B ộ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI / / ¡riiiiÌ!:L';' ^cJ ,1 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA MỘT VÀI CÂY CÓ TÁC DỤNG CHỮA BỆNH RĂNG MIỆNG (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Đ ợ c SỸ ĐẠI HỌC KHOẢ 1995- 2000) Người thực : Nguyễn Trường (ỉiang Ngưòi hướng dẫn : Tiến sỹ Giang Thị Sơn Tiến sỹ Ngô Mai Anh Noi thực : IỈỘ môn Hoá HỮƯ Thời gian thực : 1/3- 23/5/2000 Hà Nội, 5- 2000 * LỜI CÁM ƠN Em xin chân thành gỏi lời cảm ơn đến Tiến sỹ Giatìg Thi Sơn Tiến sỹ Ngô Mai Anh, người trực tiếp hướng dẫn em thực kììoá luận này, xin cảm ơn cô tận tình giúp đỡ em suốt thời gian qua, động viên em lúc khó khăn khúc mắc Em xin cảm ơn thầy cô giáo, cán nhân viên môn Hoá Hữu Tiến sỹ Cao Văn Thu giúp đỡ đ ể em hoàn thành tốt khoá luận tốt nghiệp Nhân em xin gởi lời cảm ơn đến tất cấc thầy cô giáo, cán nhân viên Trường Đợi học Dược Hà Nội giúp đỡ em írong suốt trình học tập trường Hà Nội, tháng năm 2000 Sinh viên Nguyễn Trường Giang MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn Mục ỉ ục Phần I ĐẶT VẤN ĐỀ Phần II TỔNG QUAN 2.1 Cây lốt 2.1.1 Mô tả 2.1.2 Phân bố địa lý 2.1.3 Thành phần hoá học 2.1.4 Tác dụng dược lý công đụng 2.2 Cây trầu không 2.2.1 Mô tả 2.2.2 Phân bố địa lý 2.2.3 Thành phần hoá học 2.2.4 Tác dụng dược lý cổng dụng 2.3 Một số thuốc có Lá lốt Trầu không Phần III THỰC NGHIỆM VÀ KÊT q u ả 3.1 Nguyên vật liệu phương pháp thực nghiệm 3.1.1 Nguyên vật liệu 3.1.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2 Kếl thực nghiệm nhận xét 3.2.1 Định tính thành phần hoá học Lá lốt 3.2.2 Định tính thành phần hoá học Trầu không 15 3.2.3 Định lượng tách Tanin Lá lốt Trầukhông 22 3.2.4 Thăm dò tác dụng kháng khuẩn dược liệu 23 Phần IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ x u ấ t 29 Tài liệu tham khảo 30 PHẦN I- ĐẶT VÂN ĐỂ Đất nước Việt Nam có nguồn tài nguyên dược liệu phong phú có Y học dân tộc phát triển lâu đời Từ hàng ngàn năm truớc người Việt Nam biết sử dụng cỏ, động vật xung quanh để làm thuốc có nghiên cứu Y dược lý đáng khâm phục Theo kinh nghiệm dân gian số nghiên cứu năm gần Lá lỐt(Piper lolot C.DC) Trầu không(Piper betle L.) thuốc có tác dụng chữa bệnh miệng tốt Những thuốc lại dễ kiếm sử dụng rộng rãi nhân dân với mục đích khác Chính lí mong muốn tìm hiểu thành phần hoá học tác dụng kháng khuẩn thuốc để phần lý giải tác dụng chúng điều trị bệnh lăng miệng, mục đích khoá luận tốt nghiệp Dược sỹ đại học “Nghỉcn cứu thành phần hoá học vài có tác dụng chữa bệnh miệng “ Trong thời gian thực khoá luận tốt nghiệp mong muốn hoàn thành mục tiêu sau: Định tính thành phẩn hoá học Lá lốt Trầu không Tìm cách tách thành phần hoá học có khả thành phần tạo nên tác đụng chữa bệnh miệng chúng Thăm dò khả kháng khuẩn dược liệu t PHẦN II- TỔNG QUAN < t 2.1 Cây Lá lối Tên khác : Tất bát, ana klùa táo Tên khoa học : Piper lolot C.DC Họ : Hổ tiêu (Piperaceae) 2.1.1 Mô tả[7, 16] Lá lốt thuộc loài thảo, thường cao 50-60cm, có cao tới mét, thân có lông, có ống tiết tuỷ Thân chia thành lừng đốt, đốt mang lá, cuống có bẹ ngắn Lá hình trứng rộng, phía cuống hình tim, đầu nhọn, soi lên có điểm Phiến rộng 8,5-9cm, dài 13cm Mặt nhẵn bóng có màu xanh (hẫm, mặt nhạt hon có lông mịn Ra hoa vào cuối mùa xuân, đẩu hè mùa thu, hoa mọc thành bông, hoa đài lcm Quả kép nhỏ dài chừng 1-1,5cm gồm nhiều noãn mang hạt 2.1.2 Phân bố địa /ý[7, 16] Cây Lá lốt mọc hoang trồng khắp nơi nước ta, In vùng đất ẩm ướt Ngoài phân bố số nước vùng Đông Nam Á Campuchia, Maỉaixia 2.1.3 Thành phần hoá học Các tài liệu nghiên cứu trước cho thây Lá ỉốt có chứa tinh dáu [1, 16], hợp chä't Flavonoid [11, 18], hợp chất Alcaloid: piperin piperidin [11, 18], Tanin [11, 18] 2.Ỉ.4 Tác dụng dược lý công dụng Theo Tuệ Tĩnh Đỗ Tát Lợi, Lá lốt sắc uống có vị cay, tính ấm chữa đau lưng, chướng khí, thổ tả, hàn lỵ, thấp khớp, đổ mồ hôi tay chân, đau bụng ngoài, nhức đầu, đau [16, 20] Năm 1970 Til ạch Thị Thân báo cáo tốt nghiệp Dược sỹ đại học chứng minh Lá lốt có tác đụng kháng khuẩn với chủng Staphylococcus aureus, Sarcina lutea, Bacillus subtilis số chủng vi khuẩn khác [18] Trong báo cáo tác giả chứng minh khả chống viêm nước sắc lốt động vật Từ Lá lốt sử đụng để điều trị bệnh lăng miệng với hai dạng bào chế ống Pipelo ngậm viên nén Pipelo[15] Trong Tạp chí Y học thực hành số năm 1962, tác giả Triều Đắc nêu phương pháp dùng nước sắc Lá lốt đầu hạt dọc trộn cám để điều trị vết thương nhiễm tiling, vết thương lành nhanh chóng[9] Từ tính chất Lá lốt, bệnh viện Quân Y 115, 354 108 nghiên cứu đưa Lá lốt vào sử dụng điều trị bệnh miệng viêm lợi, viêm quanh răng, sâu đạt vài kết tương đối khả quan [20, 22], Theo thống kê bác sĩ Lê Tưởng, Hội Răng Hàm Mặt năm từ 1977 đến 1979 bệnh viện điều trị 150 ca với bệnh hôi miệng, cháy máu chân răng, viêm lợi Lá lốt có tỷ lệ khỏi bệnh đạt 72- 85%[22] 2.2 Cây Trầu không Tên khác: Trầu, thược tương,hrììe ehang, phù lưu, trầu lương Tên khoa học : Piper betle L Họ : Hồ tiêu ( Piperaceae ) 2.2.1 Mô tả [7, 16] Cây Trầu không cỏ đa niên, mọc leo nhờ rễ mấu ,thân nhẵn Lá mọc so le hình trái xoan, phía hình tim, dài 10-13 cm rộng 4,5- cm, đẩu nhọn soi lên có lất nhiều điểm chứa tinh dầu nhỏ Gân thường 5, có bẹ cứng cuống dài 1,5- 3,5 cm Hoa đơn tính, mọc thành bông, hoa không dính vào trục.Hoa đực có nhị Hoa to đến cm, đài cm hay hơn, có bầu, ô với hai đầu nhụy Quả mọng vòi sót lại I 2.2.2 Phân bố địa ỉý[7, 16] * Trầu không trổng khắp nơi nước ía với địa hình vùng đui khác Ngoài câv có số nước khác vùng Malaixia, Indonexia 2.2.3 Thành phần hoá học Theo nhiều tài liệu nghiên cứu cho thấy Trầu chứa tinh dầu có hai thành phần betel-phenol chavicol[16], có số thành phần khác nhưTanin, Cumarin, Flavonoid[14] 2.2.4 Tác dụng dược lý công dụng Theo Dược liệu Việt Nam đo Bộ Y tế xây dựng năm 1978 Trầu không vị cay, tính ấm, mùi thơm, có tác dụng trừ phong thấp, tiêu đờm, tiêu viêm, sát trùng Dùng thân Trầu để chữa cảm mạo, phong thấp, nhức mỏi, đau bụng lạnh đầy hơi, rửa vết thương, chữa bỏng, chữa sưng đau[4] Tuệ Tĩnh sách Nam thần hiệu đề câp đến Trẩu không vị thuốc có tác dụng chữa bỏng tốt [20] Theo Đỗ Tất Lợi, Trầu tác dụng kháng khuẩn với chủng E.coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtỉiis Dòng trẩu để rửa vết loét, trị mẩn ngứa, viêm mạch bạch huyết, viêm kết mạc, chàm mặt [16] Trong báo cáo tốt nghiệp dược sỹ đại học năm 1970, Nguyễn Đình Lân nghiên cứu kết luận Trầu tác dụng kháng khuẩn mạnh[14] v ề lác dụng chữa bệnh miệng cãy thuốc viện Quân Y 103 dùng Trầu không thành phần thuốc bôi với bồ giác, xoan trà, cỏ lào điều trị viêm quanh răng, đạt kết tốt với tỷ lệ khỏi bệnh 84%[13] 2.1.3 M ột sô'bài thuốc có Lá lốt Trầu không *Chữa đau nhức xương khớp, đau lưng, đau Lá lốt, rễ bưởi bung, rễ vòi voi, lễ cỏ xước, tất tháimỏng vàng, vị 15 gam khô, sắc với 600 ml nước, cô còri 200 ml chia 3lần uống ngày[16] *Chữa đau lưng, sưng đầu gối, bàn chân tê buốt, đau Dùng 8-12 gam rễ Lá lốt, phối hợp với dây đau xương, rễ cỏ xước, cỏ cốt khí vị gain sắc uống[7] *ThuỐc Dentoxit chữa bệnh sâu răng, viêm lợi [20] Cao cồn Lá lốt 10% Menthol tinh thể Tinh dầu hương nhu Cỉorophil *Hai dạng bàochế có tên Pipelo[15] (.l)ống Pipelo ngậm: (2)Vién nén Pipelo: Cao mềm Lá lốt gam Đường kính gam Nước vừa đủ 10 ml Cao mềm Lá lốt 0,25 gam Tá dược vừa đủ viên Dùng điều trị sâu viêm cận răng, viêm lợi có biến chứng *Thuốc Đông Y chữa bệnh viêm quanh răng[13] Trầu không Bồ giác Xoan trà Cỏ lào Dùng dược liệu điều chế thành cồn thuốc để bôi chỗ PHẦN III- THỤC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Nguyên vật liệu phưong pháp thực nghiệm 3.Â.I Nguyên vật liệu Trầu không (Piper betle L.), Lá lốt (Piper lolot C.DC) dùng nguyên liệu cành mang lá, thu hái từ vùng ngoại thành Hà Nội Nguyên liệu tươi : nguyên liệu sau thu hái rưả để nước Nguyên liệu khô : nguyên liệu tươi thái nhỏ sau phơi sây tủ sấy nhiệt độ 50 độ c đến khô 3.1.2 Phương pháp nghiên cứu 1.Định tính thành phần hoá học Lá lốt Trầu không: Alcaloid, Flavonoid, Anthraglycosid, Cumarin, Tanin, đường khử thuốc Ihử đặc hiệu sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi thích hợp 2.Định lượng Tanin theo phương pháp oxy hoá với đung dịch chuẩn kalipermanganat, thị sulfo inđigo 3.Tách Tanin dược liệu phương pháp chiết nhiều lần với dung môi nước sau kết tủa tinh chế 4.Thử tác đụng kháng khuẩn phương pháp khuyếch tán đĩa thạch, dùng khoanh giấy lọc tẩm dung dịch thử I 3.2 Kết thực nghiệm nhận xét 3.2.1 Nghiên cứu thành phần hoá học Lá lốt *Định tính Alcaloid [1, 10] (•)Phương pháp hoá học Để định tính Alcaloiđ Lá lốt phương pháp hoá học tiến hành chiết xuất thực phản ứng với thuốc thử chung Alcaloid: Cho 5,0 gam Lá lốt khô vào bình nón 100 ml, làm ẩm ml dung dịch amoniac đậm đặc, thêm 50 ml hỗn hợp Diethyl ether Cloroform (1:1) lắc, lọc.Cho thêm 10 ml dung địch acid sulfuric 10% vào dịch lọc bình gạn Lắc, gạn lấy dịch acid (đung dịch A) làm phản ứng : - Lấy ml đung dịch A cho vào ống nghiệm, thêm giọt thuốc thử Bouchardat, ống nghiệm xuất tuả đỏ nâu -Lấy ml dung dịch A cho vào ống nghiệm, thêm giọt dung dịch acid picric Ethanol, ống nghiệm xuất tủa trắng - Lây ml dung dịch A cho vào ống nghiệm, thêm giọt thuốc thử Dragendoff, ống nghiệm xuất tủa màu vàng cam Các phản ứng dương tính cho thấy Lá lốt có Alcaloicỉ (••)Phương pháp sắc ký lớp mỏng Chứng tiến hành định tính Alcaloid Lá lốt sắc ký lóp mỏng theo quy trình: Cân 20,0 gam Lá lốt khô cho vào bình nón có nút mài 500 ml, thêm 50 ml Ethanol 90° kiềm hoá amoniac (đến pH = 9), đậy nút để yên 18 Gạn, lọc lấy địch chiết, lắc địch chiết với Cloroform Tách lớp Cloroform, sau lắc lại với dung dịch acid sulfuric 20% Kiềm hoá lớp aciđ dung dịch amoniac đặc, lắc lớp với Cloroform, dịch Cloroform đùng để chạy sắc ký Với hệ dung m ô i: (A)- cloroform: methanol (9 : 1) (B )- cloroform: methanol (2 : 1) *Định tính Flavonoid [5, 10] Quá trình định tính Flavonoid Trầu không tiến hành sau: cân 20,0 gam Trầu khô cho vào bình nón 250 ml, thêm 100 ml Methanol, lắp Ống sinh hàn hồi lưu đun cách thuỷ Lọc lấy dịch chiết, cô tới gần cạn Lắc phần dịch lại với Clorofom để loại tạp, sau chiết Flavonoid Methanol Ethylacetat, cô cạn Ethylacetat tới cắn Hoà tan cắn vào Methanol(dung dịch B), dùng dịch để định tính (•)Định tính phương pháp hoá học: -Tác dụng với dung dịch kiềm: lấy ml dung địch B cho vào ống nghiệm, thêm vào 0,5 ml đung địch natri hydroxyd 0,1 N, dung dịch chuyển màu vàng rơm đậm đo Flavonoid tác dụng với dung địch kiềm -Phản ứng Cyanidin: cho vào ống nghiệm ml dung dịch B 0,5 ml dung địch acid hydroclorid đậm đặc, thêm vào ống Magie kim loại, dung dịch ống chuyển sang màu vàng màu hổng dẫn chất Cyan in -Với thuốc thử sắt(III)clorid: í ml đung dịch B cho tác dụng với giọt thuốc thử sắt(HI)clorid, đung địch chuyển sane; màu xanh đen Như kết luận Trầu có Flavonoid (••)Định tính sắc ký lớp mỏng: tiến hành sắc ký lớp mỏng dung dịch B để phái Flavonoid Trầu không Với hệ đung môi: (C)-n-butanol: acid acetic: nước(5: 1: 4) (D)-clorofom: acid acetic(9: 1) (E)-clorofom: methanoỉ(9: 1) Thuốc thử màu: amoniac Kết quả: - Hệ (C) cho vết màu - Hệ (D) cho vết màu vàng kéo dài - Hệ (E) cho vết màu từ vàng đến hổng với thuốc thử Qua thấy Trầu có loại Flavonoid khác Hình đãy mô tả kết sắc ký lớp mỏng Flavonoid Trầu với hệ dung môi (C) (E) 'IIIf jdffUSlhw IP dũi ^SÌF Hệ(C)) Hệ(E) Hình ỊV (3.2.2)- sắc ký lớp mỏng Flavonoid Trẩu không Giá trị Rf vết sắc ký Flavonoid Trầu không với hệ dung môi (E) ghi bảng sau: Giá trị Rf Vết Vết Vết Vết Vết 0,17 0,32 0,42 0,56 0,72 BẩnỉỊ III-ị3.2.2) Giá trị R f vết sắc kỷ Flavonoid Trâu không *Định tính Anthraglycosid[5, 10] Trong bình nón 250 rnl cho 10,0 gam Trầu khô, 20 rnl acid suỉíuric 20%, lắp ống sinh hàn, đun cách thuỷ 20 phút, để nguội thêm vào bình 50 ml Diethylether Lắc kỹ, lọc qua gạn lấy dịch ether (•)Phương pháp hoá học với phản ứng Bortraeger: Cho I ml dịch ether vào ống nghiệm, thêm ml dung dịch natri hydroxyd 10%, lớp kiềm có màu đỏ (••)Phương pháp sắc ký lóp mỏng: Dịch ether đem sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi benzen: methanol (2: 1), màu dung dịch kalihydroxyd Ethanol Trên sắc ký có vết cho màu đỏ có Rf = 4,2 với thuốc thử màu Như có dẫn chất Ani.hrag1ycos.id Trầu không *Định tỉnh dường khử bàng phươiuị pháp hoá học /ổ / Tương tự Lá lốt dùng thuốc thủ' Fehling thuốc thử Tolens để định tính đường khử (rong Trầu không: Dùng 20,0 gam Trâu tươi cho vào bình nón dung tích 100 ml, chiết 50 ml nước cất sôi, để nguội, lọc qua Dịch lọc đem thử phản ứng: -Trong ống nghiệm lấy ml dịch lọc trên, thêm 0,5 ml thuốc thử Fehling, đun cách thu ỷ 10 phút, xuất tỏa đỏ gạch đỒng(I)oxyd -Lấy I ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm 0,5 mỉ thuốc thử Tolens, đun cách thu ỷ ống nghiệm 10 phút, có tủa bạc bám lên thành ống nghiệm Từ kết thu chúng lôi có nhân xét có đường khử TrÀu không *Định tính Cumarin phản ứng hoá học /5 / Cho 20.0 gam Trầu không tươi vào bình nón 100 ml Cling với 50 ml cồn ethylic 90°, đun cách thu ỷ có ống sinh hàn 30 phút Lọc dịch chiết qua tiến hành định tính: -Phản ứng đóng mở vòng lacton: Dùng ống nghiệm, ống lấy I ml dịch chiết, cho thêm vào ống thứ ml natri hydroxyd 10% Đun cách thuỷ ống 10 phút, sau thêm vào ống ml nước cất: ống thứ hai đục, ống thứ Acicl hoá ống thứ I ml acid hydroclorid đậm đặc ống đục ống thứ hai, kết có 19 tính tan khác Cumarin dạng ester nội(có vòng lacton) » dạng muối(không có vòng lacton) -Phản ứng huỳnh quang (dựa vào tính chất phát huỳnh quang đâm dần môi trường kiềm Cumarin): Nhỏ giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, hơ nhẹ cho khô nhỏ chồng iên giọt natri hydroxyd 10%, để khô Che nửa vết địch chiết, đặt giấy ỉọc ánh sáng tử ngoại: nửa vết không bi che có huỳnh quang màu lục, kết thúc che nửa vết lại có huỳnh quang sáng dần lên Từ phản ứng kết luận Trầu có Cumarin *Định tính Tanin bằnẹ phương pháp hơá học [5] Cân 50 gam Trầu khô cho vào bình nón 250 ml, thêm 100 ml nước cất, đun sôi Lọc lấy địch chiết để định tính: -Trong ống nghiệm có ml dịch chiết cho giọt dung dịch sắt(IĨI)clo.rid 1%, dung dịch ống có màu xanh đen, sơ kết luận có hợp chất phenol Trầu -Lấy ml địch chiết cho vào ống nghiệm, thêm giọt dung dịch Gelatin [%, xuất tủa vẩn màu trắng ống, kết hợp với kết phản ứng iĩẫiĩ kết luận Trầu có Tanin hợp chất có phản ứng tạo tủa với Protein -50 ml dịch chiết cho tác dụng với 10 ml formol, ml acid hydroclorid đặc, đun nóng 10 phút tủa xuâ't hiện, Tanin Trầu Tanin pyrogalic Tanin pyrocatechic cho tủa phản ứng Từ phản ứng kết luân Trầu có Tanin Tanin pyrogalic (Tanin thuỷ phân dược) 20 Sau bảng tổng hợp kết định tính thành phần hoá học Lá lốt Trầu không phương pháp hoá học Stt Nhóm chất Alcaloid Phản ứng dịnh tính Lá lốt Trầu khổng Kốl luân -Thuốc thử Drae,enđoff tủa vàng tủa vàng Có -Thuốc thử Bouchardal lủ a nâu tủa nâu Alcaloid tủa trắng -Thuốc thử Mayer -Thuốc thử acid picric Flavonoid tủa trắns, -Phản ứng với kiềm vàng vàng, Cổ -Phản ứng Cyanid in đỏ hồng Flavonoid xanh đen xanh đen đỏ dỏ -Phản Ú'!1 R với sắl(ÌII)cIorid Anlhra3 -Phản ứng Borlraeger Có Anlhiaalycosyil -glycosyđ -Đóne, mở vồng lacton ++ ++ Có Cumarin -Phản ứng huỳnh quang +++ +++ Cumarin Đơờng -Thuốc thử Fehling tủa đỏ lủa dỏ Có kỉủr -Thuốc thửTơlens tủa trắng tủa trắng clưìín*: khử -Tác clụtiR với sắt(III)clorid xanh đen xanh den Có -Tác dụng với dung dịch Gelatin 1% tủa trắng tủa trắng Tan ¡11 -Tác dụng với formol- HCI đặc không tủa khổng tủa pyroaalie Tanin Ghi chú: (+)- Phản ứng dương tính Bảng IV- Đinh tính thàỉih phấn ìioá học Lá lốt Trẩu khô/iạ o Nhận xét thành phấn hoá học Lá lốt Trầu không: Qua kết định tính thực phần 3.2.1 3.2.2 chúng tồi nhận thấy (xong Lá lốt Trầu không đểu có: Alcaloicl, Flavonoid, Anthraglycosicl, Cumarin, đường khử Tanin pyrogalic Điều này gần gũi mặt phân loại nên thành phần hoá học có điểm tương Mặt khác sử dụng (hực tế để chữa bệnh miệng nên vài thành phần chung chúng có tác dụng sinh học, 21 nghiên cứu sâu thành phần Tanin Lá lốt Trẩu không- thành phần mà theo tài liệu[5] có tác dụng kháng khuẩn mạnh 3.2.3 Định lượng nghiền cứu tách Tanin Lá lốt Trầu không *Định lượng tách Tanin Lá lốt (*)Kết định tính phần cho thấy Lá lốt có Tanin chúng tồi tiến bành định lượng Tanin Lá lốt đùng phương pháp Dược điển Việt Nam I [2], Nguyên tắc: môi tnrờng aciđ, Tanin bị oxy hoá kalipermanganat, nhận biết điểm tương đương thị Siìỉíb indigo Tiến hành: cân xác 2,000 g am Lá lốt khô thái nhỏ cho vào bình nón 100 ml Chiết Tanin nước đun sôi lần, lần 20 ml dịch chiết không phản ứng vói thuốc thử sắt(III)clorid Gộp dịch chiết, thêm nước vừa đủ 250,00 rnl Lấy xác 25,00 ml dịch trên, cho vào bình n ón 1000 ml, thêm 750 ml nước 25 ml đung dịch sulfo indigo, định lượng đung dịch kalipennanganat ,IN có màu vàng Song song làm mẫu trắng ml dung địch kalipennanganat ,IN tương ứng với 0,004157 gam Tanin Kết quả: tỷ lệ tanin Lá lốt khô 0,85% (**)Dựa vào kết tiến hành chiết tách Tanin Lá lốt: lây 100 gam Lá lốt khô cho vào bình nón 500 ml, cho vào bình 100 ml nước cất, đun sôi 30 phút, gạn lọc lấy dịch chiết, tiếp tục chiết lẩn Gộp dịch chiết, cô tới 50 ml, kết tủa Tanin amoni sulfat Lọc tủn qua phễu lọc Bucliner sấy đến khô Lấv tủa hoà tan lại Aceton, lọc, bốc Aceton đến cắn Kết tinh lại méthane! vài !ần tủa màu vàng nâu, thử định tính lại tủa phản ứng hoá học Tanin cho kết dương tính Kết tách Tanin với tỷ lệ 0,63 % so với khô, hiệu suất chiết đạt 74% 22 *Tiêh ỉiànli định ìượng tách Tanin Trẩu kliônẹ (•)Định lượng Tanin: Kết định tính phẩn 3.2.2 chứng minh Trầu có Tanin, tiến hành định lượng Tanin Trầu sử dụng phương pháp oxy hoá Lá lốt (phương pháp Dược điển Việt Nam I): Cân 2,000 gam trầu khô cho vào bình nón 100 ml, chiết Tanin nước sôi lần, lần dừng 20 ml dịch chiết không phản ứng với thuốc thử sắt(ĨII)clond Gộp dịch chiết vào bình định mức 250 ml, thêm nước tới vạch Lấy xác 25 mỉ đung dịch bình định mức, cho vào bình nón lOOOml, thêm 750 ml nước cất định lượng kalipermanganat 0,1 N, thị màu sulfo Índigo có màu vàng Song song làm mẫu trắng lml dung dịch kalipermariganat tương ứng với 0,004157 gam Tanin Kết quả: hàin lượng Tallin Trầu không khô 0,96% (••)Tiến hành nghiên cứu tách Tani.n Trầu không: dùng 100 Ram trẩu khô, chiết Tanin nước cất đun sôi lần, lần 100 ml, gộp dịch chiết cô 1/5 Tủa Tanin amoni sulfat, sấy khô tủa, hoà tan lại Aceton, lọc Kết tinh lại tủa nhiều lần Methanol, sấy khô Tanin kết tinh màu nâu với tỷ ]ệ so với khô 0,72%, hiệu suất chiết đạt 75% o Nhận xét: qua định lượng nghiên cứu tách chiết chima thấy: lỷ lệ Tanin Lá lốt Trẩu không tương đối cao tách phương pháp chiết với dung môi nước, tỷ lệ Tanin Trẩu không cao Lá lốt Do theo Tan in thành phẩn mang lại tác dụng sinh học cho Lá ỉốt Trầu không dạng bào chế "ƯỞO sắc cao có tác dụng 23 3.2.4 Thăm dò khả kháng khuẩn dược liệu Dựa vào thông tin lài liệu tham kháo đề cập tới khả kháng khuẩn Lá lốt Trầu không, khảo sát với chế phẩm: í Tinh đầu trầu không Cao lỏng 1:1 (tính theo khô) Trầu không Dịch ép Trầu không Cao lỏng Lá lốt 1:1 (tính theo khô) Dịch ép Lá lốt Tác dụng kháng khuẩn thử chủng vi khuẩn kiểm định: Các chủng Gram (+): -Staphylococcus aureus ATCC 1228 -Sarcina 111tea ATCC 9341 -Bacillus cereus ATCC 9946 -Bacillus subtilis ATCC 6633 -Bacillus purmilis ATCC 10241 Các chủng Gram (-): -Shigella flexneri DT I 12 -Salmonella typhi DT 220 -Escherichia coli DT 118 B14 -Pseudomonas aeruginosa VM 201 -Proteus mirapilis BV 108 Các chủng vi khuẩn gồm chỉing Gram( h) chủng Gram(-) Bộ môn Công nghiệp Dược Tổ môn Vi nấm kháng sinh Trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp *Chuẩn bị nguyên liệu /hử Tinh dầu: Cất tinh dầu Trầu không bằne, phương pháp cất kéo nước, dùng 250 garn lá, cất giờ, I ml tinh dầu màu vàng rơm, có tỷ trọng lớn nước 24 Cao lỏng 1:1 (tính theo khô): dùng 50 gam dược liệu(Trầu không Lá lốt), chiết nước lần lẫn dùng 100 ml, gộp dịch chiết cô 50 gam cao Dịch ép tươi: dùng 50 gatn dược liệu tươi, rửa để nước giã nhỏ cối, thêm 10 ml nước cất, vắt lấy dịch vải gạc sạch, lọc lai qua Tẩm nguyên liệu (rên vào khoanh giấy lọc lần, sau lán sấy khoanh giây cho khô, riêng tinh dầu tẩm lần trước đặt khoanh giấy *Môi trường nuôi cấy môi trường thạch dinh dưỡng có thành phần: Natri clorid: 0,5% Pepton: 1,0% Thạch: 1,8% Nước thịt 1/4: vừa đủ iOOml pH môi trường = 7,0- 7,2 Pha môi trường 10 bình nón, bình có 60 ml môi trường dùng cho 10 chủng vi khuẩn thử, chủng dùng đĩa thạch Tiệt trùng môi trường áp suất 0,8 alni, thời gian 30 phút *Phương pháp thử: phương pháp đặt khoanh giây lọc lẩm nguyên liệu (hử lên hộp petri đổ môi trường nuôi cấy có 1lộn vi khuẩn thử[8] *Khá/ig sinh so sánh: - Penicillin cho chủng vi khuẩn Gram(+), pha thành dung dịch nước có nồng độ 30UI/ml -Gentamicin cho chủng vikhuần Gram(-), pha nước thành dung dịch có nồng độ 20UI/ml Các dung dịch kháng sinh tẩm lên giấy ỉọc lần nguyên liệu thử 25 *Cđỵ truyền giôhg vi khuẩn: Dùng môi trường canh thang(natri clorid 0,5%; pepton ỉ %; nước thịt vừa đủ 100 ml) để cấy truyền vi khuẩn từ ống thạch nghiêng sau vi khuẩn phá! triển tủ ấm 24 *Tỉé'n hành: Sau tiệt trùng môi trương nuôi cấy, đổ vi khuẩn ống cấy truyền vào bình môi trường nhiệt độ môi trường khoảng 40 độ c, sau rót đĩa petri cho thạch đông lại (mỗi bình môi trường rót vào đĩa pel ri khác nhau) Đặt khoanh giây lọc tẩm dịch nguyên liệu thử lên bề mặt thạch Để so sánh, với chủng vi khuẩn thử Gram(+) đặt thêm lên đĩa thạch khoanh giấy lọc tẩm dung dịch Penicillin, với chủng vi kuẢn Gram(-) cho thêm lên đĩa ! khoanh giấy tẩm dung dịch Genlamicin, đô hộp petri tủ ấm 37°c sau 24 đọc kết *Kết giá trị đường kính vòng vô khuẩn trung bình thử tác dụng kháng khuẩn Lá lốt Trầu không ghi bảng sau(đơn vị tính mm): Chủng Dịch ép Cao Penici Genla Tinh dầu Dịch ép c ';ii > Lá lốt Lá lốt -Hin -micin Trầu Trấu 1ríiu không khổng k hỏn II 6,8 6,6 20,5 16,1 7,6 1.0 Bacillus subtil is 0 12,1 13,2 6,5 10,2 Sarcina lulea 0 7,3 12,5 10,6 Bacillus punnilis 0 7,5 14,5 10.4 7,8 7,5 20,3 15,4 7,2 1.0 Salmonella typhi 0 14,1 17,7 15.í) Escherichia coll 7,5 6,9 9,2 15,2 6,y 9,0 Shigella flexneri 7,3 6,8 7,6 16,3 7,2 8,9 Pseu dom on as aer URin OS a 7,8 8,2 9,2 17,0 6,6 Proteus mirapilis 8,0 7,6 12,0 15,5 7,3 10.6 Staphylococcus aureus Bacillus cere us Bảtì» V(3.2.4)- Giá tri dường ỈÍÍIIỈÌ vòng vô khuẩn tì ung bình(mm) Quơ hảng có sô nhận xét: -Cả Trầu không Lá lốt có tác dụng kháng khuẩn -Với nguyên liệu cao 1:1 dịch ép tươi, Trầu không thể hoạt tính kháng khuẩn cao Lá lốt -Với nguyên liệu sử dụng Lá lốt hoạt tính số chủng vi khuẩn Trầu hoạt tính mạnh tất chủng vi khuẩn mà thử -Trên đa số chủng vi khuẩn thử tác dụng kháng khuẩn tinh dầu Trầu tương đương với tác dụng kháng khuẩn kháng sinh, nguyên liệu khác có tác dụng kháng khuẩn kháng sinh đối chiếu Sau ảnh chụp kết thử tác dụng kháng khuẩn Lá lốt Trầu không với chủng vi khuẩn kiểm định: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, rYrt^iVtlỉs Bacillus cereus 27 TD: Tinh dầu Trầu không CT: Cao nước Trầu không ET: Dịch ép Trầu không CL: Cao nước Lá lốt EL: Dịch ép Lá lốt KS: Kháng sinh so sánh 28 I PHẦN IV- KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT Trong thời gian thực khoá luận tốt nghiệp rút m dược mội số kết luận sau: Nghiên cứu thành phần hoá học Trầu không Lá lốt cho thấy dược liệu có: Alcaloid, Flavonoid, Anthraglycosid, Cumarin, Tanin pyrogalic đường khử Đã định lượng tỷ lệ Tanin Lá lốt 0,85% Trầu không 0,96% Đã tách Tanin dược liệu tỷ lệ tách 0,63% lừ Lá lốt có hiệu suất 74% 0,72% từ Trầu hiệu suất 75% Qua thực nghiệm thử vói chủng Gram(+) chủng Gram(-) cho thấv dược liệu có tác dụng kháng khuẩn, Trầu hoạt tính m?!ih phổ tác dụng lớn lốt: nguyên liệu Trẩu lác dụng ức chế tất chủng vi khuẩn thử Lá lốt không biểu tác dụng chủng Bacillus subtiỉis, Sarcina lutea, Bacillus pimnilis Salmonella typhi Tác dụng kháng khuẩn tinh dầu TráII không tương đương với tác dụng kháng khuẩn dung dịch Penicillin 30UI/ml dung dịch Gentamicin 20ƯI/ml Các nguyên liệu: cao Lá lôì, dịch ép Lá lốt, cao Trầu không, dịch ép Trầu lác dụng kháng khuẩn dung dịch kháng sinh chuẩn Do thời gian có hạn nghiên cứu thành phần hoá học Lá lốt Trầu không, mà chua xác định xác Ihành phần mang lại tác dụng điều trị miệng ciìa chúng Chúng lôi tách Tanin qua thăm dò sơ thấy Trầu không Lá lốt có tác dụng kỉiána khuẩn Vì lất mong muốn thuốc tiếp tục * nghiên cứu để đưa dạng thuốc ứng dụng lâm sàng 29 ! Tài liệu tham khảo ề , Bộ Y tế - Dự thảo Dược điển Việt Nam ĨĨI (Thuốc cổ truyền) - Nhà Áiùíi Y học, 1998, trang 118- 119 Bộ Y tế - Dược điển Việt Nam I - Nhà xuất Y học, 1977, trang 732 Bộ Y tế - Dược điển Việt Nam II tập - Nhà xuất Y học, 1994, trang 493 Bộ Y tế - Dược liệu Việt Nam - Nhà xuất Y học, 1978, trang 584 Bộ môn Dược liệu trường Đại học dược Hà Nội - Bài giảng Dược liệu I Bộ môn Dược liệu trường Đại học dược Hà Nội - Bài giảng Dược liệu II Võ Văn Chi - Từ điển thuốc Việt Nam - Nhà xuất Y học, 1997, trang 423 1265 Nguyễn Lân Dũng cộng - Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật * - Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, 1978 * Triều Đắc - Nước sắc lốt dầu hạt dọc trộn cám chữa vết loét nhiễm trùng - Tạp chí Y học thực hành số 7/1962, trang 23 10 Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn viết Tựu - Phương pháp nghiên cứu hoá học thuốc - Nhà xuất Y học, 1985 I I Lê Thị Đĩnh - Góp phần nghiên cứu thành phần hoá học lốt - Công trình tốt nghiệp Dược sỹ đại học 1977 12 Phạm Hoàng Hộ - Cây cỏ Việt Nam - Nhà xuất Trẻ, 1999, trang 291 297 13 Nguyễn Khang, Trương Uyên Thái -Nghiêncứu so sánh tác dụng thuốc đông tây y bôi chỗ chữa bệnhquanh -Công trình nghiên cứu y học quân - Học viện Quân y, 12/1996, trang 52- 56 14 Nguyễn Đình Lân - Cây trầu không “ nhà “ - Báo cáo tốt nghiệp Dược sỹ * đại học 1970 30 I 15 Vũ Ngọc Lộ cộng - Hai dạng bào chế lốt - Tạp chí Dược học * số 1/1974 trang 16 Đỗ Tất Lợi - Những thuốc vị thuốc Việt Nam - Nhà xuất Y học, 1999, trang 118 516 17 Võ Thế Quang - Phòng bệnh sâu - Nhà xuất Thanh Hoá, 1987 18 Thạch Thị Thân - Cây lốt - Báo cáo tốt nghiệp Dược sỹ đại học J 970 19 Phó Đức Thuần - Cây lốt tất bát - Tạp chí Dược học số 3/1996 trang 24 20 Nguyễn Tất Tế - Giói thiệu thuốc chữa Dentoxit - Tạp chí Dược học số 5/1975, trang 23- 24 21 Tuệ Tĩnh - Nam dược thần hiệu - Nhà xuất Y học, 1993, trang 15 382 22 Lê Tưởng, Nguyễn Anh Đoàn - Sơ đánh giá kết điều trị viêm quanh lốt bồ kết - Tài liệu nghiên cứu Răng Hàm Mật - Tổng hội Y h[...]... trong phần 3.2.1 và 3.2.2 chúng tồi nhận thấy (xong Lá lốt và Trầu không đểu có: Alcaloicl, Flavonoid, Anthraglycosicl, Cumarin, đường khử và Tanin pyrogalic Điều này có thể do 2 cây này rất gần gũi về mặt phân loại nên thành phần hoá học có những điểm tương đổng Mặt khác cả 2 cây này đều được sử dụng trong (hực tế để chữa bệnh răng miệng nên có thể là một vài thành phần chung của chúng có tác dụng. .. thuốc - Nhà xuất bản Y học, 1985 I I Lê Thị Đĩnh - Góp phần nghiên cứu thành phần hoá học cây lá lốt - Công trình tốt nghiệp Dược sỹ đại học 1977 12 Phạm Hoàng Hộ - Cây cỏ Việt Nam - Nhà xuất bản Trẻ, 1999, trang 291 và 297 13 Nguyễn Khang, Trương Uyên Thái -Nghiêncứu so sánh tác dụng của thuốc đông và tây y bôi tại chỗ trong chữa bệnhquanh răng -Công trình nghiên cứu y học quân sự - Học viện Quân y, 12/1996,... tác dụng sinh học, vì 21 vậy chúng tôi đã nghiên cứu sâu hơn về thành phần Tanin trong Lá lốt và Trẩu không- thành phần mà theo tài liệu[5] thì có tác dụng kháng khuẩn mạnh 3.2.3 Định lượng và nghiền cứu tách Tanin của Lá lốt và Trầu không *Định lượng và tách Tanin trong Lá lốt (*)Kết quả định tính ở phần trên cho thấy trong Lá lốt có Tanin vì vậy chúng tồi đã tiến bành định lượng Tanin của Lá lốt và... Salmonella typhi Tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu TráII không tương đương với tác dụng kháng khuẩn của dung dịch Penicillin 30UI/ml và dung dịch Gentamicin 20ƯI/ml Các nguyên liệu: cao Lá lôì, dịch ép Lá lốt, cao lá Trầu không, dịch ép lá Trầu không có lác dụng kháng khuẩn kém hơn các dung dịch kháng sinh chuẩn trên Do thời gian có hạn chúng tôi chỉ mới nghiên cứu về thành phần hoá học của Lá lốt và... Lá lốt và Trầu không, mà chua xác định được chính xác Ihành phần nào mang lại tác dụng điều trị răng miệng ciìa chúng Chúng lôi cũng đã tách được Tanin và qua thăm dò sơ bộ thấy cả Trầu không và Lá lốt đều có tác dụng kỉiána khuẩn Vì vậy chúng tôi lất mong muốn 2 cây thuốc này sẽ được tiếp tục * nghiên cứu để đưa ra các dạng thuốc có thể ứng dụng trong lâm sàng 29 ! Tài liệu tham khảo ề , 1 Bộ Y tế -... tỷ lệ tách được là 0,63% lừ Lá lốt có hiệu suất là 74% và 0,72% từ Trầu không có hiệu suất là 75% 4 Qua thực nghiệm thử vói 5 chủng Gram(+) và 5 chủng Gram(-) cho thấv cả 2 dược liệu đều có tác dụng kháng khuẩn, nhưng Trầu không có hoạt tính m?!ih và phổ tác dụng lớn hơn lá lốt: nguyên liệu Trẩu không đã có lác dụng ức chế tất cả các chủng vi khuẩn thử trong khi đó Lá lốt đã không biểu hiện tác dụng. .. qua định lượng và nghiên cứu tách chiết chima tôi thấy: lỷ lệ Tanin trong Lá lốt và Trẩu không tương đối cao và có thể tách được bằng phương pháp chiết với dung môi nước, trong đó tỷ lệ Tanin trong Trẩu không cao hơn trong Lá lốt Do đó theo chúng tôi Tan in có thể là thành phẩn mang lại tác dụng sinh học cho Lá ỉốt và Trầu không vì các dạng bào chế như "ƯỞO sắc và cao đều có tác dụng 23 3.2.4 Thăm... Chi - Từ điển cây thuốc Việt Nam - Nhà xuất bản Y học, 1997, trang 423 và 1265 8 Nguyễn Lân Dũng và cộng sự - Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật * - Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, 1978 * 9 Triều Đắc - Nước sắc lá lốt và dầu hạt dọc trộn cám chữa các vết loét nhiễm trùng - Tạp chí Y học thực hành số 7/1962, trang 23 10 Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn viết Tựu - Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc -... mạnh trên tất cả các chủng vi khuẩn mà chúng tôi đã thử -Trên đa số các chủng vi khuẩn thử tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Trầu tương đương với tác dụng kháng khuẩn của kháng sinh, các nguyên liệu khác có tác dụng kháng khuẩn kém hơn kháng sinh đối chiếu Sau đây là các ảnh chụp kết quả thử tác dụng kháng khuẩn của Lá lốt và Trầu không với các chủng vi khuẩn kiểm định: Staphylococcus aureus, Pseudomonas... Fehling tủa đỏ lủa dỏ Có kỉủr -Thuốc thửTơlens tủa trắng tủa trắng clưìín*: khử -Tác clụtiR với sắt(III)clorid xanh đen xanh den Có -Tác dụng với dung dịch Gelatin 1% tủa trắng tủa trắng Tan ¡11 -Tác dụng với formol- và HCI đặc không tủa khổng tủa pyroaalie Tanin Ghi chú: (+)- Phản ứng dương tính Bảng IV- Đinh tính thàỉih phấn ìioá học Lá lốt và Trẩu khô/iạ o Nhận xét về thành phấn hoá học của Lá lốt và Trầu ... thành phần hoá học có điểm tương Mặt khác sử dụng (hực tế để chữa bệnh miệng nên vài thành phần chung chúng có tác dụng sinh học, 21 nghiên cứu sâu thành phần Tanin Lá lốt Trẩu không- thành phần. .. trị bệnh lăng miệng, mục đích khoá luận tốt nghiệp Dược sỹ đại học “Nghỉcn cứu thành phần hoá học vài có tác dụng chữa bệnh miệng “ Trong thời gian thực khoá luận tốt nghiệp mong muốn hoàn thành. .. sau: Định tính thành phẩn hoá học Lá lốt Trầu không Tìm cách tách thành phần hoá học có khả thành phần tạo nên tác đụng chữa bệnh miệng chúng Thăm dò khả kháng khuẩn dược liệu t PHẦN II- TỔNG