó: a: số tế bào trung bình ô lớn b: số ô ô lớn 103: chuyển mm3 ml c: độ pha loãng 100 lần (Nguyễn Xuân Thành, 2005) 1.4 Phƣơng pháp xác định độ cồn sinh phƣơng pháp chƣng cất (Nguyễn Đình Thƣởng Nguyễn Thanh Hằng, 2007) Cho 100 ml dung dịch sau lên men cho vào bình cầu hệ thống bình chưng cất cồn, tiến hành chưng cất lấy 100 ml cồn (chú ý đừng cồn bay hơi) Sau để dịch cất ổn định nhiệt độ, cho dịch chưng cất vào ống đong có đường kính gấp lần đường kính nơi to rượu kế tiến hành đo Cách tiến hành: Rửa rượu kế để khô - Đổ dịch định đo vào gần đầy ống đong - Thả từ từ rượu kế vào ống đong để yên cho rượu kế ổn định vị trí đứng yên cân - Nhìn tiếp xúc rượu kế bề mặt dung dịch đọc số đo rượu kế, lấy rượu kế - Lấy nhiệt kế đo nhiệt độ dung dịch - Tra bảng nhiệt độ độ rượu tương ứng để biết nồng độ ethanol Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT dung dich điều kiện chuẩn 1.5 Một số phƣơng pháp phân loại nấm men dựa tiêu hình thái hoá lí * Quan sát đặc tính nuôi cấy Quan sát khuẩn lạc môi trường thạch đĩa hay thạch nghiêng: sau có khuẩn lạc riêng biệt đĩa petri cần quan sát ghi đặc điểm: hình thái, kích thước, độ dày, có vòng tròn đồng tâm hay không, mặt khuẩn lạc nhẵn hay ướt, khô hay xù xì, màu sắc khuẩn lạc * Quan sát hình thái nấm men đo kích thƣớc Nấm men nuôi cấy ống nghiệm thạch nghiêng môi trường dịch thể Nuôi cấy 25-30oC ngày, sau lấy làm tiêu quan sát Muốn đo kích thước tế bào nấm men người ta thường sử dụng trắc vi thị kính Số tế bào nấm men đo không 20 Chú ý phải đo tế bào trưởng thành không đo chồi nảy sinh Tế bào nấm men có hình thái kích thước khác tuỳ loài, tuỳ chi Khi quan sát tế bào nấm men kính hiển vi phân biệt thành tế bào, tế bào chất, không bào hạt dị nhiễm Thành tế bào nấm men thẫm so với nguyên sinh chất, không bào thường có hình tròn, màu nhạt Các hạt dị nhiễm thường bắt ánh sáng mạnh hơn, chúng lắc lư nguyên sinh chất Kích thước tế bào nấm men khác nhiều tuỳ loài thuỳ chi, tuỳ điều kiện sinh trưởng thay đổi khoảng (1-5)x(5-30) µm hay có dài Kích thước tế bào loại nấm men thông thường vào khoảng 4-5 µm Tiêu giọt ép quan sát tế bào nấm men: nhỏ giọt nước cất lên phiến kính khô, dùng que cấy lấy tế bào cho vào giọt nước, trãi tế bào giọt nước, đậy lam kính lên giọt nước quan sát kính hiển vi * Quan sát trình nảy chồi tế bào nấm men Cấy vòng que cấy tế bào nấm men ngày tuổi vào bình nón loại 100 ml chứa 30 ml môi trường dịch thể (môi trường nước chiết mạch nha, môi trường cao nấm men-pepton-glucoza hay môi trường mạch nha-cao nấm men-glucoza-pepton) - Môi trường mạch nha-cao nấm men-glucoza-pepton: Cao mạch nha (malt extract) 3g Cao nấm men (yeast extract) 3g Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Glucoza 10g Pepton 5g Nước 1000 ml Nuôi cấy bình nón 25-28oC sau hai đến ba ngày tiến hành lấy mẫu quan sát Khi quan sát kính hiển vi cần phân biệt nấm men sinh sản theo cách nảy chồi hay phân cắt hai - Nếu nảy chồi chồi xuất đâu, hai đầu (hai cực) hay vị trí tế bào, số lượng chồi tế bào mẹ - Chồi sau phát triển có rời khỏi tế bào mẹ hay không - Dạng kích thước tế bào * Quan sát hình thành bào tử nấm men Cách tiến hành: nấm men nuôi cấy môi trường nghèo dinh dưỡng (môi trường thạch-nước) khoảng tuần Tiến hành nhuộm bào tử nấm men quan sát kính hiển vi Nếu quan sát không thấy bào tử tiếp tục giữ quan sát tuần liền Khi quan sát bào tử cần ý: nấm men có hình thành bào tử hay không, bào tử hình thành từ tiếp hợp tế bào sinh dưỡng, xảy tiếp hợp tế bào mẹ tế bào con, hình dạng bào tử, số bào tử * Xác định hoạt tính phân giải urea Môi trường Christensen: Pepton : 1g NaCl: 5g KH2PO4 : 2g Glucoze : 5g Thạch: 20g Nước: 1000ml Đun tan môi trường, thêm 6ml dung dịch đỏ phenol (phenol red) có nồng độ 0,2% cồn Khử trùng môi trường nồi hấp (115oC/15 phút) Đợi nguội đến 500C thêm 100 ml dung dịch urea (dung dịch 20% khử trùng riêng qua màng lọc) Phân vào ống nghiệm thủy tinh vô trùng, làm thạch nghiêng Sau cấy nấm men giữ 260C ngày Nếu nấm men có khả sinh ureaza để phân giải urea môi trường Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT chuyển màu đỏ xẫm Cũng tiến hành thí nghiệm với môi trường dịch thể * Sự đồng hoá đƣờng nấm men Nấm men cí khả đồng hoá nguồn đường cho sinh trưởng, tăng sinh khối nấm men chuyển đường thành rượu Nấm men đồng hoá đường theo nguyên tắc sau: Những loài nấm men không lên men đường glucose không lên men loại đường khác Không có nấm men lên men đồng thời đường maltose lactose Thông thường thử loại đường: glucose, saccarose, maltose, galactose, (http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/nammen01.htm ngày 10/9/2013) Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT PHỤ LỤC SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM 2.1 Độ Brix pH ban đầu Giá trị pH độ Brix ban đầu nguyên liệu phân lập thí nghiệm thể Bảng 15 Bảng 17: Bảng giá trị độ pH độ Brix ban đầu nguyên liệu Chỉ tiêu pH Brix Thí nghiệm phân lập Cần Thơ Đồng Tháp 4,20 4,86 12,3 18,0 Thí nghiệm khảo sát hoạt tính dòng nấm men 15,0 4,28 Thí nghiệm ảnh hƣởng nhân tố đến lên men 14,0 4,17 2.2 Thí nghiệm khảo sát hoạt tính dòng nấm men chủng Bảng 18: Kết độ Brix, pH độ cồn sau lên men thí nghiệm khảo sát hoạt tính dòng nấm men chủng Brix sau lên men Độ cồn Dòng nấm men Lần Lần TB Lần Lần TB Lần Lần TB ĐĐV2 7,50 7,50 7,50 4,18 4,13 4,16 13,33 13,20 13,27 ĐĐV4 7,50 7,50 7,50 4,27 4,27 4,27 13,64 13,64 13,64 ĐĐV5 7,50 7,00 7,25 4,27 4,26 4,27 13,33 14,08 13,71 ĐKV1 7,50 7,00 7,25 4,26 4,26 4,26 12,89 13,02 12,96 ĐKK1 8,00 8,00 8,00 4,21 4,21 4,21 12,51 12,31 12,41 ĐKK2 7,50 7,50 7,50 4,24 4,23 4,24 13,33 13,64 13,49 ĐKK3 7,80 7,80 7,80 4,28 4,27 4,28 12,31 12,89 12,60 ĐKK4 7,80 7,80 7,80 4,25 4,26 4,26 13,20 13,64 13,42 CKV1 7,50 7,50 7,50 4,25 4,28 4,27 14,08 14,52 14,30 CKV2 8,00 7,50 7,75 4,35 4,25 4,30 12,75 12,31 12,53 CKK2 7,50 7,80 7,65 4,21 4,26 4,24 12,31 12,51 12,41 CKK3 7,80 8,00 7,90 4,33 4,36 4,35 12,75 13,20 12,675 CKK4 7,80 8,00 7,90 4,24 4,23 4,24 12,89 13,02 12,995 CKK5 7,50 7,80 7,65 4,20 4,17 4,19 12,75 12,75 12,75 Mỹ 7,50 7,50 7,50 4,14 4,09 4,12 12,75 12,75 12,75 Chuyên ngành Vi sinh vật học pH sau lên men Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 2.3 Khảo sát nhân tố pH, độ Brix mật số nấm men ban đầu ảnh hƣởng đến trình lên men rƣợu vang xoài Bảng 19: Kết Brix, pH độ cồn sau lên men thí nghiệm khảo sát nhân tố pH, độ Brix mật số nấm men ban đầu ảnh hƣởng đến trình lên men rƣợu vang xoài Sau lên men NT pH-Brix-MS trƣớc lên men 3,5-19-103 Lần 6,00 Lần 6,50 TB 6,25 Lần 3,80 Lần 3,80 3,5-19-105 5,50 5,00 5,25 3,80 3,5-19-107 6,00 6,00 6,00 9,50 9,00 5 3,5-23-10 8,00 3,5-23-107 Brix Độ cồn pH TB Lần Lần 3,80 10,72 10,42 TB 10,57 3,80 3,80 11,16 13,20 12,18 4,00 4,00 4,00 11,77 11,16 11,47 9,25 3,80 3,80 3,80 12,04 12,04 12,04 7,50 7,75 3,80 3,80 3,80 13,07 14,22 13,64 8,50 8,00 8,25 4,00 4,00 4,00 12,20 13,35 12,78 3,5-27-103 14,0 15,0 14,5 3,90 3,80 3,85 12,04 13,35 12,70 12,5 13,0 12,75 3,90 3,80 3,85 13,07 14,22 13,64 3,5-27-10 13,0 13,0 13,0 4,00 3,90 3,95 13,79 12,92 13,35 10 4,0-19-103 6,00 5,50 12,5 4,00 4,00 4,00 12,04 12,04 12,04 11 4,0-19-105 5,50 5,50 5,50 5,00 4,10 4,55 13,07 14,22 13,64 12 5,00 5,50 5,25 4,30 4,20 4,25 12,75 12,04 12,40 13 4,0-23-10 8,00 8,00 8,00 3,90 4,00 3,95 13,07 14,22 13,64 14 4,0-23-105 6,00 6,00 6,00 4,00 4,00 4,00 14,36 14,36 14,36 15 4,0-23-107 7,00 7,00 7,00 4,20 4,10 4,15 14,22 14,22 14,22 16 7,50 8,00 7,75 3,80 3,90 3,85 14,52 14,08 14,30 17 4,0-27-10 7,00 7,00 7,00 4,00 4,00 4,00 15,67 15,67 15,67 18 4,0-27-107 14,0 12,0 13,0 4,20 4,00 4,10 12,92 13,35 13,14 19 4,5-19-103 7,00 8,00 7,50 4,20 4,20 4,20 10,53 10,40 10,46 20 5,50 5,00 5,25 4,30 4,20 4,25 13,20 13,20 13,20 21 4,5-19-10 6,00 8,50 7,25 4,40 4,40 4,40 11,77 11,16 11,47 22 4,5-23-103 6,00 8,50 7,25 4,20 4,10 4,15 12,75 12,04 12,40 23 4,5-23-105 6,00 7,00 6,50 4,10 4,10 4,10 14,52 14,08 14,30 24 8,00 7,00 7,50 4,30 4,30 4,30 13,07 14,22 13,64 25 4,5-27-10 13,0 12,5 12,75 4,10 4,10 4,10 12,04 13,35 12,70 26 4,5-27-105 8,00 8,00 8,00 4,20 4,20 4,20 13,99 13,99 13,99 27 4,5-27-107 12,0 12,0 12,0 4,30 4,30 4,30 13,70 13,70 13,70 3,5-23-10 3,5-27-10 4,0-19-10 4,0-27-10 4,5-19-10 4,5-23-10 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 2.4 Phân tích hồi quy dựa số liệu thu thập đƣợc chƣơng trình Statgraphics Centurion XV với độ xác 95% *Cố định mật số nấm men = 5, ta có phƣơng trình hồi quy: H = -97,364 + 2,92577*Z + 5,20091*5 + 33,8473*X - 0,0452043*Z*Z 0,322709*5*5 - 3,94511*X*X - 0,116558*Z*5 - 0,129646*Z*X - 0,33943*5*X + 0,0237731*Z*5*X (H: độ+ cồn, pH, +mật số- nấm men = 5, Z:- 3,9độ Brix) -97,364 2,92577*yX: + 5,20091*5 33,8473*X 0,0452043*y*y - 0,322709*5*5 -97,364 + 2,92577*y + 5,20091*5 + 33,8473*X - 0,0452043*y*y - 0,322709*5*5 - 3,9 27 16 25 Y Function 15 14 13 12 3,5 3,7 3,9 4,1 4,3 4,5 19 21 23 25 Y 27 23 21 19 X 3,5 3,7 3,9 4,1 4,3 4,5 Function 12,0 12,4 12,8 13,2 13,6 14,0 14,4 14,8 15,2 15,6 16,0 16,4 X a b Hình 17 Biểu đồ mặt đáp ứng (a) biểu đồ đƣờng mức (b) thể tƣơng quan pH độ Brix ban đầu đến trình tạo ethanol Từ phương trình hồi quy lấy đạo hàm theo biến số: H’(X) =-7,89022*X - 0,0107805*Z + 32,15015 H’(Y) = - 0,0107805*X - 0,0904086*Z + 2,34298 Cho H’(X) = H’(Y) = 0, giải hệ phương trình thu nghiệm: X = 4,0 Z = 25,4 Thay Z = 25,4 vào phương trình hồi quy, lấy đạo hàm theo X Y, ta được: H’(X) = -7,89022*X + 0,26440674*Y + 30,5542916 H’(Z) = 0,26440674*X -0,645418*Y + 2,2403368 Cho H’(X) = H’(Z) = 0, giải hệ phương trình ta X = Y = 5,1 Từ X, Y, Z tìm H = 15,31 Như vậy, độ cồn tính toán 15,31% v/v với độ Brix tối ưu 25,4; pH tối ưu mật số nấm men tối ưu 1,26x105 tế bào/ml *Cố định pH = 4, ta có phƣơng trình hồi quy: H = - 97,364 + 2,92577*Z + 5,20091*Y + 33,8473*4 - 0,0452043*Z*Z - Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 0,322709*Y*Y - 3,94511*4*4 - 0,116558*Z*Y - 0,129646*Z*4 - 0,33943*Y*4 + 0,0237731*Z*Y*4 (Với độ+ cồn, pH = 4, -Z0,0452043*X*X độ Brix, Y là- 3,9 mật số nấm men) -97,364 H + 2,92577*X 5,20091*Y + 33,8473*4 - 0,322709*Y*Y -97,364 + 2,92577*X + 5,20091*Y + 33,8473*4 - 0,0452043*X*X - 0,322709*Y*Y - 3,9 16 14 Y Function 15 13 12 11 19 21 23 25 X 27 Y 19 21 23 X 25 27 Function 11,0 11,5 12,0 12,5 13,0 13,5 14,0 14,5 15,0 15,5 16,0 16,5 a b Hình 18 Biểu đồ mặt đáp ứng (a) biểu đồ đƣờng mức (b) thể tƣơng quan mật số nấm men độ Brix ban đầu đến trình tạo ethanol Từ phương trình hồi quy lấy đạo hàm theo biến số: H’(X) = - 0,0904086*Z - 0,0214656*ZY + 2,407186 H’(Y) = - 0,0214656*Z - 0,645418*Y + 3,84319 Cho H’(X) = H’(Y) = 0, giải hệ phương trình thu nghiệm: Y = 5,1 Z = 25,4 Thay Y = 25,4 vào phương trình hồi quy, lấy đạo hàm theo X Z, ta được: H’(X) = - 7,89022*X + 0,26440674*Y + 30,5542916 H’(Z) = 0,26440674*X - 0,645418*Y + 2,2403368 Cho H’(X) = H’(Z) = 0, giải hệ phương trình ta X = 4,0 Y = 5,1 Từ X, Y, Z tìm H = 15,31 Như vậy, độ cồn tính toán 15,31% v/v với độ Brix tối ưu 25,4; pH tối ưu mật số nấm men tối ưu 1,26x105 tế bào/ml Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT PHỤ LỤC KẾT QUẢ THỐNG KÊ 3.1 Khảo sát hoạt tính 15 dòng nấm men Bảng 20: Bảng phân tích ANOVA độ cồn sau lên men thí nghiệm khảo sát hoạt tính 15 dòng nấm men ANOVA Table for Do Con by Nghiem Thuc Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 8,68417 14 0,620298 Within groups 0,8645 15 0,0576333 Total (Corr.) 9,54867 29 F-Ratio 10,76 P-Value 0,0000 Bảng 21: Bảng kiểm định LSD ảnh hƣởng 15 dòng nấm men đến độ cồn sau lên men Multiple Range Tests for Do Con by Nghiem Thuc Method: 95,0 percent LSD Nghiem Thuc Count Mean Homogeneous Groups X 11 12,41 X 12,41 XX 10 12,53 XX 12,6 XX 12 12,675 XX 14 12,75 XX 15 12,75 XX 13 12,955 XX 12,955 XX 13,265 XX 13,42 X 13,485 X 2 13,64 X 13,705 X 14,3 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Bảng 22: Bảng phân tích ANOVA độ Brix sau lên men thí nghiệm khảo sát hoạt tính 15 dòng nấm men ANOVA Table for Do Brix by Nghiem thuc Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 1,458 14 0,104143 Within groups 0,505 15 0,0336667 Total (Corr.) 1,963 29 F-Ratio 3,09 P-Value 0,0188 Bảng 23: Bảng kiểm định LSD ảnh hƣởng 15 dòng nấm men đến độ Brix sau lên men Multiple Range Tests for Do Brix by Nghiem thuc Method: 95,0 percent LSD Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups X 7,25 X 7,25 XX 15 7,5 XX 2 7,5 XX 7,5 XX 7,5 XX 7,5 XX 14 7,65 XX 11 7,65 XX 10 7,75 XX 7,8 XX 7,8 X 13 7,9 X 12 7,9 X 8,0 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 3.2 Khảo sát nhân tố độ Brix, pH mật số nấm men ban đầu đến trình lên men rƣợu vang Bảng 24: Bảng phân tích ANOVA độ cồn sau lên men ANOVA Table for DoConslm by Nghiem thuc Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 76,1887 26 2,93033 Within groups 9,35855 27 0,346613 Total (Corr.) 85,5472 53 F-Ratio 8,45 P-Value 0,0000 Bảng 25: Bảng kiểm định LSD ảnh hƣởng 54 nghiệm thức với dịch phối chế độ Brix, pH mật số nấm men ban đầu đến độ cồn rƣợu vang xoài mức 95% dòng nấm men phân lập CKV1 Multiple Range Tests for DoConslm by Nghiem thuc Method: 95,0 percent LSD Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups 19 10,465 X X 10,57 21 11,465 XX 11,465 XX XX 10 12,04 XX 12,04 XXX 2 12,18 XXX 12 12,395 XXX 22 12,395 XXX 12,695 XXX 25 12,695 XXX 12,775 XXXX 18 13,135 XXXXX 20 13,2 XXXX 13,355 XXX 24 13,645 XXX 11 13,645 XXX 13,645 XXX 13 13,645 XXX 13,645 XXX 27 13,7 XX 26 13,99 XX 15 14,22 XX 23 14,3 XX 16 14,3 X 14 14,36 X 17 15,67 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Bảng 26: Bảng phân tích ANOVA độ Brix sau lên men ANOVA Table for Brixslm by Nghiem thuc Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 409,231 26 15,7397 Within groups 11,625 27 0,430556 Total (Corr.) 420,856 53 F-Ratio 36,56 P-Value 0,0000 Bảng 27: Bảng kiểm định LSD ảnh hƣởng 54 nghiệm thức với dịch phối chế độ Brix, pH mật số nấm men ban đầu đến độ Brix rƣợu vang xoài mức 95% dòng nấm men phân lập CKV1 Multiple Range Tests for Brixslm by Nghiem thuc Method: 95,0 percent LSD Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups X 20 5,25 X 2 5,25 X 12 5,25 X 11 5,5 XX 10 5,75 XXX 6,0 XXX 14 6,0 XXXX 6,25 XXXXX 23 6,5 XXXXX 15 7,0 XXXXX 17 7,0 XXXX 22 7,25 XXXX 21 7,25 XXX 24 7,5 XXX 19 7,5 XX 7,75 XX 16 7,75 XX 26 8,0 XX 13 8,0 XX 8,25 X 9,25 X 27 12,0 X 25 12,75 X 12,75 X 18 13,0 X 13,0 X 14,5 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Bảng 28: Bảng phân tích ANOVA pH sau lên men ANOVA Table for pHslm by Nghiem thuc Source Sum of Squares Df Between groups 2,09593 26 Within groups 0,47 27 Total (Corr.) 2,56593 53 Mean Square 0,0806125 0,0174074 F-Ratio 4,63 P-Value 0,0001 Bảng 29: Bảng kiểm định LSD ảnh hƣởng 54 nghiệm thức với dịch phối chế độ Brix, pH mật số nấm men ban đầu đến pH rƣợu vang xoài mức 95% dòng nấm men phân lập CKV1 Multiple Range Tests for pHslm by Nghiem thuc Method: 95,0 percent LSD Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups X 2 3,8 X 3,8 X 3,8 X 3,8 XX 3,85 XX 16 3,85 XX 3,85 XXX 13 3,95 XXX 3,95 XXXX 14 4,0 XXXX 4,0 XXXX 10 4,0 XXXX 4,0 XXXX 17 4,0 XXXX 25 4,1 XXXX 23 4,1 XXXX 18 4,1 XXXX 15 4,15 XXXX 22 4,15 XXXX 26 4,2 XXXX 19 4,2 XXX 12 4,25 XXX 20 4,25 XXX 27 4,3 XXX 24 4,3 XX 21 4,4 X 11 4,55 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Bảng 30: Bảng phân tích ANOVA độ rƣợu (20oC) Analysis of Variance for DoConslm - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square MAIN EFFECTS A:Brix 32,4447 16,2223 B:Msnm 21,5015 10,7508 C:pH 14,1559 7,07796 INTERACTIONS AB 1,68801 0,422002 AC 0,342619 0,0856546 BC 2,53971 0,634927 ABC 3,51623 0,439528 RESIDUAL 9,35855 27 0,346613 TOTAL (CORRECTED) 85,5472 53 F-Ratio P-Value 46,80 31,02 20,42 0,0000 0,0000 0,0000 1,22 0,25 1,83 1,27 0,3265 0,9089 0,1518 0,3005 Bảng 31: Bảng kết xây dựng phƣơng trình hồi quy độ rƣợu (20oC) Multiple Regression - DoConslm (Lap lai) Dependent variable: DoConslm Standard Parameter Estimate Error CONSTANT -97,364 31,8005 Brix 2,92577 1,23349 Msnm 5,20091 4,89633 pH 33,8473 9,38754 Brix*Brix -0,0452043 0,0109183 Msnm*Msnm -0,322709 0,0431868 pH*pH -3,94511 0,780789 Brix*Msnm -0,116558 0,200201 Brix*pH -0,129646 0,258591 Msnm*pH -0,33943 1,1432 Brix*Msnm*pH 0,0237731 0,0471018 Analysis of Variance Source Sum of Squares Model 869,806 Residual 214,992 Total (Corr.) 1084,8 Df 10 43 53 T Statistic -3,06172 2,37194 1,0622 3,60555 -4,14023 -7,4724 -5,05272 -0,582208 -0,501354 -0,296912 0,504719 Mean Square 86,9806 4,99981 P-Value 0,0038 0,0222 0,2941 0,0008 0,0002 0,0000 0,0000 0,5635 0,6187 0,7680 0,6163 F-Ratio 17,40 P-Value 0,0000 R-squared = 80,1814 percent R-squared (adjusted for d.f.) = 75,5724 percent Standard Error of Est = 2,23603 Mean absolute error = 0,473596 Durbin-Watson statistic = 2,09188 (P=0,0713) Lag residual autocorrelation = -0,0494521 The StatAdvisor The output shows the results of fitting a multiple linear regression model to describe the relationship between DoConslm and 10 independent variables The equation of the fitted model is DoConslm = -97,364 + 2,92577*Brix + 5,20091*Msnm + 33,8473*pH - 0,0452043*Brix*Brix 0,322709*Msnm*Msnm - 3,94511*pH*pH - 0,116558*Brix*Msnm - 0,129646*Brix*pH 0,33943*Msnm*pH + 0,0237731*Brix*Msnm*pH Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ sinh học [...]... Bally, 2006) Bảng 3: Giá trị dinh dƣỡng các loại xoài tại Cái Bè (Tiền Giang) Thành phần/loại xoài Nƣớc (%) Đƣờng tổng (%) Đƣờng khử (%) Độ axit (%) Vitamin C (ppm) Xoài Cát Hoà Lộc Xoài Cát Chu Xoài Ghép Xoài Cát Hoà Lộc Xoài Cát Chu Xoài Ghép Xoài Cát Hoà Lộc Xoài Cát Chu Xoài Ghép Xoài Cát Hoà Lộc Xoài Cát Chu Xoài Ghép Xoài Cát Hoà Lộc Xoài Cát Chu Xoài Ghép Tháng 3 Tháng 4 Tháng 5 71,2 77,6 83,2... năng lên men mạnh thích hợp cho việc sản xuất rượu vang xoài 1.3 Nội dung thực hiện - Phân lập và tách ròng được dòng nấm men tự nhiên từ dịch ép của quả xoài - So sánh khả năng lên men của các dòng nấm men đã phân lập được từ dịch ép của quả xoài để xác định dòng nấm men tốt nhất sử dụng để lên men và so sánh với nấm men phòng thí nghiệm - Khảo sát các nhân tố ảnh hưởng (độ Brix, pH, mật số nấm men) ... nghiên cứu các loại nấm men tự nhiên trong quả xoài và tạo điều kiện thúc đẩy quá trình phát triển của nấm men là cần thiết Vì vậy, đề tài nghiên cứu Phân lập nấm men tự nhiên lên men rƣợu vang xoài Cát Chu được thực hiện Chuyên ngành Vi sinh vật học 1 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 1.2 Mục tiêu đề tài Nhằm tìm ra dòng nấm men tự nhiên ở hai tỉnh... đường dịch lên men, dòng nấm men Quá trình lên men bao gồm lên men chính và lên men phụ, thời gian lên men tính từ lúc cấy giống vào môi trường lên men Sự lên men thật Chuyên ngành Vi sinh vật học 23 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT sự kết thúc khi nấm men hết khả năng chuyển hoá đường thành rượu và CO2 Càng về cuối giai đoạn lên men, bọt khí sinh ra... 2.5 Quá trình lên men 2.5.1 Khái quát quá trình lên men Lên men là một quá trình trao đổi chất nhờ tác dụng của các enzyme tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học (được sinh ra từ sự trao đổi chất để duy trì sự sống của nấm men) Lên men rượu vang là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men, chúng sẽ chuyển hoá đường thành rượu ethylic và CO2 Các thời kỳ chính của quá trình lên men: Theo Nguyễn... quá trình lên men 2.5.4.1 Ảnh hƣởng của nhiệt độ Theo Bùi Ái (2003) và Casellas (2005), nhiệt độ đóng vai trò quan trọng đến hiệu suất lên men rượu Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng lớn nhất đến hoạt động trao đổi chất của nấm men Nấm men rất nhạy cảm với nhiệt độ cao, ở 36oC nấm men bắt đầu bị ức chế, tỉ lệ chết cao ở nấm men có thể dẫn đến kết quả lên men thấp, nhiệt độ tối ưu cho nấm men rượu vang là 25-28oC... men trong lên men rượu vang thuộc dòng nấm men Saccharomyces Chúng là các vi sinh vật kị khí không bắt buộc Môi trường đủ lượng nấm men phân huỷ đường dùng làm nguồn năng lượng cấu tạo tế bào và tăng sinh khối Trường hợp thiếu oxy hoặc không có oxy, nấm men sẽ chuyển từ hoạt động hô hấp sang lên men kị khí Khi đó sản phẩm trong môi trường lên men chủ yếu là rượu ethylic Trong quá trình lên men giai... cho ra từ 1-4 bào tử túi nhẵn tròn hoặc hình mũ Có khả năng lên men đường tùy vào từng giống khác nhau Hoạt hóa urease để đồng hóa urea tạo thành NH3 và CO2 2.3.3.9 Khóa phân loại nấm men Phân loại nấm men dựa vào một số đặc điểm về hình thái nấm men, sinh lý nấm men, sự nảy chồi của nấm men, sự hình thành bào tử của nấm men, khả năng lên men Chuyên ngành Vi sinh vật học 17 Viện NC&PT Công nghệ sinh... chevalieri Guilliermond Nấm men này được tách từ nước nho lên men tự nhiên, từ rượu vang mon được gây lên men nước dừa hoặc nước cọ Saccharomyces chevalieri thuần chủng lên men nước nho có thể tạo 16% rượu Nó thường lẫn với Saccharomyces cerevisiae 2.3.3.4 Saccharomyces oviformis Theo Lodder et al (1952) Saccharomyces beuanes Saccardo Được tách ra từ nước nho lên men, nhưng loại nấm men này ít hơn so với... làm thức ăn nuôi cấy nấm men Vì thế, môi trường dịch quả là môi trường lý tưởng để nấm men sinh trưởng và phát triển mật số để biến đường thành cồn ethylic, sản sinh vitamin và chất thơm cho rượu (Nguyễn Đức Lượng, 2004) 2.3.2 Phân loại nấm men Chủ yếu có hai lớp: Nấm men thật (Ascomyces) và Nấm men giả (Fungi imperfecti) Lớp nấm men thật (lớp Ascomyces-lớp nấm túi): phần lớn nấm men dùng trong công ... dòng nấm men chủng có đặc tính lên men rượu tối ưu từ dịch xoài góp phần làm đa đạng sản phẩm từ xoài Đề tài Phân lập nấm men tự nhiên lên men rượu vang xoài Cát Chu thực Kết nghiên cứu phân lập. .. Xoài Cát Hoà Lộc Xoài Cát Chu Xoài Ghép Xoài Cát Hoà Lộc Xoài Cát Chu Xoài Ghép Xoài Cát Hoà Lộc Xoài Cát Chu Xoài Ghép Xoài Cát Hoà Lộc Xoài Cát Chu Xoài Ghép Tháng Tháng Tháng 71,2 77,6 83,2... Hình Sơ đồ quy trình tổng quát phân lập nấm men từ dịch xoài 3.2.2 Phân lập tách ròng nấm men từ dịch xoài lên men tự nhiên a Mục đích: Phân lập, tách ròng chủng nấm men từ quần thể ban đầu đưa