BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM --- o0o --- HỒ THỊ KIM TRÂM NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHITOSAN ĐỂ THU NHẬN SINH KHỐI VI TẢO Thalassiosira pseudonana VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA CỦA SINH KHỐI VI TẢO THU ĐƯỢC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM GVHD: TS. NGUYỄN THẾ HÂN KHÁNH HÒA -06/ 2015 i LỜI CẢM ƠN Sau thời gian nghiên cứu tại phòng thí nghiệm trường Đại học Nha Trang, đến nay em đã hoàn thành công việc nghiên cứu của mình. Lòng biết ơn sâu sắc nhất em xin gửi đến TS. Nguyễn Thế Hân người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu. Em cũng xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô trong khoa Công nghệ Thực phẩm, các thầy cô quản lí phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài tốt nghiệp. Lòng biết ơn sâu sắc nhất em xin gửi đến gia đình đã nuôi dưỡng, dạy dỗ và luôn động viên, ủng hộ em trong suốt quá trình học tập. Sau cùng em xin dành cho bạn bè lời cảm ơn vì đã chia sẻ, động viên và đã cùng đồng hành với em trong suốt thời gian học tại trường. Với kiến thức và tầm nhìn còn hạn chế cũng như bước đầu chưa có kinh nghiệm trong nghiên cứu, bài luận này không tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong sự chân thành góp ý và sửa chữa của thầy cô và toàn thể các bạn. Em xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, tháng 6 năm 2015 Sinh viên thực hiện Hồ Thị Kim Trâm ii MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT LỜI MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................... 6 1.1. Tổng quan về vi tảo Thalassiosirapseudonana .................................................. 6 1.1.1. Phân loại ................................................................................................... 6 1.1.2. Đặc điểm hình thái cấu tạo của Thalassiosira pseudonana ....................... 6 1.1.3. Phân bố ..................................................................................................... 7 1.1.4. Thành phần dinh dưỡng của Thalassiosira pseudonana ........................... 8 1.1.4.1. Protein ......................................................................................................8 1.1.4.2. Lipit .......................................................................................................8 1.1.4.3. Carbohydrate .........................................................................................9 1.1.4.4. Vitamin.....................................................................................................9 1.1.4.5. Sắc tố .....................................................................................................9 1.1.4.6. Chất chống oxy hóa ...............................................................................9 1.1.5. Ứng dụng của Thalassiosira pseudonana ............................................... 10 1.1.5.1. Làm thức ăn cho động vật thủy sản ..................................................... 10 1.1.5.2. Dùng làm nhiên liệu sinh học .............................................................. 10 1.1.5.3. Làm dược phẩm................................................................................... 10 1.2. Tổng quan về chitosan .................................................................................... 11 1.2.1. Cấu trúc hóa học và tính chất của chitosan ............................................. 11 1.2.1.1. Cấu trúc hóa học .................................................................................. 11 1.2.1.2. Tính chất của chitosan ......................................................................... 12 1.2.2. Ứng dụng của chitosan ........................................................................... 13 iii 1.2.3. Nguyên lí sử dụng chitosan thu sinh khối vi tảo và ứng dụng trong xử lý nước thải .............................................................................................................. 16 1.3. Một số phương pháp thu sinh khối vi tảo...................................................... 17 1.3.1. Phương pháp lắng ................................................................................... 17 1.3.2. Phương pháp ly tâm ................................................................................ 17 1.3.3. Phương pháp lọc ..................................................................................... 18 1.3.4. Phương pháp keo tụ ................................................................................ 18 1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về thu sinh khối vi tảo ............. 20 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ............................................................ 20 1.4.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ........................................................... 20 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 22 2.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 22 2.2. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................................... 22 2.2.1. Vi tảo Thalassiosira pseudonana ............................................................ 22 2.2.2. Chitosan .................................................................................................. 22 2.3. Hóa chất .............................................................................................................. 22 2.4. Dụng cụ và thiết bị .......................................................................................... 22 2.5. Phương pháp nghiên cứu................................................................................ 23 2.5.1. Xác định hàm lượng ẩm ....................................................................... 23 2.5.2. Xác định điều kiện thu sinh khối vi tảo................................................... 23 2.5.3. Xác định hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học ................................ 24 2.5.3.1. Chuẩn bị dịch chiết .............................................................................. 24 2.5.3.2. Xác định hàm lượng carotenoid tổng số và chlorophyll ...................... 24 2.5.3.3. Xác định hàm lượng polyphenol tổng số ............................................. 25 2.5.4. Xác định khả năng chống oxy hóa .......................................................... 25 2.5.4.1. Xác định khả năng khử gốc tự do DDPH ............................................ 25 2.5.4.2. Xác định tổng năng lực khử................................................................. 26 2.6. Phương pháp bố trí thí nghiệm ...................................................................... 26 iv 2.6.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát ..................................................................... 26 2.6.2. Xác định loại chitosan............................................................................. 27 2.6.3. Thí nghiệm xác định pH. ........................................................................ 28 2.6.4. Xác định nồng độ chitosan dùng để thu sinh khối vi tảo ......................... 29 2.6.5. Thí nghiệm xác định thời gian thu sinh khối vi tảo ................................. 30 2.7. Phương pháp phân tích .................................................................................. 31 2.7.1. Xác định hàm lượng ẩm trong tế bào vi tảo ............................................ 31 2.7.2. Xác định hàm lượng carotenoid tổng số, hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b ........................................................................................................ 31 2.7.3. Xác định hàm lượng polyphenol tổng số ................................................ 33 2.7.4. Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH ................................................ 34 2.7.5. Xác định tổng năng lực khử .................................................................... 35 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.............................. 37 3.1. Kết quả xác định điều kiện thu sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana 37 3.1.1. Ảnh hưởng của loại chitosan đến hiệu suất thu hồi sinh khối vi tảo ........ 37 3.1.2. Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu hồi sinh khối vi tảo ....................... 40 3.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến hiệu suất thu hồi sinh khối ........... 44 3.1.4. Ảnh hưởng của thời gian lắng đến hiệu suất thu hồi sinh khối vi tảo ...... 48 3.2. Kết quả xác định hoạt tính sinh học của vi tảo Thalassiosira pseudonana .51 3.2.1. Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số, chlorophyll a, chlorophyll b và carotenoid tổng số ....................................................................................................... 51 3.2.2. Khả năng chống oxy hóa của sinh khối vi tảo thu được bằng chitosan ...52 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ............................................................. 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................... 58 PHỤ LỤC ............................................................................................................... 62 v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Hàm lượng polyphenol tổng số, chlorophyll a, chlorophyll b và carotenoid tổng số.................................................................................................... 52 Bảng 3.2. Giá trị EC50 của sinh khối vi tảo thu bằng chitosan và vitamin C ............. 54 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Vi tảo Thalassiosira pseudonana ...............................................................7 Hình 1.2. Cấu trúc của chitosan............................................................................... 11 Hình 2.1. Cách xác định chiều cao cột lắng ............................................................. 24 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát............................................................. 26 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định loại chitosan ......................................... 27 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH ........................................................ 28 Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ chitosan .................................. 29 Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thu sinh khối vi tảo ................ 30 Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b và carotenoid tổng số ............................................................................................... 32 Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng polyphenol tổng số ............. 33 Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định khả năng khử gốc tự do DPPH ............. 34 Hình 2.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tổng năng lực khử .............................. 35 Hình 3.1. Đánh giá hiệu suất thu hồi khi sử dụng 2 loại chitosan DD70 và DD85 38 Hình 3.2. Ảnh hưởng của loại chitosan đến Hiệu suất lắng và Hệ số lắng (A) và Tỉ lệ phần thể tích lắng (B)........................................................................................... 39 Hình 3.3. Đánh giá hiệu suất thu hồi sinh khối ở những pH khác nhau ................... 42 Hình 3.4. Ảnh hưởng của pH đến (A) Hiệu suất lắng và Hệ số lắng, (B) Tỉ lệ phần thể tích lắng ............................................................................................................. 43 Hình 3.5. Hình ảnh sinh khối vi tảo thu bằng chitosan ở các nồng độ khác nhau 45 Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến hiệu suất thu hồi vi tảo (A) Ảnh hưởng đến Hiệu suất lắng và Hệ số lắng, (B) Ảnh hưởng đến Tỉ lệ phần thể tích lắng..............................................................................................................................46 Hình 3.7. Đánh giá hiệu suất thu hồi sinh khối ở những thời gian khác nhau 49 Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian lắng đến Hiệu suất lắng và Hệ số lắng (A) và Tỉ lệ phần thể tích lắng (B)........................................................................................... 50 vii Hình 3.9. Khả năng chống oxy hóa (A) Tổng năng lực khử và (B) Khả năng khử gốc tự do DPPH của sinh khối vi tảo thu bằng chitosan và vitamin C...................... 55 viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT FE : Hiệu suất lắng CF : Hệ số lắng SSVF : Tỉ lệ thể tích phần chất rắn lắng EC50 : Giá trị nồng độ tại đó tổng năng lực khử hoặc khả năng bắt gốc tự do DPPH đạt 50% PUFA : Các axit béo chưa no EPA : Axit Eicosapentaenoic ARA : Axit Arachidonic DHA : Axit Docosahexaenoic DPPH : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl PUFA : Polyunsaturated fatty acid 1 LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Vi tảo là loài sinh vật đơn bào, thường được tìm thấy ở vùng biển nước mặn và nước ngọt với các kích thước khác nhau, từ vài đến vài trăm micromet. Vi tảo có khả năng nuôi sinh khối lớn, dễ tiêu hóa và có hàm lượng dinh dưỡng cao. Nhờ những tính chất này mà vi tảo được xem như một mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn và cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết cho động vật nuôi. Vi tảo được sử dụng là nguồn thức ăn quan trọng cho tất cả các giai đoạn phát triển của động vật thân mềm 2 mảnh vỏ như: hầu, vẹm, điệp, sò, ngao. Chúng còn là thức ăn cho ấu trùng của hầu hết các loài tôm, cá, ốc và động vật phù du. Đến nay, có khoảng trên 40 loài tảo đã được phân lập, nuôi cấy và sử dụng làm thức ăn cho ấu trùng các loài thủy sản. Một số loài tảo được nuôi và sử dụng phổ biến trên thế giới là: Thalasiossira pseudonana, Skeletonema, Chaaaetoceros calcitrans, Chaetoceros mulleri, Nannochloropsis ocula, Chlorella minutissima,... Tại Việt Nam, loài vi tảo Thalassiosira sp. được nuôi để làm nguồn thức ăn cho tôm thẻ chân trắng. Bên cạnh làm thức ăn cho động vật thủy sản, vi tảo còn được xem là nguồn nguyên liệu tiềm năng để chiết xuất các chất có hoạt tính sinh học cần thiết cho sức khỏe con người. Một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ vi tảo đã được chiết rút bao gồm: các axit béo không no (như EPA và DHA), chất màu (như chlorophyll và carotenoid), các chất có khả năng chống oxy hóa, các chất có khả năng kháng virus, các chất có khả năng kháng viêm,… (Raposo và cộng sự, 2013). Nhiều sản phẩm thực phẩm chức năng từ vi tảo đã được thương mại hóa. Vi tảo còn được coi là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất dầu diesel sinh học, có thể hoàn toàn thay thế diesel hóa thạch trong tương lai, với sản lượng dầu cao hơn đến 10-20 lần so với các loài thực vật trên cạn (Kaewkannetra và cộng sự, 2012). 2 Trong những năm gần đây, nghiên cứu sản xuất dầu diesel sinh học từ vi tảo được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Tảo sản xuất dầu ngay trong tế bào khi quang hợp với thành phần dầu lên đến 80% khối lượng khô. Dầu tảo có khả năng chuyển đổi thành dầu mỏ nhân tạo hoặc nhiên liệu sinh học sạch và tốt hơn hẳn các loại xăng dầu hiện có. Theo tiêu chuẩn đánh giá của American Society for Testing Material (ASTM), dầu từ tảo có thuộc tính tương tự các loại dầu thô tiêu chuẩn, nhưng an toàn hơn nhờ nhiệt độ phát cháy cao hơn, ít độc hại, không gây hiệu ứng nhà kính, có thể sử dụng trực tiếp cho động cơ diesel hoặc pha trộn với các loại dầu có nguồn gốc khác theo tỷ lệ khác nhau. Các nhà khoa học đã chứng minh, tảo giúp giảm đến 70-90% vấn đề ô nhiễm môi trường. Quá trình chuyển hóa năng lượng trong tảo hấp thụ một lượng lớn CO2. Mỗi kg sinh khối tảo tiêu thụ 1,8 kg CO2 trong quá trình quang hợp. Có thể thấy, dầu tảo là khám phá có ý nghĩa vô cùng to lớn bởi thế giới vẫn đang nỗ lực tìm giải pháp thay thế cho các nguồn nhiên liệu hóa thạch (Minh Thảo, 2014). Để sử dụng làm thức ăn cho động vật thủy sản, sinh khối vi tảo cùng với môi trường nuôi cấy được cung cấp trực tiếp vào ao nuôi. Điều này dẫn đến nhiều bất cập. Thứ nhất, việc vận chuyển hoặc bơm trực tiếp môi trường nuôi chứa sinh khối vi tảo đến ao nuôi làm tăng chi phí sản xuất, hiệu quả sử dụng thấp. Thứ hai, trong môi trường nuôi, có thể chứa một số thành phần không có lợi cho sức khỏe của động vật thủy sản, đặc biệt là ở giai đoạn ấu trùng. Để sản xuất nhiên liệu sinh học từ vi tảo, hầu hết các phương pháp đòi hỏi phải thu sinh khối, sau đó sấy khô và ép/chiết. Như vậy, sinh khối vi tảo cần được thu trước khi sử dụng vi tảo làm thức ăn cho động vật thủy sản, thực phẩm cho con người, cũng như sản xuất nhiên liệu sinh học. Tuy nhiên việc tách sinh khối vi tảo ra khỏi môi trường nuôi là một thách thức lớn về công nghệ và kinh tế. Phần lớn các loài vi tảo có kích thước tế bào nhỏ từ 1-30 m và nồng độ sinh khối trong môi trường nước nuôi thấp từ 0,5-2,0 g/L tùy thuộc vào phương pháp nuôi cấy. Hiện nay, một số phương pháp đã được sử dụng để tách sinh khối vi tảo như: lắng, lọc, ly tâm và sử dụng chất trợ lắng. 3 Phương pháp ly tâm có thể sử dụng thể thu sinh khối của nhiều loài vi tảo khác nhau. Tuy nhiên, phương pháp này có chi phí năng lượng cao, làm tăng chi phí sản xuất. Norsker và cộng sự (2011) đã ước tính phương pháp ly tâm có chi phí năng lượng đầu vào tương đương với khoảng 50% chi phí năng lượng trong quá trình sản xuất nhiên liệu sinh học từ vi tảo. Chisti (2007) cũng ước tính rằng chi phí của quá trình thu sinh khối vi tảo để sản xuất dầu diesel chiếm khoảng 50% chi phí sản xuất. Một nhược điểm khác của phương pháp ly tâm là đòi hỏi nhiều thời gian (Grima và cộng sự, 2003). Lắng, lọc cũng là phương pháp đã được sử dụng để thu sinh khối vi tảo. Tuy nhiên, cũng giống như phương pháp ly tâm, phương pháp này có chi phí cao. Ngoài ra, nhược điểm lớn nhất của phương pháp lắng lọc đó là nó chỉ thích hợp để thu các loài vi tảo có kích thước lớn như Spirulina (de Godos và cộng sự, 2011). Sử dụng các chất trợ lắng được cho là phương pháp có hiệu quả cao trong việc thu sinh khối vi tảo với chi phí vừa phải (de Godos và cộng sự, 2011). Dựa vào đặc tính hóa học, người ta chia các chất trợ lắng thành hai loại: chất trợ lắng vô cơ và chất trợ lắng hữu cơ/đa điện phân (polyelectrolyte). Các muối kim loại như ferric chloride (FeCl3), aluminum sulfate (Al2(SO4)3) và ferric sulfate (Fe2(SO4)3) là những chất trợ lắng vô cơ được sử dụng phổ biến. Tuy nhiên, các muối kim loại này có giá thành cao. Khi sử dụng để thu vi tảo chúng tạo thành một lớp cặn trong môi trường nuôi cấy và sẽ ảnh hưởng xấu đến quá trình phát triển sinh khối vi tảo. Môi trường nuôi muốn tái sử dụng phải loại bỏ những cation kim loại này. Ngoài ra, các muối ion kim loại còn được chứng minh ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của người và động vật sử dụng chúng (Huang và cộng sự, 2000) và làm giảm pH của môi trường đáng kể. Chitosan là một polyme sinh học, thân thiện với môi trường, an toàn cho người sử dụng. Chitosan có nhiều ứng dụng trong ngành dược phẩm và thực phẩm. Gần đây, chitosan cũng được sử dụng để làm chất trợ lắng trong xử lý nước thải do có khối lượng phân tử lớn và mật độ điện tích cao. Chitosan có các nhóm mang điện tích dương (NH3+ và NH2) có khả năng hấp thu những vi sinh vật tích điện âm, trong đó có vi tảo. Với những đặc điểm này, chitosan được xem là chất trợ lắng 4 tiềm năng có thể sử dụng để thu sinh khối vi tảo, giúp giảm chi phí và nâng cao chất lượng của sinh khối thu được. Trên thế giới đã có một số nghiên cứu sử dụng chitosan để thu sinh khối vi tảo: Xu và cộng sự (2012) đã dùng chitosan để thu sinh khối Chlorella sorokiniana, Farid và cộng sự (2012) đã dùng nano-chitosan để thu sinh khối vi tảo Nannochloropsis sp… Tuy nhiên cho tới nay chưa có bất cứ công trình nghiên cứu nào công bố về việc sử dụng chitosan để thu sinh khối vi tảo Thlassiosira pseudonana. T. pseudonana là một loại vi tảo được nuôi nhiều tại Việt Nam để dùng làm thức ăn cho tôm ở giai đoạn ấu trùng. Hàm lượng một số chất dinh dưỡng cơ bản trong loài vi tảo này đã được công bố, tuy nhiên dữ liệu về các hoạt chất sinh học như các hợp chất polyphenol, chlorophyll, carotenoid và khả năng chống oxy hóa trong loài vi tảo này vẫn còn rất hạn chế. Xuất phát từ những lý do trên tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu sử dụng chitosan để thu nhận sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana và đánh giá khả năng chống oxy hóa của sinh khối vi tảo thu được”. 2. Mục tiêu của đề tài (1) Xác định điều kiện thích hợp để thu nhận sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana bằng chitosan; (2) Xác định hàm lượng polyphenol, carotenoid, chlorophyll và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana thu được bằng chitosan. 3. Nội dung nghiên cứu Ðể thực hiện các mục tiêu nghiên cứu trên, đề tài thực hiện những nội dung sau đây: Mục tiêu 1: Xác định điều kiện thích hợp để thu nhận sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana bằng chitosan 1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của loại chitosan đến hiệu suất thu hồi sinh khối; 1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu hồi sinh khối; 1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chitosan; 5 1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lắng. Mục tiêu 2: Xác định hàm lượng polyphenol, carotenoid, chlorophyll và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana thu được bằng chitosan. 2.1. Xác định hàm lượng polyphenol; 2.2. Xác định hàm lượng chlorophyll; 2.3. Xác định hàm lượng carotenoid tổng số; 2.4. Xác định khả năng khả năng bắt gốc tự do DPPH; 2.5. Xác định tổng năng lực khử của sinh khối vi tảo thu được. 4. Những đóng góp của đề tài 4.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ bổ sung dữ liệu khoa học về việc sử dụng chitosan để thu sinh khối vi tảo nuôi trồng ở Việt Nam. Kết quả cũng cung cấp dữ liệu khoa học về thành phần, hàm lượng một số chất có hoạt tính sinh học và khả năng chống oxy hóa của sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana thu bằng chitosan. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn - Sử dụng chitosan để thu sinh khối vi tảo sẽ giúp giảm chi phí và nâng cao chất lượng sinh khối, do đó đề tài thành công sẽ góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế của cơ sở nuôi thủy sản sử dụng loài vi tảo này làm thức ăn, nâng cao giá trị kinh tế cho loài vi tảo Thalassiosira pseudonana; - Kết quả của đề tài cũng là cơ sở để sản xuất một số sản phẩm thực phẩm chức năng (nước uống, viên nang) từ sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana. 6 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN Vi tảo (microalgae) là tất cả các tảo có kích thước hiển vi, là thành phần chủ yếu tạo nên năng suất sơ cấp của thủy vực và giữ vai trò quan trọng trong việc duy trì sự phát triển của hệ sinh thái nước (Dương Đức Tiến, 2006). Muốn quan sát chúng phải sử dụng tới kính hiển vi. Trong số khoảng 50.000 loài tảo trên thế giới thì vi tảo chiếm đến khoảng 2/3. 1.1. Tổng quan về vi tảo Thalassiosira pseudonana 1.1.1. Phân loại Vi tảo Thalassiosira pseudonana thuộc: Ngành: Bacillariophyta Lớp: Bacillariophyceae Bộ: Centrales Bộ phụ: Discineae Họ: Thalassiosiraceae Giống: Thalasssiosira Loài: Thalassiosira pseudonana 1.1.2. Đặc điểm hình thái cấu tạo của Thalassiosira pseudonana Thalassiosira pseudonana là một loại tảo khuê có dạng hình hộp, rất mỏng, có kích thước trung bình từ 6-20 x 8-15 µm (vào mùa đông kích thước lớn hơn vào mùa hè). Mặt vỏ hình chữ nhật và đường kính dài hơn trục vỏ tế bào. Đai vỏ không đều, mép đai có 2-28 mấu nhỏ, một mấu có dạng hình môi để liên kết với tế bào bên cạnh. Thường thì chỉ có duy nhất một gai ở mép và ở trung tâm. Gai ở mép có thể dễ dàng nhìn thấy được khi quan sát trên kính hiển vi. Bề mặt của màng tế bào tảo tròn nhiều vằn, sọc. Các vằn, sọc này có thể thẳng hoặc ngoằn ngoèo, mật độ vằn sọc khoảng 10-20 vằn sọc/10 µm. Tế bào Thalassiosira pseudonana chỉ có một nhân, hình cầu. Thalassiosira pseudonana thường sống đơn độc, đôi khi liên kết với nhau thành tập đoàn (dạng bản). Có hai hình thức: các tế bào tập hợp với nhau thành từng nhóm hoặc mắt xích giữa các tế bào (dạng chuỗi). Nếu nó kết hợp với 7 nhau thành từng nhóm thì được liên kết với nhau bằng sợi kitin nhỏ, còn ở dạng chuỗi các tế bào xoắn chuỗi với nhau qua bề mặt màng tế bào. Màu của tảo Thalassiosira pseudonana thay đổi từ màu nâu đến màu xanh hoặc màu vàng tùy thuộc vào số lượng của diệp lục. Tuy nhiên, màu sắc này thay đổi không ảnh hưởng đến chất lượng của tảo. Thể sắc tố của tảo Thalassiosira pseudonana nhỏ, nhiều và có hình hạt (Hình 1.1). Thalassiosira pseudonana là loại tảo giàu dinh dưỡng, đặc biệt là các axit béo không no, carbohydrate, protein… cộng với kích thước siêu vi của nó nên rất phù hợp với các trại sản xuất cá biển (làm thức ăn cho copepoda), các trại sản xuất nhuyễn thể (trong giai đoạn nhuyễn thể có kích thước 200 µm trở lên) và các trại sản xuất tôm giống từ giai đoạn mysis đến giai đoạn postlarvae. Nó làm tăng tỷ lệ sống và khả năng tăng trưởng của các đối tượng trên. Hình 1.1. Vi tảo Thalassiosira pseudonana 1.1.3. Phân bố Tảo silic phân bố rất rộng trong môi trường nước mặn, lợ, ngọt. Cũng gặp trên đất đá, trong các thủy vực chúng có thể sống trôi nổi hoặc ở đáy. Số lượng loài ở đáy nhiều hơn nhưng số lượng cá thể và sinh khối lại ít hơn so với các loài sống trôi nổi. Ở các biển lạnh tảo silic phân bố nhiều hơn biển ấm. Trong những hồ nước ngọt trong suốt chúng có thể phân bố ở độ sâu 50-60m còn trong nước biển khoảng 100-350m. Riêng tảo Thalassiosira pseudonana thường sống trong môi trường nước mặn. Chúng được nuôi để làm thức ăn cho nhiều ấu trùng động vật hải sản sống đáy như bào ngư, ốc hương... 8 1.1.4. Thành phần dinh dưỡng của Thalassiosira pseudonana Protein, lipit, carbohydrate là những thành phần chủ yếu cấu tạo nên tế bào vi tảo. Những chất này chiếm 90-95% khối lượng khô tế bào, 5-10% khối lượng chất khô còn lại bao gồm các vitamin, sắc tố, các chất chống oxy hóa… Thành phần dinh dưỡng của vi tảo Thalassiosira pseudonana biến đổi theo thời gian sinh trưởng và điều kiện nuôi trồng. 1.1.4.1. Protein Hàm lượng protein trong mỗi tế bào vi tảo được coi là một trong những yếu tố quyết định giá trị dinh dưỡng của vi tảo. Theo một nghiên cứu của Brown và cộng sự (1997), trong tảo đơn bào hàm lượng protein dao động từ 6-52%; carbohydrate từ 523% và lipit từ 7-23% khối lượng chất khô. Cũng theo Volkman và cộng sự (1989), hàm lượng protein tổng số ở vi tảo Thalassiosira pseudonana là 17,8%. 1.1.4.2. Lipit Trong lipit thì thành phần và hàm lượng các axit béo đóng vai trò quyết định giá trị dinh dưỡng của vi tảo. Các axit béo chưa no (PUFA), đặc biệt là axit Eicosapentaenoic (EPA), axit Arachidonic (ARA) và axit Docosahexaenoic (DHA) giữ vai trò quan trọng trong việc đánh giá chất lượng của vi tảo trong việc ứng dụng làm thức ăn cho người và động vật. Các axit béo chưa no là thành phần cần thiết cho sự phát triển bình thường, khỏe mạnh của hệ thần kinh, tim mạch. Axit Docosahecxaenoic (DHA), Axit Eicosapentaenoic (EPA), Axit Arachidonic (ARA) rất cần thiết đối với động vật nuôi thủy sản (McEvoy và Bell, 1997; Brown và cộng sự, 1997; Vilchis và Doktor, 2001). Vi tảo được coi là có giá trị dinh dưỡng tốt cho các đối tượng nuôi nếu hàm lượng PUFA (DHA, EPA) dao động từ 1-20 mg/ml tế bào (Thinh, 1999). Theo một nghiên cứu của Brown và cộng sự (1989), hàm lượng axit béo không no (EPA + DHA) của Thalassiosira pseudonana là 7,2 mg/ml tế bào. Tuy hàm lượng này thấp hơn so với Chaetoceros calcitrans (17,8 mg/ml tế bào) và Pavlova lutheri (10,1 9 mg/ml tế bào), nhưng Thalassiosira sp. vẫn là nguồn thức ăn tự nhiên giàu dinh dưỡng cho ngành nuôi trồng thủy sản. 1.1.4.3. Carbohydrate Theo Brown và cộng sự (1991), hàm lượng hydrocarbon của các loài tảo khá cao, dao động 5-23% khối lượng khô tế bào. Ở tảo Thalassiosira, hàm lượng hydrocarbon chiếm 7,8% khối lượng chất khô. Hydrocarbon ở tảo tồn tại chủ yếu ở các dạng đường glucose, galactose, mantose, ribose và các polysaccharide khác. Trong đó, glucose chiếm hàm lượng cao nhất, dao động 21-87%, tiếp theo là galactose, mantose và ribose. 1.1.4.4. Vitamin Vi tảo là nguồn cung cấp vitamin quan trọng cho các đối tượng thủy sản nuôi. Vi tảo giàu nguồn vitamin và khoáng chất, điều này giúp chúng được ứng dụng như một chất dinh dưỡng bổ sung vào thực phẩm. Một số loài Chlorella chứa nhiều vitamin hơn hầu hết các loài thực vật trên cạn (Blazencic, 2007). Những loại vitamin chính thường gặp trong tảo nuôi gồm: Thiamin (B1), Riboflavin (B2), Pyridoxin (B6), Cyanocobalamin (B12), axit Ascorbic (C), axit Nicotinic (B3), axit Pantothenic (B5), Tocopherol (E), Caroten (Provitamin A), Choline. 1.1.4.5. Sắc tố Chlorophyll xanh lục và carotenoid vàng, đỏ, cam là những chất màu chủ yếu trong các loài tảo. Mỗi loài tảo có chứa từ 5-10 loại carotenoid khác nhau. Chlorophyll a là thành phần sắc tố quang hợp chính trong các loài tảo, ngoài ra còn có chlorophyll b và chlorophyll c. Trong tế bào tảo, carotenoid đóng vai trò như sắc tố bổ trợ quang hợp và là tác nhân bảo vệ tế bào tảo tránh khỏi tác hại của cường độ ánh sáng quá cao. 1.1.4.6. Chất chống oxy hóa Nhiều hợp chất chống oxy hóa được tìm thấy trong các loài vi tảo như các hợp chất polyphenol, các phycobiliprotein và các vitamin (Plaza và cộng sự, 2008). Phenolics, flavonoids, astaxanthin, anthocyanins, carotenoids, chlorophyll, vitamin E, vitamin C… là những hợp chất chống oxy hóa được tìm thấy trong vi tảo. Với 10 thành phần chất chống oxy hóa đa dạng, nhiều loại vi tảo đã được ứng dụng trong thực phẩm chức năng, mỹ phẩm để ngăn ngừa sự lão hóa. 1.1.5. Ứng dụng của Thalassiosira pseudonana 1.1.5.1. Làm thức ăn cho động vật thủy sản Vi tảo đã được ứng dụng rộng rãi trong ngành nuôi trồng thủy sản để làm thức ăn cho nhiều loài thủy sản như nhuyễn thể 2 mảnh vỏ, các loài cá, tôm, mực ở giai đoạn ấu trùng (Brown, 2002). Mặc dù có hàng trăm loài tảo được nghiên cứu để ứng dụng làm thức ăn nhưng chỉ có rất ít loài được sử dụng cho ngành nuôi trồng, trong đó có loài Thalassiosira (Brown và cộng sự, 1996; Spolaore và cộng sự, 2006). Với những đặc tính ưu việt không gây ô nhiễm môi trường, cung cấp đầy đủ các vitamin, chất khoáng, vi lượng, đặc biệt chứa rất nhiều loại axit béo không no, tảo Thalassiosira pseudonana nói riêng và tảo đơn đơn bào nói chung ngày càng được ứng dụng rộng rãi để làm thức ăn trong ngành nuôi trồng thủy sản. 1.1.5.2. Dùng làm nhiên liệu sinh học Nhiên liệu sinh học là một nguồn năng lượng sạch và thân thiện với môi trường. Việc sử dụng nhiên liệu sinh học sẽ hạn chế được hiện tượng hiệu ứng nhà kính và sự nóng lên của Trái đất. Hiện nay, sử dụng nhiên liệu sinh học thay thế cho các loại nhiên liệu hóa thạch đang ngày càng được quan tâm và ứng dụng, đặc biệt là ở những nước có nền kinh tế phát triển. Nhiên liệu sinh học được sản xuất bằng phản ứng chuyển hóa este từ dầu của nhiều loại cây trồng như hướng dương, đậu nành, cọ và tảo. Vi tảo đã được ứng dụng rộng rãi trong việc sản xuất nhiên liệu nhờ vào khả năng quang hợp cao, sinh khối lớn, khả năng phát triển nhanh (Miao và cộng sự, 2004) và đặc biệt vi tảo cho sản lượng dầu cao hơn 10-20 lần so với các loài thực vật trên cạn (Kaewkannetra và cộng sự, 2012). Lipit trong vi tảo có khả năng được chuyển đổi thành dầu diesel sinh học, carbohydrate được chuyển thành ethanol và H2, protein được biến đổi thành dạng nguyên liệu thô cho công nghệ phân bón sinh học (Raja và cộng sự, 2013). 1.1.5.3. Làm dược phẩm 11 Vi tảo giàu các hợp chất có hoạt tính sinh học nên có thể được dùng để phát triển dược phẩm và thực phẩm chức năng. Tảo silic đã được ứng dụng trong thuốc kháng viêm (Dolatabadi và de la Guardia, 2011; Gordon và cộng sự, 2009; Losic và cộng sự, 2010; Nassif and Livage, 2011). 1.2. Tổng quan về chitosan. Chitin/chitosan là một polyme sinh học được chiết rút từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau: phế liệu thủy sản, vi nấm, vi khuẩn. Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin/chitosan là từ phế liệu thủy sản: tôm cua, nang mực… mỗi nguồn nguyên liệu khác nhau sẽ cho hàm lượng chitin cũng như tính chất của chitosan khác nhau. Hình 1.3 mô tả quy trình tổng quát quá trình sản xuất chitosan từ phế liệu thủy sản. 1.2.1. Cấu trúc hóa học và tính chất của chitosan 1.2.1.1. Cấu trúc hóa học Chitosan một polysaccharide mạch thẳng, là dẫn xuất đề acetyl hoá của chitin, trong đó nhóm (–NH2) thay thế nhóm (–COCH3) ở vị trí C(2). Chitosan được cấu tạo từ các mắt xích D-glucozamin liên kết với nhau bởi các liên kết b-(14)-glicozit, do vậy chitosan có thể gọi là poly b-(1-4)-2-amino-2-deoxi-D-glucozơ hoặc là poly b-(1-4)-D- glucozamin (cấu trúc III) (Hình 1.2). Hình 1.2. Cấu trúc của chitosan Công thức phân tử: (C6H11O4N)n Trong đó: n nằm trong khoảng 700 ÷ 4.500 (đôi khi đến 6.000). Phân tử lượng: Mchitosan = (161,07)n Do chitosan được điều chế từ quá trình khử acetyl hóa chitin nên khối lượng biểu kiến của nó tùy thuộc vào giá trị của n, phần trăm nhóm acetyl và cả điều kiện 12 điều chế của nó. Cấu trúc của chitosan là một tập hợp các phân tử liên kết với nhau bởi các cầu nối glucozit và hình thành một mạng các sợi có tổ chức. Chitin, chitosan là polysaccharide có đạm, không độc hại, có khối lượng phân tử lớn. Các tính chất của chitosan như khả năng kết dính, khả năng tạo màng, tạo gel, hấp phụ chất màu, kim loại, khả năng kháng vi sinh vật được quyết định bởi cấu trúc hóa học của chitosan như phân tử lượng, độ deacetyl. Phế liệu thủy sản Khử protein Khử khoáng Tẩy màu Chitin Deacetyl Chitosan Hình 1.3. Sơ đồ tổng quát quá trình sản xuất chitin, chitosan từ phế liệu thủy sản 1.2.1.2. Tính chất của chitosan Chitosan là một polymer hữu cơ, có nhiều trong vỏ các loại giáp xác. Ðây là polyme hữu cơ phổ biến trong tự nhiên sau cellulose, được ước tính 100 tỉ tấn/năm. Chitosan đã được nghiên cứu và ứng dụng khá nhiều, nhất là vào khoảng thời gian từ 1975-1985. Nó có những đặc tính ưu việt mà các polyme tổng hợp khác không có như: khả năng phân huỷ, dễ tương thích, không độc hại và các đặc tính lý học, sinh 13 học như: khả năng tạo gel, liên kết với các chất màu, lipit, protein và khả năng kháng khuẩn (Knorr, 1983; Hirano,1996; Ng 2000). Không giống như chitin chỉ tan trong một số ít hệ dung môi, chitosan tan tốt trong các axit hữu cơ thông thường như axit formic, axit acetic, axit citric, axit lacic. Khi hòa tan chitosan trong môi trường axit loãng chitosan tồn tại ở dạng điện tích (+) nên có những đặc tính khác biệt với các polysaccharide khác thường vốn ở dạng trung tính hoặc ở điện tích âm. Chitosan dương tính có khả năng kết hợp với các chất rắn hữu cơ hay bề mặt tế bào, là những chất có ion âm. Ðây là cơ sở để ứng dụng chitosan trong việc kết hợp với các chất béo để chế tạo sản phẩm làm giảm cân, băng dán mỹ phẩm vào da hay tóc và kết hợp với kim loại nặng và hoá chất màu. Các tính chất của chitosan như khả năng hút nước, khả năng hấp phụ chất màu, kim loại, kết dính với chất béo, khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, khả năng tạo màng… phụ thuộc rất lớn vào độ deacetyl hóa. Chitosan có độ deacetyl cao thì có khả năng hấp phụ chất màu, kim loại cũng như khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, tạo màng cao hơn so với các mẫu chitosan có độ deacetyl thấp hơn. Ngoài các tính chất trên thì chitosan còn có khả năng chống oxy hóa. Khả năng chống oxy hóa của chitosan phụ thuộc vào độ deacetyl, phân tử lượng và độ nhớt của chitosan. Chitosan có độ nhớt thấp thì khả năng chống oxy hóa cao. 1.2.2. Ứng dụng của chitosan Do các ưu điểm trên của chitosan nên nó càng được ứng dụng nhiều trong sản xuất và đời sống. Trong thực phẩm Chitosan là một polyme hữu cơ tự nhiên an toàn với những tính chất đặc trưng như khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, tạo màng, tạo gel, hấp phụ chất màu, khả năng làm trong… nên được ứng dụng nhiều trong công nghiệp chế biến và bảo quản thực phẩm. Ứng dụng tạo màng của chitosan trong bảo quản rau, quả Chitosan có khả năng tạo màng rất tốt. Màng chitosan là một màng bán thấm, do đó nó có khả năng làm thay đổi thành phần các chất khí trong môi trường 14 bảo quản. Với một nồng độ phù hợp, màng chitosan sẽ tạo ra rào cản, ngăn không cho oxy tiếp xúc với bề mặt rau quả nên sẽ hạn chế được quá trình biến nâu của quả; đồng thời hàm lượng CO2 bên trong màng tăng lên sẽ ức chế quá trình hô hấp, giúp hạn chế quá trình tổn thất chất khô. Hơn nữa, do màng chitosan có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm nên sẽ giảm hiện tượng hư hỏng do vi sinh vật, kéo dài thời gian bảo quản của rau quả. Ứng dụng khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của chitosan trong quá trình chế biến, bảo quản thịt, cá Thịt và các sản phẩm từ thịt rất giàu protein và lipit nên rất dễ bị hư hỏng do vi sinh vật và quá trình oxy hóa lipit trong quá trình bảo quản. Chitosan có tính kháng khuẩn và hạn chế quá trình oxy hóa lipit nên được dùng để bảo quản thịt nhằm hạn chế quá trình hư hỏng của thịt (Kamil và cộng sự, 2002; No và cộng sự, 2002). Với khả năng chống oxy hóa, tạo màng, kháng khuẩn, chitosan được sử dụng trong quá trình chế biến và bảo quản các loại cá có chứa nhiều mỡ như cá tra, cá trích… đặc biệt là các sản phẩm ở dạng fillet. Khả năng chống oxy hóa lipit nhờ vào khả năng tạo phức với sắt trong thịt cá và khả năng ngăn cản oxy tiếp xúc với bề mặt cá. Jeon và cộng sự (2002) cho rằng cơ chế chống oxy hóa của chitosan có thể là do hoạt tính tạo phức với các ion kim loại hoặc do chitosan kết hợp với lipit. Ứng dụng chitosan trong công nghiệp sản xuất nước quả trong Trong công nghiệp sản xuất nước quả trong, làm trong là công đoạn quan trọng, ảnh hưởng đến chất lượng của thành phẩm. Chitosan với đặc tính là một keo dương trong dung dịch axit loãng, sẽ thể hiện khả năng keo tụ, tạo bông khi kết hợp với các hợp chất phenol, chất keo và các chất lơ lửng còn lại trong nước quả, làm độ trong của nước quả tăng lên. Chitosan có ái lực tốt đối với các hợp chất polyphenol như catechin, proanthocyanidin, axit cinnamic, và các dẫn xuất của chúng (Perlata và cộng sự, 1989). Ngoài ra, khả năng kháng nấm, kháng khuẩn của chitosan cũng được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất nước quả để ức chế hoạt động gây hư hỏng của nấm men, nấm mốc. Chitosan sử dụng ở nồng độ 0,3 g/L nước quả có khả 15 năng ức chế hoàn toàn nấm mốc trong nước táo sau 13 ngày bảo quản (Roller và Covill, 1999; Rhoaades và Roller, 2000). Ứng dụng khả năng tạo gel của chitosan trong chế biến thực phẩm Nhờ vào đặc tính kháng khuẩn và tạo gel mà chitosan được ứng dụng trong quá trình sản xuất đậu phụ để tăng độ bền gel và kéo dài thời gian bảo quản. Bổ sung 2% chitosan đã làm tăng độ bền gel của đậu phụ (No và Mayers, 2004). Đậu phụ sử dụng chitosan có thể kéo dài thời gian sử dụng hơn 3 ngày so với đậu phụ sử dụng CaCl2. Ngoài ra, chitosan cũng được sử dụng như một chất tạo cấu trúc dẻo, dai cho thực phẩm thay thế cho hàn the. Ứng dụng của chitosan trong nông nghiệp Trong nông nghiệp, chitosan được sử dụng để tăng cường sự hoạt động của các vi sinh vật trong đất, bọc các hạt giống nhằm ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất và tăng khả năng nảy mầm của hạt, kích thích hệ miễn dịch, kích thích sinh trưởng và tăng năng suất thu hoạch. Mục đích sử dụng chitosan bọc hạt giống để chống nấm và kích thích nảy mầm đã được thử nghiệm với lúa, đậu nành và nhiều loại hạt giống khác (Agarwal và Sinclair, 1997; Goulart và cộng sự, 2002). Sau 6 tháng bảo quản, tỉ lệ nảy mầm của các hạt được bọc chitosan cao nhất, đạt 74% so với tỉ lệ nảy mầm của các hạt lúc ban đầu là 90-92% (Sawatwanich và cộng sự, 2007). Chitosan cũng được nghiên cứu thử nghiệm phun lên rau cải (Brassica campestris spp.) cho năng suất thu hoạch cải tăng lên (Wongroung và cộng sự, 2002). Ðồng thời nó còn có tác dụng cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt. Qua nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và các nguyên tố vi lượng lên một số chỉ tiêu sinh lý-sinh hoá của mạ lúa ở nhiệt độ thấp, kết quả cho thấy chitosan vi lượng làm tăng hàm lượng diệp lục tổng số và hàm lượng nitơ, đồng thời các enzyme như amylase, catalase, peroxidase cũng tăng lên và chitosan còn góp phần cải tạo đất khô cằn, bạc màu, giữ ẩm cho cây trồng. Trong thủy sản 16 Chitosan được nghiên cứu ứng dụng nhiều nhiều trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản. Chitin và chitosan được nghiên cứu bổ sung vào thức ăn cho tôm, cá để kích thích sinh trưởng, tăng miễn dịch và cải thiện môi trường ao nuôi (Anderson và Siwicki, 1994; Wanichpongpan và Chandrkrachang, 2002). Ngoài ra, chitosan cũng được ứng dụng làm màng bao, chất kết dính để tăng độ ổn định của thức ăn tôm trong ao nuôi (Trung và Phượng, 2005; Phượng và cộng sự, 2008). Việc nghiên cứu sử dụng chitosan để thu sinh khối vi tảo làm thức ăn cho ngành nuôi trồng thủy sản cũng được nghiên cứu và ứng dụng ở nhiều nước trên thế giới. Trong y học Chitosan đã được ứng dụng trong y học như: chỉ khâu tự tiêu, chất đông máu, làm lành vết thương, da nhân tạo và một số ứng dụng còn đang nghiên cứu như: tác động kích thích miễn dịch chống sự phát triển khối u, đặc tính làm giảm cholesterol, hay nghiên cứu làm thuốc chữa bệnh viêm loét dạ dày, tá tràng… Ngoài ra chitosan còn được dùng để cố định tế bào Saccharomyces cerevisiae để lên men, được bổ sung vào làm nguyên liệu sản xuất giấy, thay hồ tinh bột để hồ vải giúp sợi bền mịn, bóng đẹp, cố định hình in, kết hợp với một số thành phần khác để sản xuất vải chịu nhiệt, vải chống thấm. Trong công nghiệp xử lý nước thải Chitosan được ứng dụng để loại bỏ các ion kim loại nặng trong nước thải như đồng, chì, thủy ngân, crôm.. nhờ các nhóm amin của chitosan có ái lực mạnh và có khả năng tạo phức với các ion kim loại nặng (Knorr, 1983; Kurita và cộng sự, 1986; Kim và cộng sự, 1997; Varma và cộng sự, 2004). Trong ngành chế biến thủy sản, xử lí nước thải là một vấn đề cấp thiết. Tận dụng khả năng tạo kết tủa, tạo bông tốt của chitosan để tận thu protein từ dịch thải máu cá, nước rửa surimi… nhằm sản xuất các sản phẩm giá trị gia tăng và giảm bớt chi phí xử lí nước thải. Ngoài ra, chitosan còn được sử dụng để xử lý chất màu của nước thải từ các nhà máy dệt may nhờ vào khả năng hấp thụ chất màu. 1.2.3. Nguyên lý sử dụng chitosan thu sinh khối vi tảo và ứng dụng trong xử lý nước thải 17 Các chất hữu cơ trong nước thải cũng như tế bào vi tảo trong môi trường nuôi thường tồn tại ở dạng keo và bền. Chitosan là một polyme dương tự nhiên, trên phân tử có nhiều nhóm NH3+. Các chất hữu cơ nói chung và vi tảo là những phần tử mang điện âm. Ứng dụng chitosan trong công nghiệp xử lí nước thải và thu sinh khối vi tảo dựa vào lực tương tác tĩnh điện giữa phân tử chitosan và các hợp chất hữu cơ mang điện âm. Khi chitosan tiếp xúc với các chất hữu cơ tích điện âm sẽ tạo thành những khối có kích thước lớn hơn và lắng xuống nhờ trọng lực. 1.3. Một số phương pháp thu sinh khối vi tảo Hiện nay sinh khối vi tảo có thể được thu hoạch bằng một số phương pháp như: lắng, ly tâm, lọc và sử dụng chất keo tụ (trợ lắng), hoặc kết hợp của những phương pháp này. 1.3.1. Phương pháp lắng Trong phương pháp lắng, lực hấp dẫn khiến các hạt chất lỏng hoặc rắn tách từ chất lỏng có mật độ khác nhau, nhưng quá trình này có thể rất chậm, nhất là khi sự khác biệt mật độ hoặc kích thước hạt nhỏ (Heaven, 2013). Việc làm lắng đọng vi tảo là khác nhau giữa các loài, nhưng cũng có thể biến đổi trong cùng một loài. Mức lắng đọng có thể phụ thuộc vào cường độ ánh sáng (Waite và cộng sự, 1992). Theo Bienfang (1981), sự thiếu hụt về dinh dưỡng có thể làm giảm tỷ lệ lắng tụ. Quá trình lắng còn ảnh hưởng bởi độ tuổi của tế bào, tỉ lệ tế bào lắng sẽ tăng lên đối với các tế bào già đặc biệt là tế bào lão hóa (Smayda, 1970). Tốc độ lắng của vi tảo có kích thước nhỏ trong khoảng 4-5 m trong là không đáng kể (Waite và cộng sự, 1992). Mặc dù có một số ưu điểm, nhưng tới nay phương pháp lắng chưa được sử dụng rộng rãi để thu vi tảo (Uduman và cộng sự, 2010). 1.3.2. Phương pháp ly tâm Phương pháp ly tâm có thể sử dụng để thu hầu hết các loài vi tảo (Mohn, 1988). Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là có chi phí cao. Gudin và Thepenier (1986) ước tính rằng chi phí của quá trình phục hồi có thể chiếm từ 20-30% tổng chi phí sản xuất sinh khối. Chisti (2007) báo cáo rằng chi phí của quá trình thu sinh khối vi tảo chiếm tới 50% chi phí cuối cùng của sản xuất dầu 18 diesel. Hơn nữa, Norsker và cộng sự (2011) tính toán rằng phương pháp ly tâm đòi hỏi một năng lượng đầu vào tương đương với khoảng 50% năng lượng có sẵn trong sinh khối vi tảo thu được. Ngoài ra, quá trình ly tâm có thể gây vỡ tế bào làm ảnh hưởng đến chất lượng của sinh khối vi tảo thu được. 1.3.3. Phương pháp lọc Nhiều loại bộ lọc đã được sử dụng để thu hoạch tảo và phương pháp lọc đã được phát hiện thỏa đáng việc khôi phục tế bào tảo tương đối lớn (Molina Grima và cộng sự, 2003); nhưng cũng có thể bị cản trở bởi băng thông thấp và tắc nghẽn nhanh chóng (Mohn, 1988; Oswald, 1988). Mặc dù có một loạt các thiết kế bộ lọc, bộ lọc màng có thể được chỉ đơn giản là phân loại theo các lỗ hoặc lớp màng kích thước; lọc vĩ mô > 10 m, vi lọc 0,1-10,0 m, siêu lọc 0,02-0,20 m và thẩm thấu ngược < 0,001 m. Và do đó áp lực để buộc chất lỏng thông qua một lớp màng, năng lượng hoạt động cần thiết, thường sẽ tăng lên cùng với việc giảm kích thước lỗ màng, vì phạm vi kích thước của vi tảo thường là giữa 2 và 30 m (Brennan và Owende, 2010; Molina Grima và cộng sự, 2003). Phương pháp siêu lọc là một lựa chọn tốt cho sự phục hồi, đặc biệt là các tế bào rất mỏng manh, nhưng vẫn chưa được sử dụng đối với vi tảo (Mata và cộng sự 2010; Molina Grima và cộng sự, 2003), chi phí vận hành và phí bảo trì rất cao (Mata và cộng sự, 2010). Chất hữu cơ ngoại bào được ghi nhận là dẫn đến tắc nghẽn nhanh chóng của các màng siêu lọc trong phương pháp lọc của Spirulina (Rossi và cộng sự, 2004). 1.3.4. Phương pháp keo tụ Phương pháp keo tụ thường được sử dụng cùng với các phương pháp thu hoạch khác (Brennan và Owende, 2010). Trong phương pháp này, các tế bào tảo kết hợp với nhau làm tăng kích thước, qua đó giúp tăng tỉ lệ lắng đọng hoặc tuyển nổi (Mata và cộng sự, 2010). Phương pháp keo tụ được xem là một phương pháp ưu việt hơn các phương pháp khác vì phạm vi áp dụng rộng rãi, nó có thể sử dụng để thu các vi tảo có kích thước khác nhau (Uduman và cộng sự, 2010). Phương pháp này cũng được chứng minh là phương pháp có chi phí phù hợp để thu vi tảo (Benemann và cộng sự, 1980). Quá trình keo tụ có thể xảy ra một cách tự nhiên ở một số vi tảo, 19 được gọi quá trình tự động tạo bông, vi tảo có thể tập hợp thành từng cục để đáp ứng với áp lực môi trường thay đổi về nitơ, pH và oxy hòa tan (Schenk và cộng sự, 2008; Uduman và cộng sự, 2010). Tuy nhiên, phương pháp keo tụ thường sử dụng các hóa chất có khả năng trợ lắng. Các chất trợ lắng phổ biến nhất được sử dụng trong thu hoạch vi tảo là sắt clorua (FeCl3), nhôm sunfat (Al2(SO4)3) và sắt sunfat (Fe2(SO4)3) (Brennan và Owende, 2010). Ngoài ra, vôi (calcium hydroxide, CaCO3) cũng được sử dụng để loại bỏ chất rắn lơ lửng và vi tảo từ nước thải từ những năm 1920 (Oswald, 1988). Muối kim loại đa hoá trị, sắt clorua, sắt sulfat và nhôm clorua (phèn) thường được sử dụng trong xử lý nước thải để loại bỏ tảo đã cho thấy hiệu quả trong việc làm kết bông cả Chlorella và Scenedesmus (Molina Grima và cộng sự, 2003). Ở điều kiện kết lắng tối ưu về hàm lượng, độ pH và chất lượng nước sau xử lý bùn, muối sắt cho hiệu quả kết lắng thấp hơn so với phèn trong sự kết bông vi tảo (Shelef và cộng sự, 1984). Chất kết bông vô cơ được chứng mình là có thể có ảnh hưởng xấu đến chất lượng vi tảo thu được về khả màu sắc, khả năng sinh trưởng (Molina Grima và cộng sự 2003; Papazi và cộng sự 2010; Schenk và cộng sự, 2008). Chitosan, một polyme hữu cơ cation, có nguồn gốc từ vỏ giáp xác đã được sử dụng trong xử lý nước thải đối với ngành công nghiệp thực phẩm (Harith và cộng sự, 2009). Chitosan đã được chứng minh là có hiệu quả trên một loạt các vi tảo nước ngọt (Harith và cộng sự, 2009; Molina Grima và cộng sự, 2003). Hiện nay các phương pháp trên đều có thể được sử dụng để thu sinh khối vi tảo, tuy nhiên mỗi phương pháp đều có những hạn chế nhất định: - Phương pháp lọc, ly tâm đòi hỏi chi phí đầu tư cao, mặt khác còn ảnh hưởng đến chất lượng sinh khối vi tảo thu được (các chất dinh dưỡng, chất có hoạt tính sinh học bị thất thoát do quá trình ly tâm làm phá vỡ tế bào). - Sử dụng các muối kim loại nặng: các kim loại nặng tồn tại trong sinh khối sau khi thu hoạch sẽ khó ứng dụng làm thức ăn cho động vật, do đó khả năng ứng dụng bị hạn chế. Do đó, việc sử dụng chitosan-một polyme sinh học an toàn, thân thiện với môi trường để thu sinh khối là điều rất cần thiết. 20 1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về thu sinh khối vi tảo 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam, chitosan đã được nghiên cứu trong lĩnh vực xử lý nước thải, nhưng những thông tin liên quan đến việc ứng dụng chitosan để thu sinh khối vi tảo, trong đó có loài Thalassiosira pseudonana, còn rất hạn chế. 1.4.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước Harith và cộng sự (2009) đã nghiên cứu sử dụng các chất trợ keo tụ khác nhau bao gồm chitosan và hệ chất đa điện phân (polyelectrolytes) thương mại Magnafloc (LT 25 và LT 27), trong việc thu sinh khối vi tảo Chaetoceros calcitrans. Kết quả cho thấy hiệu quả thu hồi sinh khối vi tảo phụ thuộc vào pH của môi trường và đạt hiệu suất cao nhất ở pH 8,0 (đối với chitosan) và pH 10,2 (đối với LT 25 và LT 27). Xu và cộng sự (2013) đã sử dụng chitosan như chất trợ keo tụ tự nhiên để thu sinh khối của vi tảo xanh Chlorella sorokiniana. Kết quả cho thấy trên 99% sinh khối của vi tảo được kết lắng ở nồng độ chitosan 2 mg/L và pH nhỏ hơn 7. Sơ bộ đánh giá chi phí tác giả cho rằng sinh khối vi tảo Chlorella sorokiniana thu theo phương pháp sử dụng chitosan thấp hơn so với phương pháp ly tâm và lọc. Tác giả ước tính để thu một tấn sinh khối vi tảo bằng chitosan thì chi phí khoảng 200 USD. Granados và cộng sự (2012) nghiên cứu sử dụng chitosan, một số muối kim loại và hệ chất đa điện phân để thu sinh khối của một số loài vi tảo nước ngọt (Chlorella vulgaris, C. fusca, Scenedesmus sp. và S. subspicatus). Tác giả kết luận rằng hiệu quả thu hồi sinh khối của vi tảo phụ thuộc vào chất trợ keo tụ và nồng độ sử dụng của chúng. Salim và cộng sự (2011) lần đầu tiên sử dụng sinh khối của các loài vi tảo có khả năng trợ keo tụ để keo tụ sinh khối của các loài vi tảo khác. Trong phương pháp này không cần sử dụng các chất trợ keo tụ hóa học. Theo đó, một số loài vi tảo có khả năng sử dụng như một chất trợ keo tụ bao gồm Tetraselmis suecica, S. obliquus và Ankistrodemus falcatus để thu sinh khối của hai loài vi tảo Neocholoris oleobundans 21 và C. vulgaris. Cả ba loài vi tảo sử dụng đều có thể sử dụng như là chất trợ keo tụ. Trong phương pháp này không cần sử dụng các chất trợ keo tụ hóa học. So sánh hiệu quả thu sinh khối vi tảo Nannochloropsis sp. bằng nanochitosan với chitosan được thực hiện bởi Farid và cộng sự (2013). Theo tác giả, nanochitosan cho hiệu quả thu sinh khối vi tảo cao hơn chitosan khoảng 9%. Như vậy, kích thước của chất trợ keo tụ có thể là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả trợ lắng vi tảo. 22 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của đề tài là điều kiện thu sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana bằng chitosan và hoạt tính sinh học của sinh khối vi tảo thu được. 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Vi tảo Thalassiosira pseudonana Vi tảo Thalassiosira pseudonana ở cuối pha tăng trưởng của chu kỳ sinh trưởng được nuôi trồng tại Công ty Uni President-Ninh Phước, Ninh Thuận. Vi tảo Thalassiosira pseudonana được nuôi trong môi trường dinh dưỡng AGP 10%, độ mặn 30‰. Trong quá trình nuôi sục khí 24/24h, nhiệt độ duy trì ở 2632oC, cường độ chiếu sáng 5000 lux, pH được khống chế ở 6,5-7,2. Trong quá trình nuôi có bổ sung 1 số chất đạm. 2.2.2. Chitosan 2 loại chitosan được sử dụng trong đề tài có độ deacetyl 70 và 85 (DD70 và DD85) được sản xuất từ đầu và vỏ tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei tại công ty Longshin-khu công nghiệp Suối Dầu-Cam Lâm-Khánh Hòa. 2.3. Hóa chất Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu là các hóa chất đạt hạng phân tích bao gồm: axit acetic, NaOH, HCl, chitosan (DD70, DD85), nước cất, ethanol, 1,1diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), Na2CO3, thuốc thử Folin-Ciocalteu, axit gallic, giấy quỳ, K3(Fe[CN]6), FeCl3, axit trichloracetic (TCA) và vitamin C. 2.4. Dụng cụ và thiết bị Các thiết bị được sử dụng cho nghiên cứu bao gồm: - Máy ly tâm lạnh - Máy quang phổ UV-VIS - Tủ sấy 23 - Bể ổn nhiệt - Máy đồng hóa - Cân phân tích - Máy lắc Các dụng cụ thí nghiệm khác như: cuvet, cốc thủy tinh, đũa thủy tinh, ống nghiệm, ống đong, cân phân tích, giấy quỳ,… 2.5. Phương pháp nghiên cứu 2.5.1. Xác định hàm lượng ẩm Hàm lượng ẩm của vi tảo được xác định bằng phương pháp sấy ở 105oC. 2.5.2. Xác định điều kiện thu sinh khối vi tảo Điều kiện thu sinh khối được xác định thông qua việc đánh giá hiệu suất kết bông tế bào vi tảo (Flocculation efficiency, FE), hệ số tập trung nồng độ (Concentration factor, CF), tỉ lệ theo thể tích phần chất rắn lắng được (Settleable solid volume fraction, SSVF) (Sirin, 2013) (Hình 2.1). Hiệu suất lắng của vi tảo được xác định bằng cách đo mật độ quang học tế bào tảo trước khi keo tụ và mật độ quang học của phần chất lỏng sau khi keo tụ. Mật độ quang học (Optical desity OD) được đọc bằng máy quang phổ theo phương pháp của Lee và cộng sự (1998). Mật độ quang học của vi tảo Thalassiosira pseudonana được đo bằng máy quang phổ ở bước sóng 450 nm. Hiệu suất lắng được tính bằng công thức: Hiệu suất lắng (%) = (ODđ – ODs)/ODđ x100 ODđ : mật độ quang học của dung dịch tảo trước khi keo tụ ODs : mật độ quang học của phần nước trong sau khi keo tụ Hệ số tập trung nồng độ (CF) được tính bằng công thức: Hệ số tập trung nồng độ (CF) = (h0/hf) x hiệu suất lắng (Lee và cộng sự, 2009). Tỉ lệ theo thể phần chất rắn lắng được (SSVF) được tính bằng công thức: Tỉ lệ theo thể phần chất rắn lắng được (SSVF) = (hf/h0) (Graves và cộng sự, 1979). 24 Hình 2.1. Cách xác định chiều cao cột lắng 2.5.3. Xác định hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học 2.5.3.1. Chuẩn bị dịch chiết 2 g vi tảo tươi (đã tách bớt nước) được chiết bằng 30 ml dung dịch ethanol 95% và được đồng hóa. Hỗn hợp được đem đi ly tâm lạnh với tốc độ 10.000 vòng, trong 10 phút ở 4oC để chuẩn bị cho các test thử. 2.5.3.2. Xác định hàm lượng carotenoid tổng số và chlorophyll Các hợp chất có hoạt tính sinh học trong tế bào vi tảo Thalassiosira pseudonana như chlorophyll a, chlorophyll b, carotenoid tổng số được xác định theo phương pháp của Nayek Sumanta và cộng sự (2014). Phần trong của dịch chiết thu được sau ly tâm lạnh được đem đi đo độ hấp thụ ở các bước sóng 470, 649, 664 nm bằng máy quang phổ kế. Hàm lượng carotenoid tổng số, chlorophyll a và chlorophyll b được xác định theo công thức sau: Cha = 13,36A664 – 5,19 A649 (µg/ml). Chb = 27,43A649 – 8,12 A664 (µg/ml). Cx+c = (1.000A470 – 2,13Cha – 97,63Chb)/209 (µg/ml). Trong đó: A: bước sóng Cha: Chlorophyll a Chb: Chlorophyll b 25 Cx+c: Carotenoid tổng số Kết quả trình bày bởi µg/g nguyên liệu khô. 2.5.3.3. Xác định hàm lượng polyphenol tổng số Hàm lượng polyphenol được xác định theo phương pháp của Singleton và cộng sự (1999) với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Lấy chính xác 0,1 ml dịch chiết trộn với 0,9 ml nước cất. Sau đó cho thêm 1 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu 10% và 2,5 ml Na2CO3 7,5%. Lắc đều hỗn hợp bằng máy Vortex. Hỗn hợp được trong điều kiện tối và nhiệt độ phòng trong vòng 30 phút trước khi đo độ hấp thụ quang học ở bước sóng 760 nm trên máy quang phổ kế (Spectrophotometry, Carry 50, Varian, Australia). Kết quả được báo cáo bởi mg axit gallic/g nguyên liệu khô. Kết quả được báo cáo bởi mg axit gallic/g nguyên liệu khô. 2.5.4. Xác định khả năng chống oxy hóa Khả năng chống oxy hóa của vi tảo được xác định bằng cách xác định khả năng khử gốc tự do DDPH và năng lực khử của dịch chiết tế bào. 2.5.4.1. Xác định khả năng khử gốc tự do DDPH Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH là phương pháp được sử dụng rộng rãi để đánh giá khả năng khử gốc tự do của các mẫu khác nhau (Lee và cộng sự, 2003). Phương pháp bắt gốc tự do 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) được phát minh bởi Blois (1958) 19. DPPH là một gốc tự do bền, có màu tía và có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517 nm. Khi có mặt chất chống oxy hóa, nó sẽ bị khử thành 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazine (DPPH-H), có màu vàng (hình 1.2). Đo độ giảm độ hấp thu ở bước sóng 517 nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxy hóa. 26 2.5.4.2. Xác định tổng năng lực khử Năng lực khử của một chất là khả năng chất đó cho điện tử khi tham gia vào phản ứng oxi hóa khử. Khi xác định năng lực khử ta cũng xác định được năng lực kháng oxy hóa của một chất. Tổng năng lực khử được xác định theophương pháp của Oyaizu (1986) với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Nguyên tắc xác định hoạt tính chống oxy hóa của phương pháp này là dựa trên khả năng của các chất chống oxy hoá trong việc khử phức K3Fe(CN)6 thành phức K4Fe(CN)6, phức này tác dụng với FeCl3 thành KFe[Fe(CN)6] (xanh Pruss) 49. Khi đó, độ tăng cường độ màu xanh tỷ lệ với hàm lượng chất chống oxy hóa có trong nguyên liệu. Mức độ tăng cường độ màu này được đo ở bước sóng 700 nm trong sự so sánh với chất chuẩn là dung dịch axit ascorbic. 2.6. Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.6.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát Vi tảo Bố trí thí nghiệm xác định các điều Thu sinh khối kiện thu sinh khối vi tảo (pH, nồng bằng chitosan độ chitosan, thời gian thu, loại chitosan). Kết quả và Sinh khối vi tảo Bố trí thí nghiệm xác định hàm thảo lượng ẩm, hàm lượng chlorophyll a, luận chlorophyll b, carotenoid tổng số, polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của vi tảo. Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 27 Thuyết minh sơ đồ: Thí nghiệm được thực hiện trên vi tảo Thalassiosira pseudonana đang ở cuối pha tăng trưởng của chu kì sinh trưởng của công ty UNI-President-Ninh Thuận. Thực nghiệm nhằm xác định điều kiện thu cho hiệu suất thu sinh khối vi tảo cao nhất và đánh giá hoạt tính sinh học của sinh khối thu được. Hỗn hợp môi trường nuôi và sinh khối vi tảo (250 ml) được cho vào ống đong 250 ml rồi tiến hành thử nghiệm xác định điều kiện thu sinh khối. Từ sinh khối vi tảo thu được tiến hành đánh giá hoạt tính sinh học thông qua xác định hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học, khả năng chống oxy hóa. 2 g sinh khối vi tảo tươi được chiết bằng 30 ml ethanol 95%, sau đó hỗn hợp dịch chiết được đưa đi ly tâm lạnh với tốc độ 10.000 vòng trong 10 phút ở 4oC. Phần dịch trong được thu lại và đưa đi test. 2.6.2. Xác định loại chitosan Mục đích thí nghiệm: Xác định loại chitosan thích hợp để thu sinh khối vi tảo. Sơ đồ thí nghiệm: Hỗn hợp môi trường nuôi và sinh khối vi tảo Nhóm 1: Chitosan có độ deacetyl 70 Nhóm 2: Chitosan có độ deacetyl 85 Xử lý ở pH 7 (pH môi trường nuôi) với nồng độ chitosan 10 mg/L trong 10 phút Xử lý ở pH 7 (pH môi trường nuôi) với nồng độ chitosan 10 mg/L trong 10 phút Đo độ đục của hỗn hợp trên Đo độ đục của hỗn hợp trên Kết quả và thảo luận Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định loại chitosan 28 Thuyết minh sơ đồ: Thí nghiệm được tiến hành trên ống đong 250 ml. Hỗn hợp gồm môi trường nuôi và sinh khối vi tảo (250 ml) được cho vào ống đong. Sau đó hỗn hợp được xử lý bằng 2 loại dung dịch chitosan có độ deacetyl khác nhau (70 và 85) ở pH môi trường nuôi, nồng độ chitosan 10 mg/L (theo thể tích hỗn hợp tảo và môi trường nuôi) để thu sinh khối vi tảo. Hỗn hợp sau đó được khuấy mạnh trong 30 giây và để ổn định trong 10 phút rồi tiến hành đo độ đục ở bước sóng 450 nm (bước sóng hấp thụ tối đa của hỗn hợp môi trường nuôi và sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana). 2.6.3. Thí nghiệm xác định pH Mục đích nghiên cứu: Xác định được pH thích hợp để thu sinh khối của vi tảo. Sơ đồ thí nghiệm: Hỗn hợp môi trường nuôi và sinh khối vi tảo Thu sinh khối vi tảo bằng dung dịch chitosan có độ deacetyl 70 tại các pH khác nhau pH4 pH5 pH6 pH7 pH8 Đo độ đục của hỗn hợp trên Kết quả và thảo luận Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH pH9 29 Thuyết minh sơ đồ: Thí nghiệm được tiến hành trên ống đong 250 ml. Hỗn hợp môi trường nuôi và sinh khối vi tảo (250 ml) được cho vào ống đong. Dung dịch NaOH 0,1 M và HCl 0,1 M được sử dụng để điều chỉnh pH của môi trường. Sau đó cho dung dịch chitosan có độ deacetyl thích hợp với nồng độ 10 mg/L vào hỗn hợp ở các pH khác nhau từ 4 đến 9. Hỗn hợp được khuấy mạnh trong 30 giây và để ổn định trong 10 phút. Độ đục của hỗn hợp được đo ở bước sóng 450 nm (bước sóng hấp thụ tối đa của hỗn hợp môi trường nuôi và sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana). 2.6.4. Xác định nồng độ chitosan dùng để thu sinh khối vi tảo Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ chitosan thích hợp để thu sinh khối vi tảo. Sơ đồ thí nghiệm: Hỗn hợp môi trường nuôi và sinh khối vi tảo Thu sinh khối vi tảo bằng dung dịch chitosan có độ deacetyl thích hợp với các nồng độ khác nhau tại pH 6 0,8 1,6 2,4 3,2 4,0 5,2 6,0 mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L Đo độ đục của hỗn hợp trên Kết quả và thảo luận Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ chitosan 30 Thuyết minh sơ đồ: Thí nghiệm được tiến hành trên ống đong 250 ml. Hỗn hợp môi trường nuôi và sinh khối vi tảo (250 ml) được cho vào ống đong. Dung dịch NaOH 0,1 M và HCl 0,1 M được sử dụng để điều chỉnh pH của môi trường sau đó được xử lý bằng dung dịch chitosan có độ deacetyl thích hợp với các nồng độ khác nhau tại pH thích hợp. Hỗn hợp sau đó được khuấy mạnh trong 30 giây và để ổn định trong 10 phút. Độ đục của hỗn hợp được đo ở bước sóng 450 nm (bước sóng hấp thụ tối đa của hỗn hợp môi trường nuôi và sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana). 2.6.5. Thí nghiệm xác định thời gian thu sinh khối vi tảo Mục đích thí nghiệm: Xác định thời gian thích hợp để thu sinh khối vi tảo. Sơ đồ thí nghiệm: Hỗn hợp môi trường nuôi và sinh khối vi Thu sinh khối vi tảo bằng chitosan DD70 với nồng độ 4 mg/L, tại pH 6 ở các khoảng thời gian khác nhau 1 1,5 2,5 5 10 15 20 40 60 phút phút phút phút phút phút phút phút phút Đo độ đục của hỗn hợp trên Kết quả và thảo luận Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thu sinh khối vi tảo 31 Thuyết minh sơ đồ: Thí nghiệm được tiến hành trên ống đong 250 ml. Hỗn hợp môi trường nuôi và sinh khối vi tảo (250 ml) được cho vào ống đong. Dung dịch NaOH 0,1 M và HCl 0,1 M được sử dụng để điều chỉnh pH của môi trường. Sau đó hỗn hợp được xử lý bằng dung dịch chitosan với nồng độ 4 mg/L, tại pH 6 trong các khoảng thời gian khác nhau từ 0 đến 60 phút. Hỗn hợp được khuấy mạnh trong 30 giây và tiến hành đo độ đục sau các khoảng thời gian khác nhau ở bước sóng 450 nm (bước sóng hấp thụ tối đa của hỗn hợp môi trường nuôi và sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana). 2.7. Phương pháp phân tích 2.7.1. Xác định hàm lượng ẩm trong tế bào vi tảo Mục đích thí nghiệm: Xác định hàm lượng ẩm và hàm lượng chất khô trong vi tảo. Cốc sấy được sấy đến khối lượng không đổi (khối lượng giữa hai lần liên tiếp sai khác không quá 5x10-4 g). Cân chính xác 2 g tảo tươi cho vào cốc sấy. Chuyển cốc vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 60C trong 2 giờ. Sau đó, nâng nhiệt độ lên 105C, sấy liên tục trong 2 giờ. Mang cốc đi cân lại khối lượng. Hàm lượng ẩm được tính theo công thức: W (%) = [(m1 + mt) – m2]/[(m1 + mt) – m1] x100 Trong đó: W: hàm lượng ẩm (%) m1: khốilượng cốc sấy sau khi sấy đến khối lượng không đổi (g) mt: khối lượng tế bào vi tảo (g) m2: khối lượng cốc sấy + khối lượng vi tảo sau khi sấy ở 105oC (g) 2.7.2. Xác định hàm lượng carotenoid tổng số, hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b Mục đích thí nghiệm: Xác định hàm lượng carotenoid tổng số, hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b trong tế bào vi tảo. 32 Sơ đồ thí nghiệm: Sinh khối vi tảo Chiết trong Ethanol Ly tâm lạnh Lọc thu dịch trong Đo độ hấp thụ Kết quả Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b và carotenoid tổng số Thuyết minh sơ đồ: Cho 30 ml ethanol 95% vào 2 g tế bào vi tảo tươi, dùng máy đồng hóa để phá vỡ tế bào vi tảo và trộn đều hỗn hợp, sau đó đem đi ly tâm lạnh với vận tốc 10.000 vòng, trong 10 phút ở 4oC. Phần dịch trong sau khi lọc được đo độ hấp thụ ở các bước sóng 649, 664, 470 nm bằng máy quang phổ kế. Kết quả được tính theo công thức: Cha = 13,36A664 – 5,19 A649 Chb = 27,43A649 – 8,12 A664 Cx+c = (1.000A470 –2,13Cha – 97,63Chb)/209 Trong đó: A: bước sóng Cha: Chlorophyll a 33 Chb: Chlorophyll b Cx+c: Carotenoid tổng số Kết quả báo cáo là nồng độ sắc tố được tính µg/g nguyên liệu khô. 2.7.3. Xác định hàm lượng polyphenol tổng số Mục đích thí nghiệm: Xác định hàm lượng polyphenol tổng số trong tế bào vi tảo. Sơ đồ thí nghiệm: Nước cất Na2CO3 7,5% Dịch chiết Folin 10% Lắc Ủ 30 phút Đo độ hấp thụ Kết quả Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng polyphenol tổng số Thuyết minh sơ đồ: Lấy chính xác 0,1 ml dịch chiết (0,178 g/ml) trộn với 0,9 ml nước cất. Sau đó cho thêm 1 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu 10% và 2,5 ml Na2CO3 7,5%. Lắc đều hỗn hợp bằng máy Vortex. Hỗn hợp được trong điều kiện tối và nhiệt độ phòng trong vòng 30 phút trước khi đo độ hấp thụ quang học ở bước sóng 760 nm trên máy quang phổ kế (Spectrophotometry, Carry 50, Varian, Australia). Kết quả được báo cáo bởi mg axit gallic/g nguyên liệu khô. 34 2.7.4. Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH Mục đích thí nghiệm: Đánh giá khả năng chống oxy hóa của tế bào vi tảo thu được. Sơ đồ thí nghiệm: Nước cất Dịch chiết Lắc Ủ 30 phút Đo độ hấp thụ Kết quả Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định khả năng khử gốc tự do DPPH Thuyết minh sơ đồ: Thí nghiệm được tiến hành ở các nồng độ mẫu khác nhau (25, 50, 75 và 100 µl), được trộn với nước cất để đạt thể tích tổng cộng 3 ml. Sau đó thêm 1 ml dung dịch DPPH 0,2 mM (pha trong ethanol 99,7%), lắc đều bằng máy lắc và để yên trong bóng tối 30 phút. Độ hấp thụ quang học được đo ở bước sóng 517 nm. Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo công thức sau: DPPH (%) = (ACT – ASP)/ACT × 100 ACT: Độ hấp thu quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết; ASP: Độ hấp thu quang học của mẫu có chứa dịch chiết. Kết quả báo cáo là % khử gốc tự do DPPH và giá trị EC50. 35 2.7.5. Xác định tổng năng lực khử Mục đích thí nghiệm: Xác định khả năng chống oxy hóa của sinh khối tảo thu được. Sơ đồ thí nghiệm: Nước cất Dịch chiết Ủ 30 phút TC A FeCl3 Nước cất Đo độ hấp Kết quả Hình 2.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tổng năng lực khử Thuyết minh sơ đồ: Thí nghiệm được tiến hành ở các thể tích mẫu khác nhau (200, 400, 600, 800 µl) sau đó cho thêm nước cất vào để để đạt được thể tích cuối cùng 1,5 ml trước khi thêm 0,5 ml K3(Fe[CN]6) 1%. Hỗn hợp được ủ ở 50C trong 20 phút. Sau đó thêm 0,5 ml TCA 10% và 2 ml nước cất, cuối cùng cho thêm 0,4 ml FeCl3 0,1%. Độ hấp thụ quang học được xác định tại bước sóng 700 nm (Spectrophotometry, Carry 50, 36 Varian, Australia). Độ hấp thụ quang học càng cao thì năng lực khử càng mạnh. Kết quả báo cáo là độ hấp thụ ở 700 nm và giá trị EC50. Mỗi phân tích được tiến hành lặp lại 2 lần. 2.8. Phương pháp xử lí số liệu Mỗi thí nghiệm lặp lại ít nhất 2 lần. Kết quả được xác định bằng giá trị trung bình độ lệch chuẩn (KQ = TB ± SD). Tính toán số liệu và vẽ đồ thị được thực hiện bằng phần mềm Microsoft Excel phiên bản 2010. So sánh giá trị trung bình được thực hiện bằng phần mềm SPSS phiên bản 16.0. 37 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả xác định điều kiện thu sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana Việc lựa chọn điều kiện thu sinh khối vi tảo phải thỏa mãn được yêu cầu về kĩ thuật, kinh tế và môi trường. 3.1.1. Ảnh hưởng của loại chitosan đến hiệu suất thu hồi sinh khối vi tảo Độ deacetyl, khối lượng phân tử, độ nhớt… là những tính chất quan trọng của chitosan. Những tính chất này ảnh hưởng không những đến hoạt tính sinh học mà còn ảnh hưởng đến hiệu quả kết lắng của nó. Trong nghiên cứu này, 2 loại chitosan có độ deacetyl khác nhau là 70 và 85 (DD70 và DD85) đã được sử dụng. Thí nghiệm được tiến hành ở pH môi trường nuôi (pH 7), nồng độ chitosan 10 mg/L (theo thể tích hỗn hợp tảo và môi trường nuôi) với thời gian lắng 10 phút. Kết quả ảnh hưởng của loại chitosan đến hiệu suất thu hồi sinh khối được thể hiện ở Hình 3.1 và Hình 3.2. Kết quả này bao gồm ảnh hưởng của loại chitosan đến hiệu suất lắng FE, hệ số tập trung nồng độ CF và tỉ lệ thể tích lắng SSVF. Hiệu suất lắng FE, hệ số lắng CF càng lớn và tỉ lệ thể tích lắng SSVF càng nhỏ thì hiệu suất thu hồi sinh khối vi tảo càng cao. Kết quả thực nghiệm cho thấy khi sử dụng 2 loại chitosan đều cho hiệu suất lắng trên 90%, cấu trúc bông tảo tốt được thể hiện qua 2 chỉ số CF và SSVF. Tuy nhiên hiệu suất thu hồi khi sử dụng 2 loại chitosan DD70 và DD85 lại ko có sự khác biệt đáng kể. Cụ thể, hiệu suất kết bông vi tảo khi dùng DD70 là 94,72%, DD85 là 93,79%; chỉ số CF khi dùng DD70 là 0,31, DD85 là 0,30; chỉ số SSVF khi dùng DD70 và DD85 lần lượt là 3,00 và 3,11. Chitosan có độ deacetyl càng cao thì càng có nhiều nhóm NH3+ tích điện dương, khả năng tương tác tĩnh điện với các tế bào vi tảo tích điện âm sẽ càng cao, hiệu suất kết bông sẽ càng cao, hiệu suất thu hồi càng lớn. Tuy nhiên việc sử dụng loại chitosan có độ deacetyl bao nhiêu để hiệu suất thu hồi đạt cao nhất thì còn tùy thuộc vào đặc tính, mật độ tế bào cũng như độ mạnh điện tích bề mặt của vi tảo sử dụng. 38 Kết quả nghiên cứu cho thấy hiệu suất thu hồi sinh khối tảo giữa 2 loại chitosan ko có sự khác nhau đáng kể, nên loại chitosan có độ deacetyl 70 được sử dụng để thu sinh khối tảo Thalassiosira sp. để đảm bảo hiệu quả về mặt kinh tế. DD70 DD85 Hình 3.1. Đánh giá hiệu suất thu hồi khi sử dụng 2 loại chitosan DD70 và DD85 39 CF Hiệu suất lắng 3,25 94,80 3,20(A) 94,60 3,15 94,40 3,10 3,05 94,20 3,00 94,00 2,95 93,80 CF Hiệu suất lắng (%) 95,00 2,90 93,60 2,85 93,40 2,80 93,20 2,75 2,70 93,00 DD 70 DD 85 Loại chitosan 0,35 0,30 SSVF 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 DD 70 DD 85 Loại chitosan Hình 3.2. Ảnh hưởng của loại chitosan đến Hiệu suất lắng và Hệ số lắng (A) và Tỉ lệ phần thể tích lắng (B) 40 3.1.2. Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu hồi sinh khối vi tảo Để nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu hồi sinh khối, các yếu tố khác được giữ cố định bao gồm: 10 mg/L chitosan DD70 và thời gian 10 phút. Thí nghiệm được tiến hành ở các pH môi trường khác nhau từ 4-9. Kết quả của sự ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu hồi được thể hiện ở Hình 3.3 và Hình 3.4. Để đánh giá tổng thể hiệu quả thu hồi sinh khối vi tảo bằng chitosan ở các pH khác nhau, hiệu suất lắng (FE), hệ số tập trung nồng độ (CF) và tỉ lệ phần thể tích lắng (SSVF) được xác định. Kết quả cho thấy pH môi trường nuôi có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất thu hồi vi tảo. Ở pH 4 hiệu suất lắng FE 89,99%, CF 2,00 và SSVF 0,45. Tiếp tục nâng pH môi trường lên pH 5 và 6 thì hiệu suất thu hồi tiếp tục tăng. Cụ thể khi điều chỉnh đến pH 6, hiệu suất lắng FE đạt 94,72%, CF 3,12 và SSVF 0,30. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng pH môi trường lên pH > 6 thì hiệu suất thu hồi lại giảm đáng kể. Cụ thể ở pH 9, hiệu suất kết bông giảm gần 3 lần so với ở pH 6, với hiệu suất kết bông ở pH 9 chỉ còn 34,07% , hệ số CF 1,30 và SSVF 0,26 (p < 0,05). Thông qua hiệu suất lắng bằng việc đo mật độ quang tế bào thì ở pH 4, 5, 6, 7 đều cho hiệu suất lắng gần bằng nhau, nhưng cấu trúc bông tảo lại có sự khác biệt rõ rệt: ở pH 5 và 7 cho hiệu suất tới 91% nhưng cấu trúc bông tảo lại kém, bông không tạo thành cục lớn, liên kết giữa các tế bào tảo kém nên hiệu suất thu hồi ko cao (hệ số SSVF ở pH 6 và 7 lần lượt là 0,30 và 0,36). Như vậy, pH 6 cho hiệu suất thu hồi vi tảo cao nhất trong dải pH nghiên cứu (p < 0,05). Từ kết quả nghiên cứu này cho thấy pH môi trường nuôi có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất thu hồi sinh khối vi tảo. Ở pH 6 cho hiệu suất thu hồi sinh khối cao nhất (p < 0,05). Kết quả này tương tự với nghiên cứu của Xu và cộng sự (2012) khi dùng chitosan để thu hồi sinh khối vi tảo Chlorella sorokiniana, kết quả ở pH 6 cho hiệu suất thu hồi lên tới 99%. Theo Xu và cộng sự (2012), ở pH dưới 7 cho hiệu suất thu hồi lên tới 99%. Hiệu suất thu sinh khối cao ở vùng pH axit yếu có thể được giải thích như sau: ở môi trường pH axit yếu sẽ làm tăng hoạt tính của chitosan từ đó làm tăng hiệu suất thu hồi sinh khối nhờ vào việc giảm độ nhớt của 41 môi trường và làm giảm điện tích trung bình bề mặt của tế bào vi tảo (Morales và cộng sự, 1985), các tế bào vi tảo sẽ dễ dàng tiếp xúc với bề mặt tích điện dương của chitosan thông qua lực tương tác tĩnh điện. Hơn nữa, chitosan có điểm đẳng điện ở pH khoảng pH 6,5 (Cheng và cộng sự, 2011), và chính vì vậy nên chitosan sẽ tích điện dương ở pH 6 nhiều hơn hơn ở pH 7 và những pH cao hơn, điều này làm cho chitosan như là một chất keo tụ dương có hiệu quả ở môi trường axit yếu. Tuy nhiên, báo cáo của Ravi Divakaran và Sivasankara Pillai (2002) cho rằng hiệu quả thu sinh khối của Spirulina, Oscillatoria, Chlorella và Synechocystis cao nhất ở pH7, trong khi nghiên cứu của Cheng và cộng sự (2011) lại cho rằng pH 8,5 là pH tối thích để thu sinh khối Chlorella sorokiniana. Cũng theo Cheng và cộng sự, hoạt tính của chitosan bị ảnh hưởng nhiều bởi độ nhớt, độ mặn và nhiệt độ của môi trường; hàm lượng carbohydrate ở thành tế bào cũng là nguyên nhân chính ảnh hưởng đến hiệu suất kết bông vi tảo; ngoài liên kết tĩnh điện giữa các nhóm tích điện dương trên chitosan và bề mặt tích điện âm của tế bào vi tảo, lực liên kết giữa các ion trong môi trường với các thành phần polysaccharide của tế bào tảo cũng ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất kết bông. Chính vì vậy nên mới có sự khác nhau giữa những nghiên cứu này. 42 pH 4 pH 7 pH 5 pH 8 pH 6 pH 9 Hình 3.3. Đánh giá hiệu suất thu hồi sinh khối ở những pH khác nhau 43 3,50 d d 3,00 2,50 d d b 2,00 1,50 b CF Hiệu suất lắng (%) 100,00 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 (A) CF Hiệu suất lắng 1,00 0,50 0,00 pH4 pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 pH SSVF 0,50 0,45 0,40 d (B) c c b 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 b a 0,05 0,00 pH4 pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 pH Hình 3.4. Ảnh hưởng của pH đến (A) Hiệu suất lắng và Hệ số lắng, (B) Tỉ lệ phần thể tích lắng (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) 44 3.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến hiệu suất thu hồi sinh khối Hình 3.5 và Hình 3.6 mô tả ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến hiệu suất thu hồi sinh khối vi tảo. Nghiên cứu tiến hành ở pH 6 với sự thay đổi nồng độ chitosan từ 0,8 đến 6,0 mg/L (theo thể tích hỗn hợp tảo và môi trường nuôi). Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ chitosan có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất thu hồi sinh khối vi tảo. Khi tăng nồng độ chitosan thì hiệu suất thu hồi sinh khối tăng lên rõ rệt. Ở nồng độ 0,8 mg/L đã cho thấy hiệu quả kết bông, tuy nhiên hiệu suất vẫn rất thấp (< 20%), hệ số tập trung nồng độ CF chỉ đạt 0,17 và tỉ lệ thể tích phần kết bông cực đại (1,00). Khi tăng nồng độ chitosan từ 0,8 lên 3,2 mg/L thì hiệu suất kết bông tăng lên 5 lần, chỉ số CF tăng 12 lần và SSVF giảm xuống 2 lần. Cụ thể: ở nồng độ chitosan 3,2 mg/L hiệu suất kết bông tảo đạt 91,84%, CF 2,09 và SSVF 0,44. Ở nồng độ 4 mg/L, hiệu suất thu hồi vẫn tiếp tục tăng nhẹ. Tiếp tục nâng nồng độ chitosan lên 5,2 và 6,0 mg/L thì hiệu suất kết bông, hệ số CF và SSVF hầu như không có sự thay đổi (p < 0,05). Vì vậy nồng độ chitosan thích hợp để thu sinh khối là 4,0 mg/L. Hiệu suất thu hồi sinh khối tăng nhanh khi bổ sung từ 0,8 đến 4,0 mg/L chitosan, nhưng từ nồng độ 4,0 mg/L trở lên thì hầu như không thay đổi. Khi bổ sung chitosan vào hỗn hợp môi trường nuôi, các nhóm tích điện dương của chitosan sẽ đính lên bề mặt tích điện âm của tế bào vi tảo bằng liên kết tĩnh điện, giữa các tế bào tảo sẽ hình thành cầu nối liên kết chúng lại với nhau để tạo thành hạt có kích thước lớn hơn và bắt đầu lắng xuống nhờ trọng lực. Nồng độ chitosan tăng đồng nghĩa với việc sẽ có nhiều tế bào tảo được kết bông hơn và hiệu suất thu hồi sẽ càng cao. Tuy nhiên, nồng độ thích hợp để đạt hiệu suất mong muốn còn tùy thuộc vào mật độ tế bào tảo trong môi trường nuôi. Nếu mật độ tảo thưa thì lượng chitosan cần bổ sung sẽ thấp và ngược lại. Nếu mật độ tảo thấp mà nồng độ chitosan bổ sung quá cao thì có thể sẽ làm giảm hiệu suất thu hồi sinh khối do thừa nhóm tích điện dương trong dung dịch, chúng sẽ đẩy nhau ra xa, ngăn cản việc hình thành cầu nối giữa các tế bào tảo. 45 0,8 mg/L 3,2 mg/L 1,6 mg/L 4,0 mg/L 2,4 mg/L 6,0 mg/L Hình 3.5. Hình ảnh sinh khối vi tảo thu bằng chitosan ở các nồng độ khác nhau Nhiều nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng nồng độ chitosan có ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi sinh khối vi tảo. Xu và cộng sự (2012) đã báo cáo rằng hiệu suất thu hồi sinh khối Chlorella sorokiniana cao nhất là 10 mg chitosan/g sinh khối khô ở pH 6. Trong khi một nghiên cứu khác của Hyuckjin Kwon và cộng sự (2013) lại 46 cho rằng với nồng độ chitosan 4,0 mg/ml đã cho hiệu suất thu hồi tảo Tetraselmis sp gần đến 90%. Gualteri và cộng sự (1988) đã báo cáo rằng hiệu suất thu sinh khối Euglena gracilis đạt 96-98% khi dùng 200 mg/L chitosan ở pH 7,5. Những sự khác nhau về nồng độ chitosan tối ưu để thu sinh khối vi tảo có thể là do sự khác nhau về đặc điểm giống loài, mật độ tế bào tảo, điều kiện nuôi trồng, pH, nhiệt độ môi trường nuôi, sự khác nhau về thành phần dinh dưỡng, mức độ trưởng thành, chất lượng loại chitosan sử dụng,… Từ thực tế kết quả nghiên cứu, với nồng độ chitosan 4,0 mg/L ở pH 6 thích hợp nhất để thu sinh khối Thalassiosira pseudonana, nồng độ chitosan này thỏa mãn được tính kinh tế, lại đảm bảo được yêu cầu về mặt kĩ thuật. 47 120,0 d e c 80,0 f ef e 3,5 f 3,0 e 2,5 60,0 2,0 d b 1,5 40,0 c 1,0 20,0 0,0 a 0,5 b 0,0 a 0,8 1,6 2,4 3,2 4,0 5,2 6,0 Nồng độ chitosan (mg/L) 1,2 1,0 (B) SSVF 0,8 d 0,6 0,4 b b 4,0 5,2 0,2 0,0 0,8 1,6 2,4 3,2 Nồng độ chitosan (mg/L) 6,0 CF Hiệu suất lắng (%) 100,0 4,0 (A) CF Hiệu suất lắng 48 3.1.4. Ảnh hưởng của thời gian lắng đến hiệu suất thu hồi sinh khối vi tảo Nghiên cứu được tiến hành ở pH 6 với 4 mg/L (theo thể tích hỗn hợp tảo và môi trường nuôi) chitosan DD70. Hình 3.7 và đồ thị Hình 3.8 mô tả ảnh hưởng của thời gian lắng đến hiệu suất thu hồi sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana. Kết quả thực nghiệm cho thấy thời gian lắng có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất thu hồi sinh khối tảo. Trong 2,5 phút đầu sau khi ngừng khuấy, hiệu suất kết bông tảo tăng rất nhanh. Hiệu suất kết bông ở phút thứ 2,5 tăng gấp 2,3 lần so với ở phút thứ nhất từ 40% ở phút thứ nhất lên tới 93% ở phút thứ 2,5; chỉ số SSVF cũng giảm đáng kể, ở phút thứ 2,5 chỉ số SSVF đã giảm tới 1,8 lần so với phút đầu tiên (p < 0,05). Ở phút lắng thứ 5 hiệu suất kết bông tảo vẫn tăng nhẹ, nhưng từ phút thứ 5 trở đi thì hầu như không thay đổi nữa, tuy nhiên các chỉ số CF và SSVF vẫn còn có xu hướng thay đổi. Ở phút lắng thứ 5 chỉ số CF là 2,53 và SSVF là 0,37 nhưng đến phút thứ 10 thì chỉ số CF đã tăng lên 3,12 và chỉ số SSVF giảm xuống còn 0,30. Điều này chứng tỏ hiệu suất thu hồi vẫn còn tăng đến phút thứ 10. Từ phút thứ 10 trở về sau, hiệu suất thu hồi ko có chiều hướng tăng thêm (kết quả từ phút thứ 20 không thể hiện trên biểu đồ). 1,0 phút 1,5 phút 2,0 phút 49 2,5 phút 5,0 phút 10,0 phút 15,0 phút Hình 3.7. Đánh giá hiệu suất thu hồi sinh khối ở những thời gian khác nhau Sau khi tác động lực khuấy làm tăng khả năng tiếp xúc giữa tế bào vi tảo và chitosan thông qua tương tác tĩnh điện, các nhóm tích điện dương của chitosan sẽ đính vào bề mặt tích điện âm của tế bào vi tảo tạo thành các hạt có kích thước lớn hơn và bắt đầu lắng xuống. Cứ như vậy môi trường nuôi sẽ dần dần trong và chiều cao phần lắng sẽ giảm dần, hiệu suất thu hồi sẽ tăng. Nhưng từ phút thứ 10 trở đi thì hầu như hiệu suất kết bông, chỉ số CF và SSVF hầu như không thay đổi nữa. Hiện tượng này có thể là do các phân tử chitosan đã bão hòa số lượng tế bào tảo, không còn nhóm NH2 tích điện dương để tiếp tục kết bông tảo. Thời gian gian để đạt hiệu suất thu hồi mong muốn trong nghiên cứu này là ở phút thứ 10. 50 d d d c d g f 4,0 3,5 3,0 b e a 2,5 2,0 d 1,5 c 1,0 b a CF Hiệu suất lắng FE (%) 100,0 90,0 80,0 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 (A) CF Hiệu suất lắng 0,5 0,0 1,0 1,5 2,0 2,5 5,0 10,0 15,0 SSVF Thời gian (phút) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 f (B) e d c b 1,0 1,5 2,0 2,5 5,0 a a 10,0 15,0 Thời gian (phút) Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian lắng đến Hiệu suất lắng và Hệ số lắng (A) và Tỉ lệ phần thể tích lắng (B) (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) 51 3.2. Kết quả xác định hoạt tính sinh học của vi tảo Thalassiosira pseudonana 3.2.1. Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số, chlorophyll a, chlorophyll b và carotenoid tổng số Nghiên cứu này đã xác định một số hợp chất có hoạt tính sinh học của vi tảo Thalassiosira pseudonana: hàm lượng polyphenol tổng số, chlorophyll a, chlorophyll b và carotenoid tổng số. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.1. Ở nồng độ dịch 0,19 g nguyên liệu khô/ml dịch chiết sinh khối, hàm lượng polyphenol tổng số là 5,67 mg GAE/g nguyên liệu khô; hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b và carotenoid tổng số lần lượt là 8,13, 38,75 và 133,18 µg/g nguyên liệu khô. Hemalatha và cộng sự (2013) cũng đã nghiên cứu xác định hàm lượng polyphenol tổng số trên 3 loài vi tảo Navicula clavata, Chlorella marina và Dunaliella salina với 3 dung môi chiết khác nhau. Theo Hemalatha và cộng sự, sinh khối Chlorella marina chiết bằng methanol cho hàm lượng polyphenol tổng số cao nhất, 0,78 mg GAE/g nguyên liệu khô. Với kết quả này có thể thấy hàm lượng polyphenol tổng số trong vi tảo T. pseudonana cao gấp 7,3 lần so với Chlorella marina. Koen Goiris và cộng sự (2011) đã báo cáo hàm lượng polyphenol của một số loài vi tảo trong nghiên cứu của họ. Theo đó hàm lượng polyphenol của Phaeodactylum tricornutum, Tetraselmis suecica và Nannochloropsis sp. lần lượt là 3,75, 1,71 và 1,39 mg GAE/g nguyên liệu khô, thấp hơn so với hàm lượng polyphenol ở T. psedonana lần lượt 1,51, 3,32 và 4,08 lần. Một nghiên cứu khác của Taweesak Khuantrairong và Siripen Traichaiyaporn (2011) trên loài Cladophora sp. đã báo cáo hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b và carotenoid tổng số lần lượt là 148, 56 và 889 µg/g nguyên liệu khô. Nhìn chung hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b, carotenoid tổng số ở vi tảo Thalassiosira pseudonana đều thấp hơn so với các loài tảo khác được nuôi trồng trên thế giới; tuy nhiên hàm lượng polyphenol tổng số lại cao hơn đáng kể. Sự khác nhau này có thể là do sự khác nhau về đặc điểm giống loài, đặc điểm địa lí, thời gian sinh trưởng, thành phần dinh dưỡng của tế bào và phương pháp thực hiện nghiên cứu. 52 Bảng 3.1. Hàm lượng polyphenol tổng số, chlorophyll a, chlorophyll b và carotenoid tổng số Chỉ tiêu Hàm lượng Polyphenol tổng số (mg GAE/g nguyên liệu khô) 5,67 0,04 Chlorophyll a (µg/g nguyên liệu khô) 8,13 1,28 Chlorophyll b (µg/g nguyên liệu khô) 38,75 5,72 Carotenoid tổng số (µg/g nguyên liệu khô) 133,18 4,53 3.2.2. Khả năng chống oxy hóa của sinh khối vi tảo thu được bằng chitosan Kết quả nghiên cứu trên Bảng 3.1 cho thấy sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana có chứa nhiều hợp chất có khả năng chống oxy hóa như polyphenol, chlorophyll a, chlorophyll b và carotenoid tổng số. Tiếp theo, khả năng chống oxy hóa của của sinh khối thu được được đánh giá theo hai phương pháp khác nhau: tổng năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH, được nghiên cứu. Kết quả thể hiện ở Hình 3.9 (A) và Hình 3.9 (B). Kết quả cho thấy tổng năng lực khử cũng như khả năng bắt gốc tự do DPPH của sinh khối vi tảo thu bằng chitosan tăng lên cùng với nồng độ sử dụng. Ở nồng độ dịch chiết sinh khối là 0,22 mg/ml, tổng năng lực khử là 0,38; trong khi đó giá trị này ở nồng độ 0,89 mg/ml là 0,90. Tương tự, năng lực khử DPPH ở nồng độ 0,03 và 0,14 mg/ml tương ứng là 14,96 và 59,15%. Để đánh giá khả năng chống oxy hóa của sinh khối vi tảo, nghiên cứu này sử dụng axit ascorbic (vitamin C) là một chất đối chứng dương ở cùng nồng độ, để so sánh. Kết quả nghiên cứu thể hiện ở Hình 3.9 (A) và Hình 3.9 (B). Nói chung, khả năng chống oxi hóa của sinh khối vi tảo đánh giá theo cả hai phương pháp, đều thấp hơn so với vitamin C. Ví dụ, năng lực khử tại nồng độ 0,45 mg/ml của sinh khối vi tảo và vitamin C tương ứng là 0,55 và 0,96. Khả năng khử gốc tự do DPPH tại nồng độ 0,07 mg/ml của sinh khối vi tảo là 42,09%; trong khi đó, giá trị này của vitamin C là 65,74%.Để so sánh một cách chính xác khả năng chống oxy hóa của sinh khối vi tảo và vitamin C, giá trị EC50 (nồng độ mà ở đó khả năng khử và bắt gốc tự do đạt 50%) 53 được sử dụng. Kết quả giá trị EC50 của sinh khối vi tảo thu bằng chitosan và vitamin C thể hiện ở Bảng 3.2. Đối với năng lực khử, giá trị EC50 của dịch chiết từ sinh khối vi tảo và vitamin C là 0,37 và 0,15 mg/ml. Như vậy, giá trị EC50 đối với năng lực khử của vitamin cao hơn dịch chiết sinh khối vi tảo 2,5 lần. Tương tự đối với phương pháp đánh giá khả năng khử gốc tự do DPPH, giá trị EC50 của vitamin C là 0,05 mg/ml cao hơn 1,8 lần so với dịch chiết sinh khối vi tảo (0,09 mg/ml). Như vậy, khả năng chống oxy hóa của dịch chiết sinh khối vi tảo thấp hơn so với vitamin C, một trong những chất chống oxy hóa mạnh nhất được biết đến. Sự khác nhau này có thể được giải thích như sau: trong nghiên cứu này sử dụng dịch chiết thô, trong thành phần của dịch chiết có nhiều nhóm không có hoặc có khả năng chống oxy hóa yếu; trong khi đó vitamin C là hợp chất chống oxy hóa mạnh và ở dạng tinh khiết. Nghiên cứu của Simić và cộng sự (2012), sử dụng phương pháp của Oyaizu (1986) để đánh giá tổng năng lực khử của loài tảo lục Trentepohlia umbrina. Theo Simić và cộng sự, ở nồng độ 1 mg/ml sinh khối Trentepohlia umbrina, độ hấp thụ ở 700 nm là 0,06; trong khi với chỉ với 0,22 mg/ml sinh khối Thalassiosira pseudonana, độ hấp thụ ở bước sóng này là 0,38. Theo nghiên cứu của Shanab và cộng sự (2012) về khả năng chống oxy hóa của một số loài vi tảo đã báo cáo khả năng khử gốc tự do DPPH của Nostoc muscorum, Chlorella vulgaris, Anabaena flousaquae và Phormedium fragile ở nồng độ 50,00 mg/ml lần lượt là 70, 68, 72 và 26%; trong khi với nồng độ Thalassiosira pseudonana 0,14 mg/ml, khả năng khử gốc tự do DPPH lên tới 59%. Một nghiên cứu khác của Vlad Enache và cộng sự (2012) trên loài Tetraselmis chuii đã kết luận khả năng chống oxy hóa của loài tảo này khi chiết bằng methanol ở nồng độ 10 mg/ml là 34%. Nghiên cứu của Sasidharan Sreenivasan và cộng sự (2007) về khả năng chống gốc tự do của tảo Gracilaria changii đã kết luận giá trị EC50 khử gốc tự do DPPH của loài tảo này là 14,7 mg/ml (với dung môi chiết là methanol 80%). Một nghiên cứu khác của Simić và cộng sự (2012), sử dụng phương pháp tương tự của Dorman và cộng sự (2004) để thử nghiệm khả năng bắt gốc tự do của loài vi tảo lục Trentepohlia umbrina đã kết luận giá trị EC50 của loài này là 0,67 mg/ml. 54 Như vậy, có thể nói rằng sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana thu bằng chitosan có hàm lượng polyphenol cao hơn cũng như khả năng chống oxy hóa mạnh hơn so với nhiều loài vi tảo khác nuôi trồng trên thế giới. Kết quả này là cơ sở quan trọng để khẳng định tính năng của sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana trong việc sử dụng làm thức ăn giàu dinh dưỡng và các tính năng bảo vệ cơ thể cho tôm nuôi. Bảng 3.2. Giá trị EC50 của sinh khối vi tảo thu bằng chitosan và vitamin C Giá trị EC50 (mg/ml) Chỉ tiêu Khả năng khử gốc tự do DPPH Tổng năng lực khử Sinh khối vi tảo Vitamin C 0,09 0,05 0,37 0,15 55 1,60 Tảo Vitamin C (A) Độ hấp thụ ở 700 nm 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 0,22 0,45 0,67 0,89 Khả năng khử gố tự do DPPH (%) Nồng độ chất khô (mg/ml) 90,0 Vitamin C 80,0 (B) 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 0,03 0,07 0,10 0,14 Nồng độ chất khô (mg/ml) Hình 3.9. Khả năng chống oxy hóa (A) Tổng năng lực khử và (B) Khả năng khử gốc tự do DPPH của sinh khối vi tảo thu bằng chitosan và vitamin C 56 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Để ngành nuôi trồng thủy sản phát triển cả về sản lượng lẫn chất lượng thì vấn đề con giống và nguồn thức ăn là rất quan trọng. Vi tảo với thành phần chất dinh dưỡng và hàm lượng axit béo không no cao, đặc tính dễ tiêu hóa và có khả năng tăng sức đề kháng cho thủy sản chống lại dịch bệnh nên đã được nhiều nước trên thế giới sử dụng làm thức ăn cho thủy sản nuôi: cá, tôm, ốc, nhuyễn thể 2 mảnh vỏ, đặc biệt là ở giai đoạn ấu trùng. Tuy nhiên, việc ứng dụng vi tảo để làm thức ăn cho thủy sản tại các ao nuôi ở Việt Nam vẫn chưa được phổ biến. Nuôi trồng thủy sản là một trong những ngành có tiềm năng phát triển ở nước ta, tuy nhiên những năm gần đây, tình trạng dịch bệnh ở động vật thủy sản thường xuyên xảy ra, đặc biệt là ở tôm. Nguyên nhân có thể là do nguồn nước bị ô nhiễm, nguồn thức ăn nhân tạo không đảm bảo, dẫn đến sức đề kháng của động vật nuôi kém. Thalassiosira pseudonana là một loại tảo cát được phép sử dụng làm thức ăn cho động vật thủy sản và được nuôi nhiều ở nước ta. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu thu nhận sinh khối vi tảo làm thức ăn cho động vật thủy sản bằng nhiều chất kết lắng khác nhau như: chitosan, FeCl3, (Al2(SO4)3), (Fe2(SO4)3)… Tuy nhiên, sinh khối vi tảo thu nhận bằng các muối kim loại cho khả năng ứng dụng thấp do sự tồn tại của các kim loại trong sinh khối sau khi thu ảnh hưởng xấu đến động vật. Sử dụng chitosan-một polyme tự nhiên để thu sinh khối cho chất lượng sinh khối cao nhất, ít làm ảnh hưởng tới pH, vì vậy chi phí xử lý nước sau khi thu sinh khối thấp. Do đó, nghiên cứu này tập trung vào việc sử dụng chitosan để thu nhận sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana tại Ninh Thuận làm thức ăn cho động vật thủy sản nuôi, góp phần nâng cao giá trị của loài vi tảo này, đồng thời tăng hiệu quả kinh tế cho các hộ nuôi. Kết quả nghiên cứu đã xác định được điều kiện thích hợp để thu sinh khối vi tảo với hiệu suất cao nhất là ở môi trường nuôi pH 6, sử dụng 4 mg/L chitosan DD70 trong thời gian 10 phút. Và kết quả nghiên cứu cũng đã xác định được khả năng chống oxy hóa của Thalassiosira pseudonana thông qua xác định hàm lượng polyphenol tổng số, carotenoid tổng số, chlorophyll a, 57 chlorophyll b, tổng năng lực khử và khả năng bắt gốc tự do DPPH. Với kết quả thu được có thể thấy vi tảo Thalassiosira pseudonana tại vùng biển Ninh Thuận có khả năng chống oxy hóa cao, có tiềm năng sử dụng làm thức ăn cho động vật thủy sản, con người cũng như làm thực phẩm chức năng, mỹ phẩm hạn chế tác hại của quá trình lão hóa. Tuy nhiên để có thể đưa kết quả nghiên cứu này vào thực tiễn, những nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào một số hướng sau đây: ngoài những ảnh hưởng của điều kiện lắng (pH, loại chitosan, nồng độ chitosan sử dụng, thời gian lắng) cần tập trung nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện khác như tốc độ khuấy, nhiệt độ, độ mặn môi trường nuôi, dinh dưỡng của tế bào để hiệu suất thu được sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana cao nhất. Nghiên cứu điều kiện chiết (phương pháp chiết, loại dung môi, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu, thời gian chiết) để thu được hàm lượng polyphenol, carotenoid, chlorophyll và khả năng chống oxy hóa cao nhất. Xác định nhóm chất có khả năng chống oxy hóa và tinh chế những nhóm chất này là cơ sở để thương mại hóa sử dụng trong thực phẩm (sử dụng chlorophyll, carotenoid như một chất màu tự nhiên), thực phẩm chức năng (các viên nang, nước uống bổ sung chất chống oxy hóa) cũng như dùng trong mỹ phẩm. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh trong sinh khối vi tảo có chứa hàm lượng lipit rất cao, là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản suất nhiên liệu sinh học thay cho nguồn nhiên liệu hóa thạch đang ngày càng cạn kiệt. Vì thế, có thể dùng sinh khối vi tảo phục vụ cho ngành năng lượng. Ngoài ra, nguồn vi tảo ở nước ta vẫn chưa được khai thác và không có giá trị kinh tế. Vì vậy, tiến hành nghiên cứu điều kiện thu nhận sinh khối, khả năng chống oxy hóa của các loài vi tảo khác nhau, ở các vùng khác nhau và ở những thời điểm khác nhau trong năm là cần thiết để góp phần nâng cao giá trị kinh tế cho người nuôi vi tảo, nâng cao hiệu quả cho ngành nuôi trồng thủy sản, làm cơ sở để phát triển ngành nhiên liệu sinh học và các sản phẩm có giá trị cao. 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: 1. Cái Ngọc Bảo Anh (2010). Ảnh hưởng của dinh dưỡng đến sinh trưởng và quần thể, chất lượng của 3 loài vi tảo (Nannochloropsis oculata, Isochrysis galbana và Tetraselmis chuii) và luân trùng (Brachionus plicatilis). Luận án tiến sĩ nông nghiệp. 2. Nguyễn Văn Bằng, Nguyễn Văn Tuyến (2002). Nghiên cứu một số tính chất Hoá học và vật lý của N-metylenchitosan. Tạp chí Hoá Học và ứng dụng, số 5/2002. 3. Phạm Lê Dũng, Nguyễn Thị Đông, Phạm Thị Mai, Lê Thanh Sơn, Nguyễn Kim Thanh, Võ Thị Thứ, Trịnh Bình, Nguyễn Thị Bình, Bạch Huy Anh, Cao Vân Điểm (2001). Màng chitosan Vinachitin. Tạp chí Hoá Học, Tập 39, số 2. 4. Huỳnh Thị Ngọc Như (2010). Sự thay đổi hình thái tế bào theo chu kỳ tăng trưởng của vi tảo silic Thalassiosira sp. trong môi trường nuôi cấy nước biển nhân tạo. Tạp chí khoa học ĐHSP TP HCM, số 21 2010. 5. Trang Sĩ Trung (chủ biên) và các tác giả khác. Chitin-Chitosan từ phế liệu thủy sản và ứng dụng (2010). NXB Nông nghiệp. 6. PGS.Ts. Vũ Ngọc Út. Vai trò của thức ăn tự nhiên trong nuôi trồng thủy sản. Nguồn UV-Việt Nam. 7. Phan Văn Xuân (2010). Ảnh hưởng của một số yếu tố sinh thái lên sự phát triển của quần thể tảo Thalassiosira sp. nhập nội và thử nghiệm nuôi sinh khối. Luận văn thạc sĩ Đại học Nha Trang. Tài liệu tiếng nước ngoài: 8. Chen G, Zhao L, Qi Y, Cui YL (2014). Chitosan and its derivatives applied in harvesting microalgae for biodiesel production: an outlook. Journal of Nanomaterials, 2014, Article ID 217537. 59 9. Cheng SY, Zheng Y, Labavitch MJ, VanderGheynst SJ (2011). The impact of cell wall carbohydrate composition on the chitosan flocculation of Chlorella. Process Biochemistry 46 (2011) 1927-1933. 10. Enache V al et (2012). Growth, lipid contents and bioactivities of the microalga Tetraselmis chuii in a low-cost, custom-made photobioreactor. TEORA Telemark Open Research Archive. 11. Farid SM, Shariati A, Badakhshan A, Anvaripour B (2012). Using nano-chitosan for harvesting microalga Nannochloropsis sp. Bioresource Technology 131 (2013) 555-559. 12. Godos I, Guzman HO, Soto R (2011). Coagulation/flocculation-based removal of algal-bacterial biomass from piggery wastewater treatment. Bioresource Technology, 102, 923–927. 13. Goiris K, Muylaert K, Fraeye I, Foubert I, Brabanter JD, Cooman DL (2011). Antioxidant potential of microalgae in relation to their phenolic and carotenoid content. 14. Granados M, Acién FG, Gómez C, Fernández-Sevilla JM, Molina Grima E (2012). Evaluation of flocculants for the recovery of freshwater microalgae. Bioresource Technology 118: 102-110. 15. Hemalatha A, Girija K, Parthiban C, Saranya C, Anantharaman P (2013). Antioxidant properties and total phenolic content of marine diatom, Navicula clavata and green microalgae, Chlorella marina và Dunaliella salina. Pelagia Research Library. 16. Harith TZ, Yusoff MF, Mohd S, Mohamed SM, Mohamed Din SM, Ariff BA (2009). Effect of different floculants on the floculation perfomance of microalge, Chaetoceros calcitrans, cells. African Journal of Biotechnology, 59715978. 17. John J, Heaven MS (2012). A review of the harvesting of microalgae for biofuel production. Rev Environ Sci Biotechnol (2013) 12:165-178. 60 18. Kwon H, Lu M, Lee EY, and Lee (2013). Harvesting of microalgae using ùlocculation combined with dissolved air flotation. Biotechnology and Bioprocess Engineering 19: 143-149 (2014). 19. Khuantrairong T and Traichaiyaporn P (2011). Enhancement of carotenoid and chlorophyll content of an edible freshwater alga (Kai: Cladophora sp.) by supplementary inorganic phosphate and investigation of its biomass production. Maejo Int. J. Sci. Technol. 2012, 6(01), 1-11. 20. Prabakaran P, Ravindran AD (2011). A comparative study on effective cell disruption methods for lipid extraction from microalgae. Letters of Applied Microbiology, 53, 150-154. 21. Renault F, Sancey B, Badot PM, Crini G (2009). Chitosan for coagulation/flocculation processes-an eco-friendly approach. European Polymer Journal, 45, 1337–1348. 22. Schenk PM, Thomas-Hall SR, Stephens E (2008). Second generation biofuels: high-efficiency microalgae for biodiesel production. BioEnergy Research, 1, 20-43. 23. Shanab MMS, Mostafa SMS, Shalaby AE, Mahmoud IG (2012). Aqueous extracts of microalgae exhibit antioxidant and anticancer activities. Asian Pac J Trop Biomed. 24. Simić S, Kosanić M, Ranković B (2012). Evaluation of In Vitro Antioxidant and Antimicrobial Activities of Green Microalgae Trentepohlia umbrina. Not Bot Horti Agrobo, 2012, 40(2): 86-91. 25. Sirin S (2013). Pre-concentrtion strategies for microalgae harvesting as biorefinery process chain. Department of Chemical Engineering. 26. Sreenivasan S, Ibrahim D, Kassim NJM (2007). Free radical Scavenging Activity and Total Phenolic Compounds of Gracilaria changii. International Journal of Natural and Engineering Sciences 1 (3): 115-117, 2007. 27. Sumanta N, Choudhury IH, Nishika J and Suprakash R (2014). Spectrophotometric Analysis of Chlorophylls and Carotenoids from Commonly 61 Grown Fern Species by Using Various Extracting Solvents. Research Journal of Chemical Sciences. 28. Uduman N, Qi Y, Danquah MK, Forde GM, Hoadley A (2010). Dewatering of microalgal cultures: a major bottleneck to algae-based fuels. Journal of Renewable and Sustainable Energy, 2, Article ID 012701. 29. Vandamme D, Foubert I, Meesschaert B, Muylaert K (2010). Flocculation of microalgae using cationic starch. Journal of Applied Phycology, 22, 525-530. 30. Xu Y, Purton S, Baganz F (2012). Chitosan flocculation to aid the harvesting of the microalga Chlorella sorokiniana. Bioresource Technology 129, 296-301. PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết quả đo mật độ quang học tế bào của hỗn hợp môi trường nuôi và tảo ban đầu khi chưa bổ sung chitosan Độ hấp thụ ở 450 nm Lần 1 0,4705 Lần 2 0,4697 Trung bình 0,4701 0,0006 Phụ lục 2: Kết quả xác định hàm lượng ẩm Khối lượng Khối lượng Khối lượng cốc sau sấy cốc sau sấy Hàm cốc + mẫu lượng ẩm Hàm lượng chất khô (g) và mẫu (g) sau sấy (g) (%) (%) Lần 1 21,6350 23,6350 22,0095 81,2750 18,7250 Lần 2 21,6660 23,6660 22,0390 81,3500 18,6500 21,6505 23,6505 22,0243 81,3125 18,6875 0,0219 0,0219 0,0209 0,0530 0,0530 Trung bình Phụ lục 3: Kết quả xác định ảnh hưởng của loại chitosan đến hiệu suất thu hồi sinh khối vi tảo Loại Chitosan DD85 Độ hấp thụ ở 450 nm Chiều cao cột lắng (cm) Hiệu suất lắng (%) Concentration factor (CF) Lần 1 Lần 2 0,0286 0,0295 7,0000 6,6000 93,8524 93,7247 DD70 TB 0,0292 0,0004 6,8000 0,2828 93,7886 Lần 1 Lần 2 0,0249 0,0247 6,7000 6,5000 94,7033 94,7458 0,0903 2,9094 3,0816 0,3226 0,3042 2,9955 0,1213 (SSVF) 0,3134 0,0130 0,0248 0,0001 6,6000 0,1414 94,7245 0,0301 3,0673 3,1631 0,3088 0,2995 Tỉ lệ phần thể tích lắng TB 3,1152 0,0677 0,3042 0,0065 Phụ lục 4: Kết quả xác định ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu hồi sinh khối vi tảo pH 4 5 6 7 8 9 Độ hấp thụ ở Lần 1 0,0468 0,0431 0,0249 0,0418 0,2270 0,3115 450 nm Lần 2 0,0473 0,0432 0,0247 0,0428 0,2271 0,3084 Chiều cao cột Lần 1 9,5000 8,2000 6,7000 7,5000 6,5000 5,5000 lắng (cm) Lần 2 10,0000 8,1000 6,5000 8,0000 6,9000 5,9000 Lần 1 90,0447 90,8317 94,7033 91,1083 51,7120 33,7380 Lần 2 89,9383 90,8105 94,7458 51,691 34,3970 89,9910 90,8210 51,7020 34,0670 Hiệu suất lắng (%) TB 0,0752c 0,0150d 94,7245 0,0301e 90,8956 91,0019 0,1504d 0,0150b 0,4663a Concentration Lần 1 2,0568 2,4037 3,0673 2,6361 1,7264 1,3311 Lần2 1,9517 2,4328 3,1631 2,4655 1,6256 1,2651 1,2981 factor (CF) TB 2,4183 3,1152 2,5481 0,1676 0,0744c 0,0206d 0,0677e 0,1206d 0,0712 Lần 1 0,4378 0,3779 0,3088 0,3456 0,2995 0,2535 Lần 2 0,4608 0,3733 0,2995 0,3687 0,3180 0,2719 Tỉ lệ thể tích lắng SSVF 2,0042 0,0467a 0,4493 0,3756 TB 0 , 0163 d 0,0033c 0,3041 0,0065b 0,3571 0,0163c 0,3088 0,0130b 0,2627 0,0130a Phụ lục 5: Kết quả xác định ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến hiệu suất thu hồi sinh khối Nồng độ chitosan (mg/L) 0,8 1,6 2,4 3,2 4,0 5,2 6,0 Độ hấp thụ Lần 1 0,3892 0,2663 0,1128 0,0392 0,0249 0,0295 0,0295 ở 450 nm Lần 2 0,3895 0,2612 0,1083 0,0375 0,0247 0,0306 0,0282 Chiều cao Lần 1 21,7000 15,0000 11,9000 9,7000 6,7000 6,5000 5,5000 Lần 2 21,7000 14,0000 12,0000 9,4000 6,5000 6.7000 5,7000 Lần 1 17,2091 43,3524 76,0051 91,6613 94,7033 93,7257 93,7247 Lần 2 17,1453 44,4375 76,9623 92,0220 94,7468 93,4917 94,0013 cột lắng (cm) Hiệu suất lắng (%) TB 17,1772 0,0451a 43,8949 76,4847 91,8422 94,7245 93,6077 93,863 0,7671b 0,6769c 0,2557d 0,0301e 0,1655ef 0,1955f Concentration Lần 1 0,1721 0,6272 1,3860 2,0506 3,0673 3,1290 3,6979 Lần 2 0,1715 0,6888 1,3917 2,1244 3,1631 3,0280 3,5787 0,1718 0,6580 2,0875 3,1152 3,0785 3,6383 factor (CF) TB 0,0005a Tỉ lệ thể tích 0,0436b 1,3889 0,0041c 0,0522d 0,0677e 0,0714e 0,0843f Lần 1 1,0000 0,6912 0,5484 0,4470 0,3088 0,2995 0,2535 Lần 2 1,0000 0,6452 0,5530 0,4332 0,2995 0,3088 0,2627 0,4401 0,3042 0,3042 0,2581 lắng SSVF TB 1,0000 0,0000f 0,6682 0,0326e 0,5507 0,0033d 0,0098c 0,0065b 0,0065b 0,0065a Phụ lục 6: Kết quả xác định ảnh hưởng của thời gian lắng đến hiệu suất thu sinh khối vi tảo 1,0 phút 1,5 phút 2,0 phút 2,5 phút 5,0 phút 10,0 phút Lần 1 0,2755 0,1818 0,0538 0,0306 0,0255 0,0249 Lần 2 0,2821 0,1921 0,0543 0,0319 0,0269 0,0247 Chiều cao cột Lần 1 19,7000 16,2000 13,3000 10,9000 8,2000 6,7000 lắng Lần 2 19,4000 16,7000 13,9000 10,7000 8,0000 6,5000 Lần 1 41,3955 61,3274 88,5556 93,4910 94,5756 94,7033 Lần 2 39,9915 59,136 88,4493 93,2142 94,2778 94,7458 Độ hấp thụ Hiệu suất lắng (%) TB 40,6935 60,2319 88,5025 93,3525 94,4267 94,7245 Concentration Lần 1 0,45598 0,8215 1,4449 1,8612 2,5028 3,0673 Lần 2 0,4473 0,7684 1,3808 1,8904 2,5573 3,1631 factor (CF) TB Tỉ lệ thể tích 0,4517 0,7950 1,4128 1,8758 2,5300 0,0385e 3,1152 0,0061a 0,0375b 0,0453c 0,0206d 0,0677f Lần 1 0,9078 0,7465 0,6129 0,5023 0,3779 0,3088 Lần 2 0,8940 0,7696 0,6406 0,4931 0,3687 0,2995 phần lắng SSVF 0,9009 0,7581 0,6267 0,4977 0,3733 0,3042 TB 0,0098f 0,0163e 0,0196d 0,0065c 0,0065b 0,0065a 15 phút 20 phút 25 phút 40 phút 60 phút Lần 1 0,0293 0,0295 0,0294 0,0294 0,0292 Lần 2 0,0289 0,0275 0,0268 0,0275 0,0271 Chiều cao cột Lần 1 6,0000 6,0000 6,0000 6,0000 6,0000 lắng (cm) Lần 2 6,2000 6,2000 6,2000 6,2000 6,2000 Lần 1 93,7673 93,7247 93,7460 93,7460 93,7886 Lần 2 93,8524 94,1502 94,2991 94,1502 94,2353 93,8098 93,9375 94,0225 93,9481 94,0119 0,0602d 0,3008d 0,3911d 0,2858d 0,3159d Độ hấp thụ Hiệu suất lắng (%) TB Concentration Lần 1 3,3913 3,3897 3,3905 3,3905 3,3920 Lần 2 3,2848 3,2953 3,3005 3,2953 3,2982 factor (CF) 3,3380 3,3425 TB Tỉ lệ thể tích 3,3455 0,0752g 0,0668g 0,0636g Lần 1 0,2765 0,2765 Lần 2 0,2857 0,2857 3,3429 3,3451 0,0673g 0,0663g 0,2765 0,2765 0,2765 0,2857 0,2857 0,2857 phần lắng SSVF TB 0,2811 0,0065a 0,2811 0,0065a 0,2811 0,0065a 0,2811 0,0065a 0,2811 0,0065a Phụ lục 7: Kết quả xác định hàm lượng Chlorophyll a, Chlorophyll b và Carotenoid tổng số trong vi tảo Độ hấp thụ ở các bước sóng (nm) 664 Độ hấp thụ Hàm lượng Chlorophyll a 649 470 Lần 1 Lần 2 Lần 1 Lần 2 0,0165 0,0162 0,0207 0,0243 0,3989 0,3920 Lần 1 9,0400 Lần 2 7,2240 (µg/g nguyên liệu khô) TB Hàm lượng Lần 1 34,7040 Chlorophyll b Lần 2 42,8000 8,1320 1,2841 (µg/g nguyên liệu khô) TB Hàm lượng Lần 1 136,3840 Lần 2 129,9840 Carotenoid tổng số (µg/g nguyên liệu khô) TB 38,7520 133,1840 5,7247 4,5255 Lần 1 Lần 2 Phụ lục 8: Xây dựng đường chuẩn axit gallic Để xác định hàm lượng poyphenol tổng, ta dựng đường chuẩn axit gallic. Cách tiến hành xây dựng đường chuẩn axit gallic như sau: Cho vào 7 ống nghiệm, mỗi ống 0,1 ml dung dịch axit gallic với các nồng độ lần lượt cho mỗi ống là: 0,05; 0,10; 0,25; 0,50; 0,75; 1,00 và 1,50 mg/ml. Sau đó cho 0,9 ml nước cất vào mỗi ống, rồi cho tiếp 1 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu (10%) và 2,5 ml Na2CO3 7,5%. Lắc đều rồi để phản ứng xảy ra trong tối 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó lấy ra đo bước sóng ở 760 nm trên máy quang phổ kế (Spectrophotometry, Carry 50, Varian, Australia). Mỗi phân tích được tiến hành lặp lại hai lần, kết quả báo cáo là giá trị trung bình độ lệch chuẩn. Độ hập thụ ở bước sóng 760 nm Phụ lục 9: Đường chuẩn axit Gallic 1,6 y = 0,891x + 0,069 R² = 0,992 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0,0 0,5 1,0 Nồng độ axit gallic (mg/ml) 1,5 2,0 Phụ lục 10 : Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số Nồng độ sinh khối khô Độ hấp thụ ở ổng số 760 nm khô) (g/ml) Lần 1 Lần 2 Lần 1 0,1318 0,1325 5,6386 Lần 2 TB 0,1870 5,7015 5,6701 0,0445 Phụ lục 11: Kết quả xác định tổng năng lực khử của sinh khối tảo thu bằng chitosan Nồng độ chất khô (mg/ml) Độ hấp thụ ở 700 nm EC50 0,2200 0,4500 0,6700 0,8900 Lần 1 0,3846 0,5489 0,7468 0,9016 Lần 2 0,3830 0,5537 0,7441 0,9024 Trung 0,3838 0,5513 0,7455 0,9020 bình 0,0011 0,0034 0,0019 0,0006 Lần 1 0,3720 Lần 2 0,3715 (mg/ml) Trung bình 0,3718 0,0004 Phụ lục 12: Kết quả xác định khả năng khử gốc tự do DPPH của sinh khối vi tảo thu bằng chitosan Nồng độ chất khô Khả năng khử gốc tự do Độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm DPPH (%) (mg/ml) Mẫu 1 0,0344 Mẫu 2 0,1372 0,1380 Control Control 1 2 0,1664 0,1572 Lần 1 Lần 2 17,5481 12,2137 Trung bình 14,9567 3,7719 0,0688 0,0951 0,0923 0,1664 0,1572 42,8485 41,1850 42,0890 1,1056 0,1031 0,0712 0,0698 0,1664 0,1572 57,2115 55,5980 56,4277 1,1410 0,1375 0,0649 0,0673 0,1664 0,1572 60,9976 57,1883 59,1471 2,6936 Lần 1 EC50 (mg/ml) Lần 2 Trung bình 0,0883 0,0936 0,0910 0,0037 Phụ lục 13: Kết quả xác định tổng năng lực khử của vitamin C Nồng độ chất khô (mg/ml) Độ hấp thụ ở 700 nm 0,11 0,22 0,45 0,67 0,89 Lần 1 0,4426 0,7358 0,9572 1,3508 1,4803 Lần 2 0,4662 0,7254 0,9714 1,3619 1,4912 Trung bình EC50 (mg/ml) 0,4544 0,0167 0,7306 0,0074 0,9643 0,0100 Lần 1 0,1467 Lần 2 0,1523 Trung bình 1,3564 0,1495 0,0040 0,0078 1,4858 0,0077 Phụ lục 14: Kết quả xác định khả năng khử gốc tự do DPPH của vitamin C Nồng độ Khả năng khử gốc tự do Độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm DPPH (%) chất khô (mg/ml) 0,0344 Mẫu 1 Mẫu 2 0,1082 0,1013 Control Control 1 2 0,1664 0,1572 Lần 1 Lần 2 3,7821 35,5598 Trung bình 34,6710  1,2570 0,0688 0,0578 0,0521 0,1664 0,1572 64,6267 66,8575 65,7421  1,5774 0,1031 0,0417 0,0393 0,1664 0,1572 74,4798 75,0000 74,7399  0,3678 0,1375 0,0289 0,0246 0,1664 0,1572 82,3133 84,3511 83,3322  1,4409 Lần 1 EC50 (mg/ml) Lần 2 Trung bình 0,0532 0,0492 0,0512 0,0028 [...]... dương (NH3+ và NH2) có khả năng hấp thu những vi sinh vật tích điện âm, trong đó có vi tảo Với những đặc điểm này, chitosan được xem là chất trợ lắng 4 tiềm năng có thể sử dụng để thu sinh khối vi tảo, giúp giảm chi phí và nâng cao chất lượng của sinh khối thu được Trên thế giới đã có một số nghiên cứu sử dụng chitosan để thu sinh khối vi tảo: Xu và cộng sự (2012) đã dùng chitosan để thu sinh khối Chlorella... này đã được công bố, tuy nhiên dữ liệu về các hoạt chất sinh học như các hợp chất polyphenol, chlorophyll, carotenoid và khả năng chống oxy hóa trong loài vi tảo này vẫn còn rất hạn chế Xuất phát từ những lý do trên tôi thực hiện đề tài Nghiên cứu sử dụng chitosan để thu nhận sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana và đánh giá khả năng chống oxy hóa của sinh khối vi tảo thu được 2 Mục tiêu của đề... Scenedesmus sp và S subspicatus) Tác giả kết luận rằng hiệu quả thu hồi sinh khối của vi tảo phụ thu c vào chất trợ keo tụ và nồng độ sử dụng của chúng Salim và cộng sự (2011) lần đầu tiên sử dụng sinh khối của các loài vi tảo có khả năng trợ keo tụ để keo tụ sinh khối của các loài vi tảo khác Trong phương pháp này không cần sử dụng các chất trợ keo tụ hóa học Theo đó, một số loài vi tảo có khả năng sử dụng. .. vi tảo Thalassiosira pseudonana bằng chitosan 1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của loại chitosan đến hiệu suất thu hồi sinh khối; 1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu hồi sinh khối; 1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chitosan; 5 1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lắng Mục tiêu 2: Xác định hàm lượng polyphenol, carotenoid, chlorophyll và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của sinh khối vi tảo. .. học về vi c sử dụng chitosan để thu sinh khối vi tảo nuôi trồng ở Vi t Nam Kết quả cũng cung cấp dữ liệu khoa học về thành phần, hàm lượng một số chất có hoạt tính sinh học và khả năng chống oxy hóa của sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana thu bằng chitosan 4.2 Ý nghĩa thực tiễn - Sử dụng chitosan để thu sinh khối vi tảo sẽ giúp giảm chi phí và nâng cao chất lượng sinh khối, do đó đề tài thành công... hợp để thu nhận sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana bằng chitosan; (2) Xác định hàm lượng polyphenol, carotenoid, chlorophyll và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana thu được bằng chitosan 3 Nội dung nghiên cứu Ðể thực hiện các mục tiêu nghiên cứu trên, đề tài thực hiện những nội dung sau đây: Mục tiêu 1: Xác định điều kiện thích hợp để thu nhận sinh khối. .. hiệu quả thu sinh khối vi tảo cao hơn chitosan khoảng 9% Như vậy, kích thước của chất trợ keo tụ có thể là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả trợ lắng vi tảo 22 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của đề tài là điều kiện thu sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana bằng chitosan và hoạt tính sinh học của sinh khối vi tảo thu được 2.2... hiệu quả thu hồi sinh khối vi tảo phụ thu c vào pH của môi trường và đạt hiệu suất cao nhất ở pH 8,0 (đối với chitosan) và pH 10,2 (đối với LT 25 và LT 27) Xu và cộng sự (2013) đã sử dụng chitosan như chất trợ keo tụ tự nhiên để thu sinh khối của vi tảo xanh Chlorella sorokiniana Kết quả cho thấy trên 99% sinh khối của vi tảo được kết lắng ở nồng độ chitosan 2 mg/L và pH nhỏ hơn 7 Sơ bộ đánh giá chi... thì có khả năng hấp phụ chất màu, kim loại cũng như khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, tạo màng cao hơn so với các mẫu chitosan có độ deacetyl thấp hơn Ngoài các tính chất trên thì chitosan còn có khả năng chống oxy hóa Khả năng chống oxy hóa của chitosan phụ thu c vào độ deacetyl, phân tử lượng và độ nhớt của chitosan Chitosan có độ nhớt thấp thì khả năng chống oxy hóa cao 1.2.2 Ứng dụng của chitosan. .. Thuyết minh sơ đồ: Thí nghiệm được thực hiện trên vi tảo Thalassiosira pseudonana đang ở cuối pha tăng trưởng của chu kì sinh trưởng của công ty UNI-President-Ninh Thu n Thực nghiệm nhằm xác định điều kiện thu cho hiệu suất thu sinh khối vi tảo cao nhất và đánh giá hoạt tính sinh học của sinh khối thu được Hỗn hợp môi trường nuôi và sinh khối vi tảo (250 ml) được cho vào ống đong 250 ml rồi tiến hành ... chống oxy hóa loài vi tảo hạn chế Xuất phát từ lý thực đề tài Nghiên cứu sử dụng chitosan để thu nhận sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana đánh giá khả chống oxy hóa sinh khối vi tảo thu được ... nano -chitosan để thu sinh khối vi tảo Nannochloropsis sp… Tuy nhiên chưa có công trình nghiên cứu công bố vi c sử dụng chitosan để thu sinh khối vi tảo Thlassiosira pseudonana T pseudonana loại vi tảo nuôi... lượng sinh khối thu Trên giới có số nghiên cứu sử dụng chitosan để thu sinh khối vi tảo: Xu cộng (2012) dùng chitosan để thu sinh khối Chlorella sorokiniana, Farid cộng (2012) dùng nano -chitosan để