BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG KHOA COÂNG NGHEÄ THÖÏC PHAÅM ÑAØO THÒ TRUÙC GIANG NGHIEÂN CÖÙU SÖÏ THAY ÑOÅI HOAÏT TÍNH CHOÁNG OÂXY HOÙA CUÛA TOÛI (ALLIUM SATIVUM) PHAN RANG THEO THÔØI GIAN LEÂN MEN ÑOÀ AÙN TOÁT NGHIEÄP ÑAÏI HOÏC Chuyeân ngaønh: Coâng ngheä thöïc phaåm NHA TRANG – NAÊM 2015 BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG KHOA COÂNG NGHEÄ THÖÏC PHAÅM ÑAØO THÒ TRUÙC GIANG NGHIEÂN CÖÙU SÖÏ THAY ÑOÅI HOAÏT TÍNH CHOÁNG OÂXY HOÙA CUÛA TOÛI (ALLIUM SATIVUM) PHAN RANG THEO THÔØI GIAN LEÂN MEN ÑOÀ AÙN TOÁT NGHIEÄP ÑAÏI HOÏC Chuyeân ngaønh: Coâng ngheä thöïc phaåm Giaùo vieân höôùng daãn: TS. NGUYEÃN THEÁ HAÂN NHA TRANG – NAÊM 2015 i LỜI CẢM ƠN Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Nguyễn Thế Hân và TS. Nguyễn Văn Minh đã tận tình hướng dẫn và góp ý cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Công nghệ thực phẩm đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt khóa học. Em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể cán bộ Trung tâm thí nghiệm thực hành, Trường Đại học Nha Trang đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã luôn quan tâm và hỗ trợ tốt về tinh thần, vật chất để em có thể thực hiện tốt đề tài. Nha Trang, ngày 21 tháng 06 năm 2015 Sinh viên Đào Thị Trúc Giang ii PHIẾU ĐÁNH GIÁ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Đào Thị Trúc Giang Lớp: 53CNTP3 Ngành: Công nghệ thực phẩm Khoa: Công nghệ thực phẩm Tên chuyên đề: Nghiên cứu sự thay đổi hoạt tính chống oxy hóa của tỏi Phan Rang (Allium Sativum) theo thời gian lên men. Số trang: 55 Số chương: 04 Số tài liệu kham khảo: 50 Hiện vật: 01 quyển đồ án + 01 đĩa CD NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................. Kết luận: ................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................. Khánh Hòa, ngày ……tháng……năm 2015 ĐIỂM Bằng số Bằng chữ CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ký và ghi rõ họ tên) TS. Nguyễn Thế Hân iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i PHIẾU ĐÁNH GIÁ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ............................................................. ii MỤC LỤC................................................................................................................. iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................... vi DANH MỤC CÁC BẢNG....................................................................................... vii DANH MỤC CÁC HÌNH....................................................................................... viii LỜI MỞ ĐẦU .............................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.......................................................................................4 1.1. Tổng quan về tỏi ...............................................................................................4 1.1.1. Nguồn gốc, tên gọi .....................................................................................4 1.1.2. Thành phần trong tỏi ..................................................................................6 1.1.3. Một số công dụng của tỏi ...........................................................................8 1.1.4. Tình hình sản xuất và tiêu thụ tỏi ...............................................................9 1.2. Khái quát về lên men tỏi .................................................................................10 1.3. Giới thiệu về tỏi đen .......................................................................................10 1.3.1. Tỏi đen là gì..............................................................................................10 1.3.2. Những biến đổi của tỏi sau khi lên men...................................................11 1.3.3. Một số tác dụng sinh học của tỏi đen .......................................................13 1.3.4. Tình hình sản xuất và tiêu thụ tỏi đen ......................................................16 1.4. Tình hình nghiên cứu về tỏi đen .....................................................................17 1.4.1. Nghiên cứu ngoài nước ............................................................................17 1.4.2. Nghiên cứu trong nước ...........................................................................18 1.5. Khái quát về gốc tự do và chất chống oxy hóa...............................................19 1.5.1. Gốc tự do ................................................................................................19 1.5.2. Chất chống oxy hóa..................................................................................19 1.5.2.1. Cơ chế hoạt động của các chất chống oxy hóa ..................................19 iv 1.5.2.2. Một số chất chống oxy hóa ................................................................23 1.5.3. Một số phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa ..........................27 1.5.3.1. Phương pháp dựa vào tổng năng lực khử ..........................................27 1.5.3.2. Phương pháp khử gốc tự do DPPH....................................................27 1.5.3.3. Phương pháp TEAC...........................................................................28 1.5.3.4. Phương pháp ORAC ..........................................................................28 1.5.3.5. Phương pháp TRAP ...........................................................................29 1.5.3.6. Phương pháp FRAP ...........................................................................29 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............................30 2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu .................................................30 2.2. Vật liệu, hóa chất nghiên cứu .........................................................................30 2.2.1. Nguyên liệu tỏi .........................................................................................30 2.2.2. Hóa chất....................................................................................................30 2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................31 2.3.1. Quy trình lên men sản xuất tỏi đen ..........................................................31 2.3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ..........................................................32 2.3.3. Phương pháp phân tích .............................................................................33 2.3.3.1. Phương pháp xác định hàm lượng nước ...........................................33 2.3.3.2. Phương pháp xác định hàm lượng tro...............................................34 2.3.3.3. Phương pháp xác định hàm lượng acid tổng .....................................34 2.3.3.4. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số .....................34 2.3.3.5. Phương pháp xác định khả năng khử gốc tự do DPPH................................ 34 2.3.3.6. Phương pháp xác định tổng năng lực khử .........................................34 2.3.4. Phương pháp xử lí số liệu.........................................................................35 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................36 3.1. Sự thay đổi màu sắc của tỏi theo thời gian lên men .......................................36 3.2. Sự thay đổi hàm lượng nước của tỏi theo thời gian lên men..........................37 3.3. Sự thay đổi hàm lượng tro của tỏi theo thời gian lên men .............................39 3.4. Sự thay đổi hàm lượng acid tổng của tỏi theo thời gian lên men ..................40 v 3.5. Sự thay đổi hàm lượng polyphenol tổng số của tỏi theo thời gian lên men ...42 3.6. Sự thay đổi hoạt tính chống oxy hóa của tỏi theo thời gian lên men .............45 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN.................................................50 TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................51 PHỤ LỤC....................................................................................................................1 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT SAC: S-allyl cysteine GAE: Garlic acid equivalents GSAC: g-glutamyl-S-allyl cysteine SOD: Superoxid dismutase CAT: catalase GPx: Glutathione peroxidase DPPH: 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazine TEAC: Trolex equivalent antioxidant capacity ABTS+: [2,2-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)] ORAC: Oxygen radical-trapping absorbance capacity TRAP: Total radical-trapping antioxidant potential FRAP: Ferric reducing-antioxidant power vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại khoa học của tỏi ..........................................................................4 Bảng 1.2. Giá trị dinh dưỡng của tỏi ..........................................................................7 Bảng 1.3. Tổng hàm lượng acid amin của tỏi tươi và tỏi đen...................................12 Bảng 1.4. Hàm lượng polyphenol của một số loại trái cây và rau............................25 Bảng 1.5. Sự thay đổi hàm lượng polyphenol tổng số của tỏi theo thời gian lên men........26 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Củ tỏi ...........................................................................................................5 Hình 1.2. Cây tỏi .........................................................................................................5 Hình 1.3. Sự hình thành allicin từ alliin......................................................................8 Hình 1.4. Sự thay đổi chỉ số TBARS của chuột khi sử dụng tỏi và tỏi đen..............16 Hình 1.3. Một số sản phẩm từ tỏi đen .......................................................................17 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình lên men sản xuất tỏi đen..................................................31 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu sự biến đổi của một số thành phần hóa lý và hoạt tính chống oxy hóa của tỏi theo thời gian lên men. .................................32 Hình 3.1. Sự thay đổi màu sắc của tỏi theo thời gian lên men.................................36 Hình 3.2. Sự thay đổi hàm lượng nước của tỏi theo thời gian lên men ....................38 Hình 3.3. Sự thay đổi hàm lượng tro của tỏi theo thời gian lên men........................40 Hình 3.4 Sự thay đổi hàm lượng acid tổng của tỏi theo thời gian lên men ..............41 Hình 3.5. Sự thay đổi hàm lượng polyphenol tổng số theo thời gian lên men .........42 Hình 3.6. Sự thay đổi khả năng khử gốc tự do DPPH (A) và tổng năng lực khử (B) của tỏi theo thời gian lên men ...................................................................................45 Hình 3.7. Mối tương quan giữa hàm lượng polyphenol tổng số với khả năng khử gốc tự do DPPH (A) và tổng năng lực khử (B).........................................................48 1 LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Ở Việt Nam, tỏi được trồng khá phổ biến trải dài khắp các tỉnh trên cả nước với sản lượng tỏi hàng năm ước đạt hàng nghìn tấn. Một số loài tỏi có chất lượng cao như tỏi Lý Sơn, tỏi Hà Nội, tỏi Phan Rang,... đã khẳng định được vị trí trên thị trường trong nước, được người tiêu dùng ưa chuộng và đánh giá cao. Tỏi Việt Nam cũng đã được xuất bán ra một số thị trường nước ngoài như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản,...tuy nhiên với sản lượng chưa cao và chủ yếu ở dạng tươi hoặc phơi khô, do vậy giá bán không cao, làm giảm giá trị kinh tế của tỏi. Hơn nữa, việc bảo quản sản phẩm tỏi tươi cũng gặp nhiều khó khăn, tổn thất trong quá trình bảo quản khá lớn gây nhiều thiệt hại về kinh tế cho người trồng cũng như người chế biến. Bên cạnh đó, tỏi tươi có mùi và vị đặc trưng (khó chịu), không thích hợp với nhiều người tiêu dùng cũng làm giảm lượng tiêu thụ tỏi, mặc dù khoa học đã chứng minh tỏi có rất nhiều tác dụng tốt đối với sức khỏe con người. Xuất phát từ những lý do trên, việc nghiên cứu sản xuất ra các sản phẩm mới từ tỏi nhằm nâng cao giá trị cho cây tỏi, sản phẩm có thể sử dụng rộng rãi bởi đa số đối tượng người tiêu dùng (không có mùi và vị khó chịu) là một yêu cầu cấp bách. Sản phẩm tỏi đen được coi là một trong những sản phẩm có giá trị kinh tế và giá trị dược học cao được sản xuất từ tỏi tươi nhờ quá trình lên men trong điều kiện có sự kiểm soát về nhiệt độ và độ ẩm. Sản phẩm tỏi đen đã được nghiên cứu sản xuất và sử dụng rộng rãi trên thế giới như tại Nhật Bản, Hàn Quốc và Trung Quốc. Tác dụng của tỏi đen đã được khoa học chứng minh và được kiểm chứng trong thực tế. Tuy nhiên, các công bố của các nhà khoa học ngoài nước về các chỉ tiêu hóa lý và hoạt tính chống oxy hóa của tỏi đen chỉ thích hợp cho đối tượng tỏi nguyên liệu được trồng tại những nước này với những điều kiện lên men khác nhau. Tại Việt Nam, tỏi đen đã bước đầu được nghiên cứu bởi TS. Vũ Bình Dương và các học viên của Học viện Quân y trên đối tượng tỏi Lý Sơn. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu vẫn chưa được công bố rộng rãi trên các tạp chí khoa học. Hơn nữa, với mỗi loài tỏi khác nhau chúng có thành phần hóa lý và hoạt tính chống oxy hóa khác nhau, đòi hỏi phải có nghiên cứu riêng 2 phù hợp. Trong nghiên cứu này lựa chọn tỏi Phan Rang để tiến hành nghiên cứu, vì đây là loài tỏi có chất lượng cao và được người tiêu dùng ưa chuộng; đặc biệt chưa có một công bố nào về hoạt tính chống oxy hóa của tỏi đen từ nguồn nguyên liệu này. Xuất phát từ những vấn đề trên, trong nghiên cứu này tiến hành “Nghiên cứu sự thay đổi hoạt tính chống oxy hóa của tỏi (Allium sativum) Phan Rang theo thời gian lên men”. 2. Mục tiêu đề tài Xác định được sự thay đổi hoạt tính chống oxy hóa của tỏi theo thời gian lên men. 3. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 3.1. Đối tượng nghiên cứu Tỏi Phan Rang được lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu trong đề tài này: - Tên khoa học: Allium sativum - Tên Tiếng Việt: Tỏi - Tên Tiếng Anh: Garlic 3.2. Phạm vi nghiên cứu Xác định sự thay đổi hoạt tính chống oxy hóa của tỏi theo thời gian lên men thông qua việc đánh giá sự thay đổi một số thành phần hóa lý và hoạt tính chống oxy hóa của tỏi ở từng ngày lên men. 4. Nội dung nghiên cứu - Nguyên liệu tỏi tươi được tiến hành xác định một số thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa, đây là yếu tố nghiên cứu đầu vào làm căn cứ để so sánh với sản phẩm đầu ra. - Xác định sự thay đổi hàm lượng nước của tỏi theo thời gian lên men. - Xác định sự thay đổi hàm lượng tro của tỏi theo thời gian lên men. - Xác định sự thay đổi hàm lượng acid tổng của tỏi theo thời gian lên men. - Xác định sự thay đổi hàm lượng polyphenol tổng số của tỏi theo thời gian lên men. - Xác định sự thay đổi hoạt tính chống oxy hóa của tỏi theo thời gian lên men. 3 5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 5.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là nguồn tài liệu tham khảo có giá trị cho giảng viên và sinh viên ngành Công nghệ thực phẩm về một số thành phần hóa lý và hoạt tính sinh học của tỏi đen được lên men từ tỏi Phan Rang. 5.2. Ý nghĩa thực tiễn Thành công của đề tài sẽ cung cấp cơ sở khoa học về giá trị y dược của tỏi đen, góp phần nâng cao độ tin cậy của người tiêu dùng đối với tỏi đen, mở rộng thị trường tiêu thụ trong nước và tiến tới xuất khẩu. Qua đó nâng cao giá trị cho cây tỏi, nâng cao hiệu quả kinh tế cho người chế biến và người trồng tỏi, đặc biệt tạo được thương hiệu tỏi đen Phan Rang cho tỉnh Ninh Thuận, góp phần phát triển kinh tế, tạo công ăn việc làm và ổn định xã hội. 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về tỏi 1.1.1. Nguồn gốc, tên gọi Tỏi (Allium sativum) là một loài trong chi Hành tây (Allium) có nguồn gốc ở Trung Á sau đó lây lan sang Trung Quốc, Cận Đông và khu vực Địa Trung Hải và hiện nay đang được trồng khắp nơi ở Châu Á, Châu Âu [15]. Các nhà thực vật học gọi tỏi là Allium sativum L hoặc Allium sativum. Ở mỗi quốc gia, vùng miền khác nhau có cách gọi tỏi khác nhau, như Đại toán (Trung Quốc), Ail (Pháp), Garlic (Anh),…Ngoài ra, tiếng Latinh gọi tỏi là Olere – có nghĩa là ngửi thấy, tiếng Hy Lạp là “halesstai” là “nhảy vọt ra” để mô tả sự tăng trưởng nhanh chóng các tép tỏi trong một củ. Năm 1877, Picter dùng từ “Celtic all” có nghĩa là “ấm áp, làm nóng, đốt nóng” để nói về cây tỏi [12]. Tỏi đã được sử dụng hàng ngàn năm cho mục đích ẩm thực và làm thuốc. Theo lịch sử ghi lại, tỏi được sử dụng như chất khử trùng để ngăn chặn hoại tử trong Thế chiến I, Thế chiến II [15]. Tỏi còn được dùng cho những người xây Kim tự tháp để tăng cường sức khỏe, người Hy Lạp cổ đại và vận động viên La Mã được sử dụng tỏi trước những sự kiện thể thao. Phân loại khoa học Tỏi được phân loại khoa học như sau: Bảng 1.1. Phân loại khoa học của tỏi [51] Giới Plantae Ngành Magnoliophyta Lớp (class) Liliopsida Bộ (ordo) Asparagales Họ (famalia) Hành (Alliaceae) Phân họ (subfamilia) Hành (Allioideae) Tông (tribus) Hành (Allieae) Chi (genus) Hành tây (Allium) Loài (species) Tỏi (Allium sativum) (Nguồn: Trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam) 5 Hình 1.1. Củ tỏi Trong loài A. sativum, có 2 phân loài (giống): Tỏi ta: A. sativum var sativum. Tỏi tây: A. sativum var ophioscorodon. Đặc tính thực vật học Hình 1.2. Cây tỏi Tỏi là loài cây thân thảo, có căn hành (thân rễ) [11]. Thân thật của tỏi rất ngắn, đã thoái hóa, nằm sát ngay dưới thân giả (thân củ). Trên thân thật có mầm sinh dưỡng và sinh thực. Những mầm này được che phủ 6 bởi những bẹ lá dày mọng nước. Thân củ cây tỏi gồm một số nhánh (Tép) được liên kết với nhau bởi những màng mỏng. Lá thật đầu tiên của tỏi là một lá mầm, sau khi nảy mầm được 10-15 ngày tùy theo điều kiện thời tiết mà lá tỏi có dạng hình bản bằng phẳng. Phần dưới là bẹ ôm sát chồi bên trong (Tép tỏi); phần phiến lá bên trên cứng, thẳng, dài 15-50cm, rộng 1-2,5cm, có rãnh khía, mép lá hơi ráp. Ở mỗi nách lá phía gốc có một chồi nhỏ sau này phát triển thành một Tép tỏi, các Tép này nằm chung trong một cái bao (do các bẹ lá trước tạo ra) thành một củ tỏi tức là thân hành của tỏi. Tỏi có hoa mọc thành cụm trên đầu một trục hình trụ từ thân củ kéo dài ra. Hoa tỏi thuộc hoa đầu trạng, hoa có 6 lá dài, 6 nhụy và 6 nhị. Hoa có màu trắng xám hoặc đôi khi phớt tím hoặc hồng. Vòi nhụy rất bé, bầu thượng có 3 ngăn nếu được thụ phấn đủ thì sẽ cho 6 hạt. Hoa xếp thành tán ở ngọn thân trên một cán hoa dài 55 cm hay hơn. Hoa lưỡng tính, thụ phấn nhờ côn trùng. Hoa nở vào tháng 5-7. Rễ tỏi thuộc loại rễ chùm, phát triển kém tập trung chủ yếu ở lớp đất mặt, khả năng chịu hạn kém. Rễ tỏi có nhiều sợi dài phân nhánh yếu, chúng được bao phủ bởi một lượng lớn lông hút. Tỏi có 1 hạt, quả ra tháng 9-10. 1.1.2. Thành phần trong tỏi Thành phần dinh dưỡng của tỏi gồm có carbohydrat, protein, chất béo, chất xơ, các vitamin như B1, B2, B3, B5, B6, C,…và các nguyên tố khoáng như Ca, Mg,…Trong đó, hàm lượng carbohydrat chiếm khoảng 33% trong 100g tỏi. Bên cạnh đó, tỏi còn chứa các hợp chất lưu huỳnh như: alliin, allicin, ajoene, polysulfides diallyl, vinyldithiins, S- allylcystein,…có hoạt tính sinh học cao. 7 Bảng 1.2. Giá trị dinh dưỡng của tỏi [15] Theo phân tích của Bộ Nông nghiệp Hoa Kì Tỏi tươi Giá trị dinh dưỡng 100g Năng lượng 623 kJ (149 kcal) Carbohydrat 33.06 g Đường 1.00 g Chất xơ thực phẩm 2.1 g Chất béo 0.5 g Protein 6.39 g -beta-caroten 0.5 µg (0%) Thiamin (Vit.B1) 0.2 mg (15%) Riboflavin (Vit.B2) 0.11 mg (7%) Niacin (Vit.B3) 0.7 mg (5%) Acid pantothenic (Vit.B5) 0.596 mg (12%) Vitamim B6 1.235 mg (95%) Acid folic (Vit.B9) 3 µg (1%) Vitamin C 31.2 mg (32%) Canxi 181 mg (18%) Sắt 1.7 mg (14%) Magie 25 mg (7%) Mangan 1.672 mg (84%) Photpho 153 mg (22%) Kali 401 mg (9%) Natri 17 mg (1%) Kẽm 1.16 mg (12%) Selen 14.2 µg Tỉ lệ phần trăm theo lượng hấp thụ của người lớn. (Nguồn: Cơ sở dữ liệu USDA) 8 Theo một số phân tích khác, thành phần trong củ tỏi có khoảng 65% là nước, 28% cacbohydrat, 2% protein, 1,5% chất xơ và 0,15% lipid [42]. 1.1.3. Một số công dụng của tỏi Lá và cụm hoa tỏi được dùng làm rau. Ở châu Âu và Trung Đông, lá và cụm hoa đôi khi được dùng làm rau ăn sống hay xào nấu, có hương vị như hành, ít cay nồng so với củ tỏi. Củ tỏi được dùng làm rau gia vị nhờ hương vị đặc trưng cay nồng của nó. Tỏi được dùng làm thuốc: Theo Đông y: củ tỏi có vị cay, tính ôn, hơi độc, vào hai kinh Can, Vị, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, sát khuẩn, giải phong, sát trùng, chữa khí hư, tiểu tiện khó, bụng trướng đầy, tiêu nhọt, đờm và hạch ở phổi,…Mỗi ngày ăn 1-2 nhánh tỏi rất tốt cho sức khỏe. Theo Tây y: Tác dụng kháng khuẩn: Vào năm 1944, Chester J.Cavallito đã phát hiện trong tỏi có chứa allicin, là một hợp chất kháng sinh và kháng nấm (phitoncide). Trong quá trình bảo quản, enzym alliinase có sẵn trong tỏi sẽ chuyển hóa alliin thành allicin. Allicin dễ bị mất khi đun nấu, là 1 chất kháng sinh tự nhiên rất mạnh, mạnh hơn cả penicillin [26]. Hình 1.3. Sự hình thành allicin từ alliin [31] 9 Dịch chiết thô của tỏi có khả năng chống lại cả vi khuẩn Gram (-) và Gram Helicobactor pilory ở nồng độ 2-5 mg/ml [39]. Tuy nhiên, tác dụng này sẽ bị giảm khi xử lý nhiệt tỏi. Ngoài ra, theo Nguyễn Thanh Hải và Bùi Thị Tho (2013), sử dụng cả 7 loại dung môi để chiết tỏi (gồm nước cất, acid acetic 5%, ethanol 35%, ethanol 70%, methanol 70%, axeton 70%, axetonitrile 70%) đều cho kết quả diệt vi khuẩn E. coli 044 (phân lập từ phân gia cầm bị tiêu chảy),… [5]. Tác dụng phòng chống các bệnh tim mạch: Cholesterol LDL, huyết áp và các tác nhân oxy hóa trong cơ thể người tăng huyết áp có thể được giảm bằng cách bổ sung tỏi. Theo Sangeetha và Darlin (2006), cho thấy rằng tỏi có thể làm giảm peroxit lipit [46]. Hằng ngày, nếu sử dụng 1-2 tép tỏi có thể làm giảm 9% cholesterol. Ngoài ra, tỏi còn có tác dụng phòng chống ung thư dạ dày, ung thư da; cải thiện hệ xương,… 1.1.4. Tình hình sản xuất và tiêu thụ tỏi Hiện nay, tỏi được trồng phổ biến trên 90 quốc gia ở châu Á, châu Mĩ, châu Á và châu Đại Dương. Tuy nhiên, diện tích tập trung nhiều nhất ở các quốc gia: Trung Quốc, Ấn Độ, Banglades, Nga và Hàn Quốc. Những năm gần đây, diện tích, năng suất và sản lượng tỏi liên tục tăng, trong đó diện tích trồng tỏi ở châu Á là lớn nhất. Theo thống kê của tổ chức FAO (2007), diện tích trồng tỏi trên toàn thế giới là 1.072.000 ha và sản lượng đạt 11,8 triệu tấn, trong đó sản lượng ở khu vực châu Á là 10,4 triệu tấn, chiếm 88,1% so với tổng sản lượng trên thế giới. Đến năm 2010, diện tích trồng tỏi trên toàn thế giới đã tăng lên 1.199.929 ha, với tổng sản lượng 17.674.893 tấn/năm. Trong đó, Trung Quốc là nước sản xuất tỏi với sản lượng khoảng 13.664.069 tấn/năm (chiếm hơn 77,3% sản lượng trên toàn thế giới), tiếp đến là Ấn Độ và Hàn Quốc. Tại Việt Nam, tỏi thường được trồng ở các tỉnh phía Bắc và Duyên hải miền trung. Riêng ở tỉnh Ninh Thuận, tỏi là sản phẩm nổi tiếng được người dân cả nước biết đến. Tỏi được trồng tập trung tại các xã Vĩnh Hải, Thanh Hải, Nhơn Hải của huyện Ninh Hải; phường Mỹ Hải, Văn Hải, Mỹ Bình của thành phố Phan Rang- 10 Tháp Chàm và một số vùng của huyện Thuận Bắc. Tổng diện tích trồng tỏi toàn tỉnh hiện nay là 216 hecta cho sản lượng tỏi tươi hằng năm trên 1500 tấn/năm. Tuy nhiên, trong tỉnh chưa có cơ sở sản xuất tỏi, do đó tỏi sau khi thu hoạch được bán dưới dạng tỏi tươi hoặc tỏi đã phơi khô. Bên cạnh đó, thực hiện chương trình hỗ trợ doanh nghiệp về khoa học và công nghệ giai đoạn 2011-2015 đã được UBND tỉnh ban hành tại Quyết định số 1323/QĐ-UBND ngày 15/06/2011. Ngày 19/09/2013, Cục sở hữu trí tuệ đã có Quyết định số 51716/QĐ-SHTT, cấp giấy chứng nhận đăng kí nhãn hiệu số 212580 cho tỏi Phan Rang. Ngoài ra, tỏi còn được trồng ở các vùng nổi tiếng như Lý Sơn (Quảng Ngãi), Kim Môn (Hải Dương), Gia Lâm (Hà Nội),… 1.2. Khái quát về lên men tỏi Lên men là quá trình trao đổi chất, qua đó các chất hữu cơ bị biến đổi dưới tác dụng của enzym vi sinh vật. Bản chất của quá trình lên men là quá trình oxy hóa khử sinh học [9]. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men: Nhiệt độ ảnh hưởng đến cấu trúc protein, enzym do đó ảnh hưởng đến hoạt động của enzym và hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật. Ngoài ra, nhiệt độ môi trường lên men còn có tác dụng trên các phương diện sau: - Tốc độ tạo thành và giải phóng sản phẩm. - Trạng thái vật lí của hệ thống. - Đảm bảo lọc chất lỏng khỏi sinh khối dễ dàng hơn [9]. Lên men tỏi là quá trình trao đổi chất, xảy ra các biến đổi về thành phần hóa lý và các hoạt tính sinh học trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ. Trong một thời gian nhất định cho ra sản phẩm tỏi đen có giá trị về mặt dinh dưỡng và y tế. 1.3. Giới thiệu về tỏi đen 1.3.1. Tỏi đen là gì Tỏi đen là sản phẩm lên men tự nhiên từ tỏi tươi hay còn gọi là tỏi trắng, trong điều kiện kiểm soát chặt chẽ nhiệt độ và độ ẩm, không sử dụng hóa chất, phụ gia và các nguyên liệu khác. Tỏi đen có giá trị dinh dưỡng và sinh học rất cao. 11 Hàn Quốc là nước đầu tiên làm ra tỏi đen nhờ vào kinh nghiệm dân gian. Nhật Bản là nước tiêu thụ tỏi đen hàng đầu thế giới. Tỏi đen có ở Việt Nam cách đây vài năm, đầu tiên do TS. Vũ Bình Dương (Học viện Quân Y) nghiên cứu đề tài về ứng dụng tại Việt Nam và được sản xuất thử nghiệm thành công. Sau đó, được các trung tâm nghiên cứu, các doanh nghiệp sản xuất và bán rộng rãi trên khắp cả nước. 1.3.2. Những biến đổi của tỏi sau khi lên men Sự biến đổi một số thành phần hóa học của tỏi Hàm lượng carbohydrat, lipit, protein ở trạng thái cân bằng, dễ hấp thụ, có đầy đủ 18 acid amin. Hàm lượng carbohydrat của tỏi có xu hướng tăng trong thời gian lên men. Sự thay đổi này là do trong quá trình lên men, đường saccarose thủy phân thành các đường đơn glucose và fructose dưới ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ cao, đồng thời lượng acid tổng tăng trong thời gian lên men làm cho pH giảm, tạo điều kiện thuận lợi cho phản ứng thủy phân xảy ra. Theo Choi và cộng sự (2014) cho thấy hàm lượng carbohydrat của tỏi tăng khoảng 6 lần trong thời gian lên men, từ 2,73 g/kg (ở ngày lên men thứ 7) đến 16,07 g/kg (ở ngày lên men thứ 35) và nhiều số liệu cao hơn so với hàm lượng carbohydrat của tỏi tươi là 1,52 g/kg [28]. Theo nghiên cứu khác của Wang và cộng sự (2010), hàm lượng cacbohydrat trong tỏi tươi là 28,7%, sau khi tỏi được lên men trong điều kiện nhiệt độ 65-80 ºC và độ ẩm 70-80% thì hàm lượng này trong tỏi ở ngày thứ 40 là 47,0% [50]. Kết quả này cho thấy hàm lượng carbohydrat (glucose, fructose, sucrose và maltose) trong tỏi đen tăng cao hơn so với tỏi tươi và nó liên quan đến vị ngọt của tỏi đen. Hàm lượng lipid của tỏi sau khi lên men thấp hơn so với tỏi tươi. Lên men ở nhiệt độ cao và thời gian kéo dài đã làm tăng tốc độ oxy hóa lipid trong tỏi, do đó hàm lượng lipid giảm dần theo thời gian lên men. Thành phần acid amin trong tỏi đen có sự thay đổi đáng kể. Theo Kim và cộng sự (2012), sau khi lên men trong 40 ngày ở điều kiện 60-70 ºC và độ ẩm 8595%, kết quả thu được như bảng sau (Bảng 1.3) 12 Bảng 1.3. Tổng hàm lượng acid amin của tỏi tươi và tỏi đen [37] (Đơn vị: mg/100 g chất khô) Acid amin Tỏi tươi Tỏi đen Alanine 102,02±6,61 174,37±2,01 Arginine 1543,65±15,78 1371,23±2,05 Aspartate 785,84±18,43 1064,27±8,66 Cysteine 295,24±5,08 381,86±14,86 Glutamate 1493,30±5,10 1835,57±21,33 Glycine 226,23±11,48 354,02±10,30 Histidine 319,19±5,42 796,62±7,01 Isoleucine 169,41±11,58 204,25±0,11 Leucine 318,31±14,16 432,64±6,84 Lysine 400,23±7,77 284,22±7,34 Methionine 47,20±3,92 66,60±1,08 Phenylalanine 188,99±11,67 238,33±0,81 Proline 1029,04±6,42 438,93±0,91 Serine 282,62±6,25 327,84±9,58 Threonine 381,72±12,39 220,99±0,13 Tyrosine 166,87±15,43 190,38±4,28 Valine 298,20±10,98 375,82±7,81 Total 8048,01±33,31 8757,94±103,45 (Nguồn: Theo Kim và cộng sự, 2012) Hàm lượng chất chống oxy hóa cao hơn tỏi tươi nhiều lần, đặc biệt là polyphenol, S-allyl cysteine (SAC),…và có giá trị dinh dưỡng gấp 3-5 lần tỏi tươi. SAC là 1 acid amin chứa lưu huỳnh được hình thành bởi các dị hóa của gglutamylcysteine và chúng có tác dụng chống oxy hóa. Theo Bae và cộng sự (2013), mẫu tỏi được lên men 45 ngày, sự biến đổi hàm lượng SAC trong quá trình lên men ở các nhiệt độ khác nhau thì khác nhau, mẫu tỏi lên men ở nhiệt độ thấp hơn sẽ có hàm lượng SAC cao hơn: hàm lượng SAC của mẫu tỏi lên men ở 40 ºC là 13 124,67 mg/g, trong khi mẫu tỏi lên men ở 85 ºC chỉ có 85,46 mg/g. Theo đó, cho thấy nhiệt độ lên men góp phần làm tăng hàm lượng SAC ban đầu, sau đó, sự biến đổi hàm lượng SAC có thể do các yếu tố khác như do sự giảm của alliin đã được chứng minh ở các nghiên cứu khác [24]…Theo Wang và cộng sự (2010), tỏi sau khi lên men 40 ngày ở nhiệt độ 65-80 ºC và độ ẩm 70-80%, hàm lượng SAC tăng gấp 8 lần so với tỏi tươi [50]. Sự biến đổi về cảm quan của tỏi sau khi lên men Màu sắc: màu đen. Sự biến đổi cường độ màu nâu của tỏi theo thời gian lên men có liên quan chặt chẽ đến phản ứng biến nâu phi enzym dưới tác dụng của nhiệt như phản ứng Maillard, phản ứng oxy hóa polyphenol. Vị: có vị ngọt chua dịu của hoa quả. Do hàm lượng carbohydrat tăng dần theo thời gian lên men. Mùi: không còn mùi hăng cay của tỏi, có hương thơm. Ở tỏi tươi có mùi hăng cay khó chịu là do các hợp chất sunfur gây ra và xử lý nhiệt là phương pháp phổ biến để loại bỏ chúng. Qúa trình lên men xảy ra đã chuyển hóa các hợp chất này thành các hợp chất chống oxy hóa tan trong nước như S-allyl cysteine, tetrahydro-β -carbolines, alkaloid,… [28]. Bên cạnh đó, mùi thơm đặc trưng của tỏi đen còn được tạo ra nhờ aldehyt sinh ra từ phản ứng Maillard. Trạng thái: mềm dẻo. Hàm lượng ẩm của tỏi giảm dần trong thời gian lên men nên tỏi đen có trạng thái mềm dẻo. Tỏi đen có thời gian bảo quản dài. 1.3.3. Một số tác dụng sinh học của tỏi đen Bảo vệ cơ thể chống ung thư và giảm cholesterol trong máu: Sau quá trình lên men, hợp chất S-allylcysteine và một dẫn xuất của amino acid cysteine (hợp chất trong tỏi tươi) đã tăng lên rất nhiều lần. Hai hợp chất này có thể làm giảm cholesterol và giảm nguy cơ bệnh ung thư. SAC được hình thành từ quá trình thủy phân g-glutamyl-S-allyl cysteine (GSAC) bởi enzyme g-glutamyl transpeptidase (Amagase và cộng sự, 2001; Bae và cộng sự, 2014) [19] [24], là một trong những hợp chất acid amin chứa lưu huỳnh chính được cho là có nhiều tác dụng tốt đối với 14 sức khỏe. Bên cạnh đó, tỏi đen chứa etan acid sunfonic Thio ethyl este và diallyl trisufide có thể ngăn chặn sự hình thành nitrosamine trong dạ dày. Ngoài ra, tỏi đen có chứa các chất xơ hòa tan, có thể thúc đẩy nhu động đường ruột, hấp thụ những chất gây ung thư, có khả năng làm giảm tỷ lệ mắc ung thư trực tràng,… Bảo vệ cơ thể chống nhiễm trùng: Allicin trong tỏi đen có tác dụng chống vi khuẩn, virus và hàng loạt các vi sinh vật gây bệnh. Một số chất bay hơi trong tỏi đen cũng có vai trò quan trọng trong việc ức chế hoặc tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh. Ngoài ra, ở tỏi đen, hợp chất S-allyl cysteine có tác dụng hỗ trợ sự hấp thụ allicin, giúp cho sự hấp thụ và chuyển hóa allicin dễ dàng hơn, do đó thúc đẩy khả năng tự bảo vệ cơ thể chống lại vi khuẩn, virus xâm nhập và nhiễm trùng. Ổn định lượng đường trong máu: Tỏi đen có tác dụng điều chỉnh lượng đường trong máu. Tỏi đen có chứa glycine có tác dụng làm giảm lượng đường huyết trong máu, phòng ngừa và điều trị bệnh tiểu đường. Bên cạnh đó, tỏi đen cũng chứa các S-metyl cysteine sulfoxid và S-allyl cysteine sulfoxid, sunfua này có khả năng ức chế G-6-P enzym NADPH để ngăn chặn sự tàn phá insulin, có tác dụng làm giảm đường huyết. Ngoài ra, allicin và vitamin B1 trong tỏi kết hợp với nhau tạo thành Thiamine, một acid amin chống mỏi mệt, thúc đẩy sự phân hủy của đường, kiểm soát sự gia tăng lượng đường trong máu. Theo Miao và cộng sự (2014), tỏi đen có tác dụng chống chứng tăng huyết áp và hạn chế sự hình thành gốc tự do [43]. Chống oxy hóa, cải thiện làn da: Tác dụng chống oxy hóa của tỏi đen rất cao nhờ các chất chống oxy hóa. Dẫn xuất Tetrahydro-β-carboline trong tỏi đen được xem như chất có khả năng chống ôxy hóa cao [28]. Bên cạnh đó, tỏi đen còn có các công dụng khác như: bảo vệ gan, chống các bệnh đường hô hấp, tăng cường khả năng sinh lý,… Theo TS. Vũ Bình Dương và cộng sự (2015) nghiên cứu về tính an toàn của dịch chiết tỏi đen Lý Sơn trên thực nghiệm với mục tiêu đánh giá độc tính cấp (ĐTC) và độc tính bán trường diễn (ĐTBTD) của dịch chiết tỏi Lý Sơn lần lượt trên chuột nhắt và thỏ. Tiến hành đánh giá ĐTC của dịch chiết tỏi đen Lý Sơn trên chuột 15 nhắt dùng đường uống theo phương pháp của Abrham WB, Turner A; đánh giá ĐTBTD trên thỏ, thỏ được uống dịch chiết tỏi đen hằng ngày liều 2 g/kg/24 giờ và 4 g/kg/24 giờ trong 42 ngày. Kết quả chưa tìm thấy LD50, với liều uống tối đa mà chuột có thể uống được (10 g/kg thể trọng cơ thể (TLCT)); trên thỏ, dịch chiết tỏi đen Lý Sơn ở các mức liều 2 g và 4 g/kg/24 giờ uống hằng ngày trong 42 ngày không ảnh hưởng đến sự phát triển TLCT, các chỉ số điện tim, huyết học, sinh hóa và mô bệnh học gan, lách, thận thỏ. Từ đó cho thấy dịch chiết tỏi đen Lý Sơn có tính an toàn cao trên động vật thực nghiệm [3]. Theo Hồ Anh Sơn và cộng sự (2014), nghiên cứu tác dụng bảo vệ của dịch chiết tỏi đen Lý Sơn đối với một số cơ quan lympho trên chuột bị chiếu xạ. Tiến hành chia chuột nghiên cứu thành 4 nhóm: nhóm chứng sinh học không chiếu xạ (CG) , nhóm chiếu xạ (RG), nhóm chiếu xạ - tỏi tươi (RFGG) và nhóm chiếu xạ tỏi đen (RBGG); chuột được chiếu xạ một liều duy nhất 7 Gy. Kết quả cho thấy sau 7 ngày sử dụng tỏi, quần thể tế bào lympho và tế bào tủy xương của nhóm RBGG tương đương với nhóm CG; các nhóm khác có mật độ tế bào miễn dịch thấp hơn [18]. Theo Kim và cộng sự (2011), nghiên cứu về tác dụng của tỏi đen đối với chuột béo phì được cho ăn ở chế độ nhiều chất béo, chuột được cho ăn ở hai chế độ riêng biệt: chế độ ăn bình thường và chế độ ăn có nhiều chất béo trong 5 tuần. Sau đó, nhóm ăn với chế độ có nhiều chất béo được chia thành 5 nhóm và được ăn với chế độ khác nhau, trong đó có nhóm được bổ sung dịch chiết tỏi đen (100, 250 và 500 mg/ kg trọng lượng cơ thể) thêm 5 tuần nữa. Kết quả cho thấy ở nhóm chuột này hàm lượng mô mỡ giảm đáng kể. Dựa vào kết quả có thể kết luận rằng dịch chiết tỏi đen có khả năng cải thiện cân nặng cơ thể [36]. Theo Lee và cộng sự (2009), nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa của tỏi và tỏi đen đối với động vật bị bệnh tiểu đường type 2 và nghiên cứu được tiến hành trên chuột. Theo Hình 1.4, chỉ số TBARS của chuột được sử dụng tỏi đen thấp hơn so với chuột đang bị bệnh tiểu đường type 2 và chuột được sử dụng tỏi. Kết quả này cho thấy dịch chiết tỏi đen có khả năng ngăn ngừa các biến chứng của bệnh tiểu đường [38]. 16 Mẫu control Tỏi Tỏi đen Hình 1.4. Sự thay đổi chỉ số TBARS của chuột khi sử dụng tỏi và tỏi đen 1.3.4. Tình hình sản xuất và tiêu thụ tỏi đen Tỏi đen là sản phẩm đang rất được ưa chuộng, đặc biệt là Nhật Bản và Hàn Quốc. Tuy nhiên, việc sản xuất tỏi đen ở Nhật Bản không nhiều do bị hạn chế bởi thời tiết, thổ nhưỡng,…do đó phải nhập tỏi đen từ các nước khác, nhất là Trung Quốc và các nước Châu Âu. Hàn Quốc là đất nước có ngành công nghiệp sản xuất tỏi đen phát triển mạnh, tổng doanh thu từ tỏi đen lên tới 100 triệu USD/năm. Tại Nhật Bản, tỏi đen được bán trong hầu hết các siêu thị và được người dân sử dụng như là một thực phẩm chức năng hàng ngày. Giá của tỏi đen trên thị trường Nhật và Hàn Quốc khá cao, ước khoảng 400-500 USD/kg sản phẩm. Tỏi đen được sản xuất với nhiều loại sản phẩm như: nước giải khát, viên nang tỏi đen, cao tỏi đen,… Tại Việt Nam, thị trường tiêu thụ tỏi đen nhiều nhất là Hà Nội và TP. Hồ Chí Minh. Việc sản xuất tỏi đen ở nước ta còn hạn chế do chi phí đầu tư vào công nghệ sản xuất và máy móc cao, tỏi xuất khẩu qua nước ngoài chủ yếu ở dạng tươi, việc xúc tiến xuất khẩu tỏi đen qua thị trường Nhật Bản đang được thực hiện. 17 Cao tỏi đen Viên nang tỏi đen Rượu tỏi đen Nước giải khát Hình 1.3. Một số sản phẩm từ tỏi đen 1.4. Tình hình nghiên cứu về tỏi đen 1.4.1. Nghiên cứu ngoài nước Hiện nay, trên thế giới tỏi đen đang được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, đặc biệt là các nước Châu Á bởi các hoạt tính y dược của nó, trong đó có thể kể đến các hoạt chất chống oxy hóa, hoạt chất kháng khuẩn và hoạt chất chống ung thư. Tỏi tươi có rất nhiều công dụng, tuy nhiên có nhược điểm là mùi khó chịu; ngoài ra, trong một số trường hợp việc ăn tỏi tươi còn làm rối loạn chức 18 năng dạ dày, do đó, để khắc phục nhược điểm này, các nhà khoa học Nhật Bản, Hàn Quốc đã tiến hành lên men tỏi tươi thành tỏi đen. Khi tỏi trải qua quá trình lên men, các quá trình thay đổi hóa lý xảy ra như thay đổi về màu sắc, thành phần hóa học và các hoạt tính y dược. Đặc biệt, xử lý nhiệt dẫn đến phản ứng hóa nâu phi enzym như các phản ứng Maillard, caramen hóa và quá trình oxy hóa các hợp chất polyphenol. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng, tỏi đen chứa nhiều hoạt chất sinh học và có hoạt tính y dược cao hơn so với tỏi tươi như tác dụng chống oxy hóa, phòng ngừa hội chứng chuyển hóa và nhiễm độc gan do rượu, phòng chống sự phát triển của tế bào ung thư (Ide và Lau, 1996; Bae và cộng sự, 2014) [24], [32]. Kết quả của nhiều nghiên cứu cho thấy sự tăng hoạt chất S-allyl cysteine (SAC) là sự thay đổi quan trọng nhất trong quá trình lên men tỏi đen. Hàm lượng SAC trong tỏi tươi khoảng 20-30 µg/g, sau khi lên men hàm lượng này của tỏi đen cao gấp 5-6 lần so với tỏi tươi (Bae và cộng sự, 2014; Wang và cộng sự, 2010) [24], [50].Theo nghiên cứu của Purev và cộng sự (2012) đã chỉ ra rằng, hoạt chất SAC trong tỏi đen có tác dụng làm tăng khả năng miễn dịch cho cơ thể [45]. Ngoài ra, trong tỏi đen còn chứa nhiều hoạt chất như polyphenol, hợp chất sulfur hữu cơ,…có tác dụng ngăn ngừa gốc tự do, chống lão hóa. Sản phẩm tỏi đen được tiêu thụ phổ biến trên thị trường Nhật Bản, Hàn Quốc, Mỹ, Trung Quốc…với nhiều dạng sản phẩm khác nhau như: viên nang, cao tỏi đen, nước giải khát,… 1.4.2. Nghiên cứu trong nước Tỏi đen được sử dụng khá phổ biến không chỉ làm thức ăn, mà còn được nghiên cứu sử dụng trong ngành công nghệ dược phẩm do có hoạt tính y dược cao. Tuy nhiên, đây là sản phẩm tương đối mới trên thị trường Việt Nam. Ở Việt Nam, người tiêu dùng sử dụng tỏi đen với một số mục đích như: bồi bồ sức khỏe, tăng cường thể trạng sau ốm; phòng chống xơ vữa động mạch, phòng và hỗ trợ điều trị tai biến mạch máu não; bảo vệ gan; phòng ngừa biến chứng bệnh tiểu đường; chống oxy hóa, phòng ngừa lão hóa,…Mặc dù tỏi đen có nhiều công dụng rất tốt cho sức 19 khỏe con người, nhưng mới chỉ có một công trình nghiên cứu của các nhà khoa học thuộc Học viện Quân y trong việc nghiên cứu tỏi đen được lên men trên đối tượng tỏi Lý Sơn. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu vẫn chưa được các nhà khoa học công bố ở các tạp chí khoa học. Vì vậy, việc nghiên cứu các chỉ tiêu hóa lý và hoạt tính chống oxy hóa của tỏi đen là hết sức cần thiết, nhằm cung cấp cơ sở khoa học về hoạt tính y dược của tỏi đen, góp phần tạo niềm tin đối với tỏi đen của người tiêu dùng, từ đó nâng cao giá trị của tỏi đen. 1.5. Khái quát về gốc tự do và chất chống oxy hóa 1.5.1. Gốc tự do Các gốc tự do hay nói chính xác hơn là các chất hoạt động chứa oxy và nito (Reactive Oxygen Species-ROS và Reactive Nitrogen Species-RNS) là các dẫn xuất dạng khử của oxy và nito phân tử, chúng được chia thành 2 nhóm lớn là các gốc tự do và các dẫn xuất không phải gốc tự do. Các gốc tự do là các nguyên tử hoặc phân tử có một hoặc nhiều điện tử độc thân. Các dẫn xuất không phải gốc tự do như oxy đơn, hydroperoxide, nitroperoxide là tiền chất của các gốc tự do. Các ROS VÀ RNS được tạo ra một cách tất yếu trong quá trình trao đổi chất và tùy thuộc vào nồng độ mà chúng có tác dụng tốt hay xấu đến cơ thể. Sự phá hủy các đại phân tử sinh học bởi ROS và RNS là nguyên nhân của rất nhiều bệnh nguy hiểm. Để bảo vệ cơ thể khỏi tác động xấu của ROS và RNS, tế bào được trang bị một hệ thống bảo vệ bao gồm các chất chống oxy hóa [4]. 1.5.2. Chất chống oxy hóa Chất chống oxy hóa là các hợp chất có khả năng làm chậm lại, ngăn cản hoặc đảo ngược các quá trình oxy hóa các hợp chất có trong cơ thể [4]. Dựa trên nguyên tắc hoạt động, các chất chống oxy hóa được phân thành 2 loại: các chất chống oxy hóa bậc I, các chất chống oxy hóa bậc II. 1.5.2.1. Cơ chế hoạt động của các chất chống oxy hóa Các chất chống oxy hóa bậc 1: Vô hoạt các gốc tự do Khử các gốc tự do: 20 L* + A LH + A* LOO* + AH LOOH + A* LO* + AH LOH + A* Tạo hợp chất với các gốc tự do: A* + LOO* LOOA A* + LO* LOA Các chất chống oxy hóa bậc II: ngăn chặn sự tạo ra các gốc tự do (hấp thụ tia cực tím, tạo phức với các kim loại kích hoạt sự tạo gốc tự do như Cu, Fe; vô hoạt oxy đơn (Theo Singh and Rajini, 2004; Rolland, 2004) [48]. Superoxid dismutase Superoxid dismutase (SOD) là enzyme chống oxy hóa có chứa kim loại thuộc loại oxidoreductase, nó xúc tác cho phản ứng chuyển hóa superoxid O2 và H2O2: • 2 O2 + SOD → 2H+  H2 O2 + O2 Cơ chế phản ứng SOD: SOD là metalloenzym chống oxy hóa trong tế bào, xúc tác phản ứng dị ly oxy hóa khử, phân hủy gốc superoxid. Quá trình trao đổi điện tử thực chất xảy ra tại trung tâm hoạt động ion kim loại xảy (Me) theo cơ chế phản ứng oxy hóa khử gồm 2 bước: Me3+ + O 2• Me2+ + O 2• + 2H+ Me2+ + O2 Me3+ + H2O2 Đầu tiên Me3+ bị khử bằng cách nhận một điện tử của gốc O 2• và trở thành dạng oxy hóa Me2+, còn O2• chuyển thành O2. Khi đó Me2+ tiếp tục tương tác với một gốc O 2• và nhường điện tử cho nó, với sự có mặt của H+ chúng kết hợp với nhau để tạo thành H2O2. Qúa trình này tiếp tục lặp đi, lặp lại tạo nên một chu trình phản ứng khép kín. Chu trình bán hủy của SOD từ vài phút đến vài giờ, nó phụ thuộc vào nhóm SOD khác nhau. SOD không qua được màng tế bào nên chỉ có tác dụng cải thiện khả năng chống oxy hóa nội bào. 21 Catalase (CAT) Catalase là enzym xúc tác phản ứng phân hủy H2O2 và chỉ hoạt động khi H2O2 ở nồng độ cao (lớn hơn 10-8 mmol/L), catalase không phân hủy được peroxide hữu cơ và H2O2 ở nồng độ thấp vì chúng chỉ được hoạt hóa khi H2O2 ở nồng độ cao. Catalase H2O2 → H2O + ½ O2 Catalase có mặt trong hầu hết các tế bào và các mô động vật nhưng hoạt tính mạnh nhất là ở gan và thận, ít nhất là ở mô, catalase có chủ yếu trong các ty thể và peroxisome. Peroxidase Peroxidase là một nhóm enzym xúc tác các phản ứng oxy hóa khử, thuộc lớp oxidoreductase, xúc tác cho phản ứng sau. peroxidase AH2 + H2O2 → A + 2H2O Những gốc O 2• được sinh ra từ O2 trong chuỗi vận chuyển điện tử sẽ bị SOD phân hủy, nhưng lại tạo ra nhiểu H2O2. Vì vậy việc loại bỏ H2O2 là rất cần thiết, đảm bảo hoạt động nội bào diễn ra bình thường. Peroxidase sử dụng H2O2 như là một chất nhận điện tử xúc tác cho nhiều phản ứng oxy hóa khử khác nhau, khi đó H2O2 bị khử thành H2O. Hầu hết các peroxidase có dùng cơ chế xúc tác phản ứng phân giải H2O2 và được thực hiện theo các bước sau: - Tạo thành phức I hoạt động: Enzym + H2O2 Complex I - Chuyển hóa phức hợp I thành phức hợp II hoạt động: Complex I + AH2 Complex II + •AH - Tái tạo enzym bằng quá trình khử phức hợp II: Complex II + AH2 Enzym + •AH + 2 H2O - Tạo thành sản phẩm: • AH + •AH Sản phẩm oxy hóa Không còn gốc tự do 22 Peroxidase có coenzym là nhóm heme b. Heme b là phức hợp tạo bởi phân tử protoporphyrin IX và một ion Fe2+ hoặc Fe3+ ở trung tâm. Một số peroxidae còn mang gốc amino acid chứa vòng thơm nằm song song với mặt phẳng imidazol và chúng tương tác với nhau bằng lực Vander Waals. Glutathione peroxidae (GPx) GPx là eym xúc tác cho phản ứng loại bỏ các peroxid, hoạt động ở các mô và hồng cầu khi nồng độ H2O2 thấp. GPx ROOH + 2GSH GSSG + ROH + H2O Enzym này chủ yếu tồn tại bên trong ty thể và bào tương của tế bào, ở dịch ngoại bào rất thấp. GPx có hai loại: không phụ thuộc selen chiếm 20% xúc tác sự khử các hydroperoxid hữu cơ khi có mặt glutathion nhưng không có tác dụng trên H2O2; GPx phụ thuộc selen chiếm 80% xúc tác loại bỏ H2O2. Glutathione có bản chất là một tripeptide (L- γ-glutamyl cysteince), chính nhờ sự liên kết γ-peptide giữa glutamic acid và cysteine đó mà glutathione được bảo vệ, tránh khởi sự phân hủy bởi amino peptidase. Glutathione tồn tại ở 2 dạng; dạng khử (thiol GSH) và oxy hóa (disulfide GS-SG). Cơ chế phản ứng của glutathione tham gia vào quá trình phân giải hợp chất peroxide như sau: Hệ thống glutathion peroxidase gồm: glutathion peroxidase, glutathion reductase, glucose-6-phosphat dehidrogenase. Hoạt độ của GPx và catalase phụ thuộc vào nồng độ H2O2, khi nồng độ H2O2 cao ức chế GPx và hoạt hóa catalase hoạt động và ngược lại khi nồng độ H2O2 thấp chỉ có GPx hoạt động và catalase bị ức chế, điều này rất quan trọng vì nó tiết kiệm glutathion dạng khử cho cơ thể. 23 1.5.2.2. Một số chất chống oxy hóa Vitamin C Vitamin C hay acid ascorbic là chất có khả năng vô hoạt các gốc tự do rất tốt do nó có thể chuyển cho các gốc tự do hai nguyên tử hydro của nó và khi đó nó trở thành dehydroascorbic. Ngoài khả năng vô hoạt trực tiếp các gốc tự do, vitamin C còn có khả năng hoạt động hiệp lực với các chất chống oxy hóa khác trong cơ thể như vitamin E, carotenoid và flavonoid. Khi có sự tiếp xúc giữa vitamin E và gốc tự do peroxide của acid béo, vitamin E chuyển điện tử của nó cho gốc tự do nhưng đồng thời nó trở thành gốc tự do tocopheryl (vitamin E ở dạng oxy hóa). Vitamin C tiến hành khử gốc tocopheryl thành vitamin E nguyên dạng, sẵn sàng vô hoạt các gốc tự do peroxide mới, các carotenoid và các flavonoid khi vô hoạt các gốc tự do cũng được hoàn nguyên với cơ chế tương tự bởi vitamin C, điều này góp phần hạn chế sự tự kích hoạt oxy hóa (pro-oxydante) của các gốc vitamin E và flavonoid [4]. Vitamin E Vitamin E tồn tại ở tám dạng trong tự nhiên: 4 dạng tocopherol và 4 dạng tocotrienol. Cả 8 dạng này đều chứa một vòng thơm và một chuỗi mạch thẳng 16 cacbon. Các hợp chất tocotrienol khác với các tocopherol là có thêm ba nối đôi ở chuỗi mạch C thẳng. Nhóm hydroxyl gắn với vòng thơm quyết định khả năng chống oxy hóa của vitamin E trong khi mạch cacbon đảm bảo khả năng hòa tan trong chất béo. Tính chất hòa tan trong chất béo của vitamin E giúp chúng có khả năng thâm nhập sâu vào các màng sinh học vốn chứa nhiều acid béo không no và ngăn cản chuỗi phản ứng oxy hóa lipid. Các vitamin E có khả năng ngăn chặn phản ứng của các gốc tự do bằng cách nhường một nguyên tử hydro của nó cho gốc tự do peroxide. Tocopherol-OH + LOO Với LOO là gốc tự do peroxide [4]. Tocopherol-O+ LOOH 24 Carotenoid Carotenoid là những hợp chất màu hữu cơ có trong thực vật và một số sinh vật có khả năng quang hợp. Chúng đem lại màu vàng đến đỏ cho thực vật đồng thời tham gia quá trình quang hợp với vai trò là sắc tố phụ. Các carotenoid thường có một mạch cacbon dài (35-40 C) mang nhiều nối đôi, kết thúc bởi một cấu trúc vòng hoặc không. Cơ chế hoạt động chống oxy hóa của các carotenoid: - Vô hoạt oxy đơn - Vô hoạt các gốc tự do Oxy đơn là sản phẩm của quá trình oxy hóa sinh học và là một cấu tử có mặt trong không khí. Trong số các chất chống oxy hóa tự nhiên, các carotenoid có khả năng vô hoạt oxy đơn mạnh nhất bởi một cơ chế vật lý. Năng lượng dư của oxy đơn được chuyển giao cho carotenoid, oxy trở về trạng thái bình thường của nó trong khi carotenoid được chuyển lên trạng thí kích thích. Các carotenoid này sau đó quay trở lại trạng thái bình thường của nó bằng cách phát ra môi trường năng lượng dư thừa mà nó nhận được từ oxy đơn. Khả năng vô hoạt oxy đơn của carotenid phụ thuộc vào số liên kết đôi có trong mạch cacbon của nó. Mỗi phân tử carotenoid có khả năng vô hoạt 1000 phân tử oxy đơn trước khi tham gia vào các phản ứng hóa học và bị biến đổi thành các hợp chất khác. Ngoài khả năng vô hoạt oxy đơn, các carotenoid còn vô hoạt các gốc tự do bằng cách kết hợp với các gốc này theo một trong các cơ chế sau: [4] - Chuyển điện tử: Car + ROO Car+ + ROO- - Chuyển hydro: Car + ROO Car + ROOH - Cộng hợp: Car + ROO ROOCa Polyphenol Các hợp chất phenol Phenol là những hợp chất thơm có nhóm hydroxyl đính trực tiếp với nhân benzen. Phân tử có nhiều nhóm hydroxyl đính trưc tiếp vào vòng benzen gọi là polyhyroxylphenol (monomer), nhiều monomer gắn với nhau gọi là polyphenol. 25 Tùy theo cấu trúc mạch cacbon mà các hợp chất phenol được phân thành phenol đơn giản (C6), axit phenolic, flavonoid (C6-C3-C6), stilbene (C6-C2-C6) và ligbene (C6-C2)n [4]. Cies’lik và cộng sự (2004) đã nghiên cứu hàm lượng của polyphenol trong dịch chiết của một số loại trái cây và rau (Bảng 1.4). Bảng 1.4. Hàm lượng polyphenol của một số loại trái cây và rau [29] Trái cây Hàm lượng polyphenol/Khối lượng khô (mg/100g) Rau quả Hàm lượng polyphenol/Khối lượng khô (mg/100g) Nho hồng 683 Cà chua 1490 Mận 1599 Bắp cải 1620 Cam 1461 Hành tây 1339 Kiwi 2169 Cà rốt 1485 Táo 964 Bông cải xanh 1924 (Nguồn: Theo Cies’lik và cộng sự, 2004) Vai trò của polyphenol Đối với thực vật: Các hợp chất phenol có khả năng bảo vệ thực vật trước tia cực tím, chống lại sự oxy hóa; bảo vệ thực vật trước sự tấn công của vi sinh vật gây hại; là vật liệu góp phần cho độ bền chức của thực vật và sự thấm của thành tế bào đối với nước và khí. Đối với sản phẩm thực phẩm: Các hợp chất phenol là những chất hoạt động giữ vai trò chủ đạo quyết định đến hương vị, màu sắc của các sản phẩm thực phẩm. Chúng tham gia vào các quá trình tạo ra các cấu tử thơm mới, tạo ra mùi thơm đặc biệt cho sản phẩm. Ngoài ra, polyphenol là chất bảo quản tự nhiên không gây độc hại cho sản phẩm thực phẩm (Theo Lê Ngọc Tú, 2003) [17]. Đối với sức khỏe con người: Các hợp chất phenol có khả năng chống oxy hóa mạnh. Bên cạnh đó, polyphenol có tác dụng chống ung thư thông qua một loạt các cơ chế, bao gồm loại bỏ các tác nhân gây ung thư [49], kìm hãm sự phát tín hiệu của tế bào ung thư và chu trình phát triển tế bào, thúc đẩy quá trình apoptosit và 26 kìm hãm các hoạt động enzym. Theo nhiều nghiên cứu cho rằng polyphenol phát huy tác dụng có lợi cho hệ thống mạch máu thông qua một cảm ứng bảo vệ của chất chống oxy hóa, do hạ huyết áp, bằng cách cải thiện chức năng nội mô, bằng cách ức chế sự kết tụ tiểu cầu và giảm mật độ oxy hóa lipoprotein và giảm những phản ứng viêm. Ngoài ra, polyphenol còn được bổ sung vào các sản phẩm như kem đánh răng, sữa tắm,… Cơ chế chống oxy hóa của các hợp chất phenol: - Khử và vô hoạt các gốc tự do nhờ thế oxy hóa khử thấp. - Tạo phức với các ion Fe2+ và Cu+. - Kìm hãm hoạt động của các enzym có khả năng tạo gốc tự do như xanthine oxydase. Các hợp chất flavonoid (Fl-OH) nhờ thế oxy hóa khử thấp có thể khử các gốc tự do như peroxyl, alkoxyle, hydroxyle bằng cách nhường nguyên tử hydro. Fl-OH + R -> Fl-O +RH Các gốc flavonoid tự do (Fl-O) lại kết hợp với một gốc tự do khác để tạo thành một chất bền hơn. Theo một số nghiên cứu cho thấy hàm lượng polyphenol tổng số của tỏi tăng dần theo thời gian lên men và có hoạt tính sinh học cao. Theo Choi và cộng sự (2014), sự thay đổi hàm lượng polyphenol tổng số của tỏi sau 35 ngày lên men ở điều kiện nhiệt độ 70 ºC và độ ẩm không khí tương đối 95% được thể hiện ở bảng sau (Bảng 1.5)s. Bảng 1.5. Sự thay đổi hàm lượng polyphenol tổng số của tỏi theo thời gian lên men [28] 0 7 Ngày lên men tỏi 14 21 28 35 Hàm lượng polypenol tổng số 13,91±1,62 25,81±1,59 35,28±0,32 58,33±1,90 55,25±0,70 48,35±1,14 (mg GAE/g) (Nguồn: Theo Choi và cộng sự, 2014) 27 1.5.3. Một số phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 1.5.3.1. Phương pháp dựa vào tổng năng lực khử Tổng năng lực khử của chất chống oxy hóa được phân tích dựa vào phương pháp của Oyaizo (1986) [44]. Nguyên tắc: Năng lực khử của một chất là khả năng chất đó cho điện tử khi tham gia phản ứng oxy hóa. Do đó, năng lực khử cũng biểu hiện khả năng chống oxy hóa của một chât. Trong đó, chất khử (chất có hoạt tính chống oxy hóa) sẽ khử potassium ferricyanid (K3[Fe(CN)6]) thành potassium ferrocyanid (K4[Fe(CN)6]). Ion Fe3+ trong phân tử possium ferricyanid bị khử thành ion Fe2+ trong phân tử possium ferrocyanid. X – K3[Fe(CN)6] K4[Fe(CN)6 Khi bổ sung Fe3+, Fe3- sẽ phản ứng với ion ferrocyanid tạo thành một phức hợp ferric ferrocyanid màu xanh dương có công thức K4[Fe(CN)6]. Phức hợp này có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 700nm. Cường độ màu tỉ lệ thuận với hàm lượng ion ferrocyanid được tạo thành. Do đó, cường độ màu càng cao chứng tỏ năng lực khử của mẫu càng cao. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 700nm để xác định tổng năng lực khử của chất chống oxy hóa. 1.5.3.2. Phương pháp khử gốc tự do DPPH Năm 1922, Goldschmidt và Renn đã phát hiện ra một gốc tự do bền có màu tím đậm, hầu như không phân hủy, cũng không phản ứng với oxy, đó chính là gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl). Dung dịch DPPH có cực đại hấp thụ tại bước sóng 517 nm và sản phẩm khử của nó là DPPH-H (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine) có màu vàng cam. Kết quả được báo cáo bằng giá trị EC50, đó là lượng dịch chiết khử được 50% gốc tự do DPPH hoặc phần trăm khử gốc tự do DPPH [23]. 28 Hình 1.4. Phản ứng trung hòa gốc DPPH 1.5.3.3. Phương pháp TEAC Cation ABTS+ [2,2-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) (ABTS)] là một gốc tự do bền, đây là một chất phát quang màu xanh, có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 734 nm. Khi cho chất chống oxy hóa vào dung dịch chứa ABTS+, các chất chống oxy hóa sẽ khử ion này thành ABTS. Đo độ giảm hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 734 nm để xác định hoạt tính chống oxy hóa trong sự so sánh với chất chuẩn Trolox [6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid]. Trong môi trường kali persufat, gốc ATBS+ có thể bền trong 2 ngày ở nhiệt độ phòng trong tối [23]. 1.5.3.4. Phương pháp ORAC Phương pháp này đo mức độ phân hủy do bị oxy hóa của fluorescein khi có sự hiện diện của gốc peroxy. Phản ứng trong điều kiện này được so sánh với phản ứng trong sự hiện diện của chất chuẩn Trolox (hay vitamin E) và trong sự hiện diện của mẫu chứa chất chống oxy hóa cần xác định hoạt tính. Khi fluorescein bị oxy hóa, cường độ phát huỳnh quang sẽ giảm đi. Sự giảm cường độ phát quang được đo 1 phút 1 lần trong 50 phút. Bước sóng kích thích 485 nm, bước sóng phát 583 nm. Phản ứng oxy hóa được coi là hoàn tất khi cường độ huỳnh quang tại phút thứ 50 nhỏ hơn hoặc bằng 5% so với cường độ phát quang ban đầu. Khả năng chống oxy hóa được biểu diễn bằng µmol đương lượng Trolox/1 g chất khô (µmol/g CK) [21]. Ưu điểm của phương pháp là xác định được có hoặc không có sự trễ pha trong mẫu chứa các chất chống oxy hóa. 29 1.5.3.5. Phương pháp TRAP Phương pháp này sử dụng gốc peroxyl được tạo thành từ 2,2-azobis (2amidinopropane) dihydrochloride (AAPH). Khi cho AAPH vào môi trường plasma, các chất khử sẽ bị oxy hóa. Qúa trình oxy hóa này được đo đạc thông qua hàm lượng oxy tiêu thụ bằng một điện cực. Khi có mặt chất chống oxy hóa trong môi trường plasma, quá trình oxy hóa sẽ xảy ra chậm hơn. Gía trị TRAP của mẫu thí nghiệm được tính toán dựa vào độ dài pha lag của mẫu so với độ dài pha lag mẫu trắng và độ dài pha lag của chất chuẩn là dung dịch Trolox. Kết quả tính toán là mmol Trolox/kg mẫu rắn hoặc mmol Trolox/m mẫu lỏng [22], [23]. 1.5.3.6. Phương pháp FRAP Nguyên tắc của phương pháp này là dựa trên khả năng của các chất chống oxy hóa trong việc khử phức Fe3+-TPTZ [2,4,6-tripydyl-s-triazine] màu tím thành phức Fe2+-TPTZ màu xanh ở pH thấp. Khi đó, độ tăng cường độ màu xanh tỷ lệ với hàm lượng chất chống oxy hóa có trong nguyên liệu. Mức độ tăng cường độ màu này được đo ở bước sóng 593 nm trong sự so sánh với chất chuẩn là dung dịch FeSO4 hoặc BHT (Butylated hydroxy toluene). Khi cho phức Fe3+-TPTZ vào môi trường chứa chất chống oxy hóa, các chất oxy hóa sẽ nhường điện tử cho phức này và tạo thành Fe2+-TPTZ. Kết quả tính toán được biểu diễn bằng mmol Fe2+/g chất khô. Do đó, khi kết quả tính toán rất lớn thì chúng ta có thể suy đoán rằng trong môi trường phản ứng đó số lượng các phân tử có thể nhường điện tử là cao. Tuy nhiên, điều này không hoàn toàn đúng vì một phân tử chất chống oxy hóa có thể khử nhiều phức Fe3+-TPTZ cùng lúc. Đây là hạn chế của phương pháp FRAP [21], [33]. 30 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Tỏi Phan Rang được mua ở chợ Vĩnh Hải, TP. Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa. Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm thí nghiệm thực hành trường Đại học Nha Trang. Thời gian nghiên cứu: từ ngày 16/03/2015 đến ngày 07/06/2015. 2.2. Vật liệu, hóa chất nghiên cứu 2.2.1. Nguyên liệu tỏi Nguyên liệu tỏi sử dụng trong nghiên cứu là tỏi Phan Rang, được thu mua từ chợ Vĩnh Hải, vận chuyển về phòng thí nghiệm bằng dụng cụ chứa chuyên dụng. Tại phòng thí nghiệm, lựa chọn những củ đạt tiêu chuẩn (củ to, còn nguyên vẹn, lớp vỏ dày, không bị dập và không bị sâu mọt) để tiến hành lên men. Trong nghiên cứu này, vật liệu để tiến hành nghiên cứu là tỏi đen được lên men từ Tỏi nguyên liệu (A. sativum) có độ ẩm từ 60-70%. 2.2.2. Hóa chất Chì acetat (Pb(CH3COO)2), Đồng sunfat tinh thể (CuSO4.5H2O), Kalinatritarat, Natri hydroxit tinh thể (NaOH), Sắt (III) sunfat tinh thể (Fe2(SO4)3), Acid sunfuric đậm đặc (H2SO4), Kali pemaganat (KMnO4), K3(Fe[CN]6), Dung dịch đệm phosphat, Acid tricloroacetic (TCA), Sắt clorua (FeCl3), Methanol (CH3OH), Ethanol (C2H5OH), Nhôm clorua (AlCl3), Kalinatritartrate (KNaC4H4O6.4H20), Cloroform, Kaliclorua (KCl); DPPH và Folin regent được mua từ công ty Hóa chất Simga (Hoa Kì). Tất cả các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều đạt hạng phân tích. 31 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Quy trình lên men sản xuất tỏi đen Tỏi nguyên liệu Xử lí Làm sạch, để ráo Lên men Sấy khô Bao gói, bảo quản Sản phẩm tỏi đen Hình 2.1. Sơ đồ quy trình lên men sản xuất tỏi đen Giải thích quy trình: Tỏi nguyên liệu: Tỏi sử dụng trong lên men phải đáp ứng các tiêu chuẩn như: củ tỏi phải đồng đều, độ ẩm vừa phải, các tép tỏi không bị dập nát, củ tỏi phải được bao với nhiều lớp vỏ bên ngoài. Xử lý: Tỏi nguyên liệu được xử lý nhằm loại bỏ rễ, cắt ngắn phần thân cho phù hợp với yêu cầu của công nghệ. Làm sạch, để ráo: Tỏi sau khi xử lý được rửa sạch và để ráo trước khi lên men. 32 Lên men: Tỏi được xếp vào các khay inox đưa vào tủ ổn nhiệt để tiến hành lên men. Đây là công đoạn quyết định đến chất lượng của sản phẩm. Sấy khô: Sau khi lên men, tỏi đen được sấy khô đến độ ẩm đạt khoảng 30%. Bao gói, bảo quản: Sau khi kết thúc quá trình lên men, tỏi đen được bao gói hút chân không trong bao bì PA và bảo quản lạnh. 2.3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu Nguyên liệu tỏi Xử lý Điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm Lên men Lấy mẫu phân tích Xác định một số thành phần hóa lý: - Hàm lượng nước Hàm lượng tro Hàm lượng acid tổng Hàm lượng polyphenol tổng Xác định hoạt tính chống oxy hóa: - Khả năng khử gốc tự do DPPH. Tổng năng lực khử. Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu sự biến đổi của một số thành phần hóa lý và hoạt tính chống oxy hóa của tỏi theo thời gian lên men. 33 Giải thích quy trình: Nguyên liệu tỏi: Tỏi nguyên liệu (A. sativum) được thu mua từ chợ Vĩnh Hải, vận chuyển về phòng thí nghiệm bằng dụng cụ chứa chuyên dụng và được bảo quản ở nhiệt độ phòng. Xử lý: Tỏi được tách ra khỏi chùm, sau đó lựa chọn những củ đạt tiêu chuẩn như củ tỏi phải đồng đều, các tép tỏi không bị dập, không bị sâu mọt, củ tỏi phải được bao bởi nhiều lớp vỏ bên ngoài…trước khi xếp vào khay inox cho vào tủ ổn nhiệt để tiến hành lên men. Lên men: Tỏi được lên men ở các chế độ nhiệt độ và độ ẩm khác nhau trong thời gian 13 ngày. Trong thời gian 3 ngày đầu tiên của quá trình lên men, tỏi được giữ ở nhiệt độ 75 °C và độ ẩm tương đối là 90%. Trong 4 ngày lên men tiếp theo, tỏi được giữ ở nhiệt độ 65 °C và độ ẩm tương đối 80%. Trong thời gian 6 ngày lên men cuối cùng, tỏi được duy trì ở nhiệt độ 60 °C và độ ẩm tương đối 70%. Lấy mẫu phân tích: Trong thời gian lên men, mẫu tỏi được thu nhận ở các ngày 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 để tiến hành đánh giá sự biến đổi một số thành phần hóa lý và hoạt tính chống oxy hóa của tỏi. Mẫu tỏi mỗi lần lấy được đựng trong túi PA, hút chân không và bảo quản lạnh. Xác định một số thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa: Để tiến hành xác định một số thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa của tỏi trong thời gian lên men, trước hết phải chuẩn bị mẫu: Khoảng 90 - 100 g (15 - 20 củ) tỏi nguyên liệu được thu nhận sau mỗi ngày lên men. Các mẫu tỏi được bóc vỏ, đồng hóa và bảo quản trong các ống Falcon 50 ml ở nhiệt độ 4 ºC trước khi tiến hành phân tích. 2.3.3. Phương pháp phân tích 2.3.3.1. Phương pháp xác định hàm lượng nước (Phụ lục 1) Hàm lượng nước của tỏi được xác định bằng cách sấy mẫu ở nhiệt độ 103 ± 1 ºC trong thời gian 4 giờ theo phương pháp ISO 6496:1999 [33]. 34 2.3.3.2. Phương pháp xác định hàm lượng tro (Phụ lục 2) Hàm lượng tro toàn phần của tỏi được xác định bằng cách nung mẫu ở nhiệt độ 550 – 600 °C theo TCVN 7038:2002 nhằm mục đích đốt cháy hết các hợp chất hữu cơ. Hàm lượng tro toàn phần được tính toán dựa vào phần khối lượng còn lại sau khi nung và khối lượng của mẫu trước khi nung [14]. 2.3.3.3. Phương pháp xác định hàm lượng acid tổng (Phụ lục 3) Hàm lượng acid tổng trong tỏi được xác định theo phương pháp chuẩn độ của AOAC:1990 [22]. 2.3.3.4. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số (Phụ lục 4) Chuẩn bị mẫu: Cân chính xác 1 g mẫu cho vào bình tam giác 100 ml, sử dụng cân phân tích chính xác đến 10-4 g. Tiếp theo cho 25 ml nước cất vào. Sau đó các mẫu được chiết ở nhiệt độ 80 ºC, trong thời gian khoảng 60 phút kết hợp với sử dụng sóng siêu âm. Kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp được lọc qua giấy lọc(GP/T1914-2007, ø = 11 cm). Dịch lọc thu được sử dụng để xác định hàm lượng polyphenol tổng số, khả năng bắt gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử. Hàm lượng polyphenol tổng số được xác định bằng phương pháp của Singleton và cộng sự (1999) với một vài hiệu chỉnh nhỏ [47]. 2.3.3.5. Phương pháp xác định khả năng khử gốc tự do DPPH (Phụ lục 5) Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH là phương pháp được sử dụng rộng rãi để đánh giá khả năng khử gốc tự do của các mẫu khác nhau. Khả năng khử gốc tự do được xác định được xác định bằng phương pháp của Fu và cộng sự (2002) với một vài sự hiệu chỉnh nhỏ [30]. 2.3.3.6. Phương pháp xác định tổng năng lực khử (Phụ lục 6) Năng lực khử được xác định theo phương pháp của Oyaizu (1986) với một vài sự hiệu chỉnh nhỏ [44]. 35 2.3.4. Phương pháp xử lí số liệu Các kết quả thí nghiệm được xác định từ trung bình cộng của 2 lần thí nghiệm độc lập. Đồ thị được vẽ bằng phần mềm MS Excel 2010 (Microsoft Corporation, US). Các giá trị trung bình được so sánh dựa vào phân tích AVOVA và kiểm định Duncan (Duncan’s Multiple-Comparison Test) trên phần mềm SPSS 20.0 (SPSS Inc., Chicago, Il). Khác biệt có ý nghĩa tại giá trị p < 0,05. 36 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Sự thay đổi màu sắc của tỏi theo thời gian lên men Ngày 0 Ngày 3 Ngày 1 Ngày 5 Ngày 7 Ngày 9 Ngày 11 Ngày 13 Hình 3.1. Sự thay đổi màu sắc của tỏi theo thời gian lên men 37 Màu sắc là một trong những tính chất vật lý quan trọng nhất của sản phẩm thực phẩm, ảnh hưởng đến sự đánh giá sản phẩm của người tiêu dùng. Hình 3.1 thể hiện sự thay đổi màu sắc của tỏi sau hơn 10 ngày lên men. Sự thay đổi màu sắc này là do trong quá trình lên men ở điều kiện nhiệt độ thích hợp cho phản ứng Maillard xảy ra, đây là phản ứng biến nâu phi enzym. Trong suốt quá trình lên men, các sản phẩm của phản ứng Maillard tạo ra góp phần tạo màu cho sản phẩm tỏi đen. Theo Bae và cộng sự (2013), tỏi được lên men trong 45 ngày ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau là 40, 55, 70 và 85 ºC (với độ ẩm tương đối 70%), cường độ màu nâu của tỏi tăng liên tục trong quá trình lên men. Tuy nhiên, tỏi lên men ở điều kiện nhiệt độ 40-70 ºC có cường độ biến nâu ít sâu sắc hơn so với tỏi lên men ở 85ºC, cường độ biến nâu của tỏi lên men ở ngày thứ 45 trong điều kiện nhiệt độ 40 và 85 ºC lần lượt là 0,69 và 2,05. Điều này cho thấy, ở nhiệt độ thích hợp cho phản ứng Maillard xảy ra sẽ làm cường độ biến nâu của tỏi thay đổi nhanh hơn [24]. Theo kết quả thu được kết hợp với các nghiên cứu trước đó cho thấy cường độ biến nâu của tỏi biến đổi theo từng ngày lên men. 3.2. Sự thay đổi hàm lượng nước của tỏi theo thời gian lên men Nước là thành phần hóa học chiếm khoảng 60-70% trong thành phần của củ tỏi, do nước chiếm một lượng lớn nên duy trì độ trương của tế bào làm cho củ tỏi có hình dáng nhất định. Bên cạnh đó, nước còn là nguyên liệu tham gia vào một số quá trình trao đổi chất của tỏi. Nước có sức căng bề mặt lớn nên có lợi cho việc hấp thụ và vận chuyển vật chất. Sự biến đổi hàm lượng nước của tỏi theo thời gian lên men được thể hiện ở Hình 3.2. 38 Hình 3.2. Sự thay đổi hàm lượng nước của tỏi theo thời gian lên men Kết quả nghiên cứu cho thấy, hàm lượng nước của tỏi giảm dần theo thời gian lên men. Hàm lượng nước của tỏi nguyên liệu là 67,77%, trong khi hàm lượng này của tỏi ở ngày lên men thứ 5 và 13 lần lượt là 59,56 và 53,98%. Trong đó, hàm lượng nước giảm mạnh trong 3 ngày đầu lên men , thay đổi không đáng kể ở 4 ngày tiếp theo và tiếp tục giảm mạnh ở 6 ngày cuối cùng. Sự thay đổi này là do trong quá trình lên men có sự chênh lệch nhiệt và ẩm giữa tỏi và môi trường không khí xung quanh do đó đã xảy ra quá trình trao đổi nhiệt và trao đổi ẩm trong thiết bị lên men, nhiệt độ cao đã thúc đẩy quá trình dịch chuyển ẩm từ trong tỏi ra bề mặt và thoát ra môi trường ngoài. Ở 3 ngày đầu lên men, dưới tác dụng của nhiệt độ và độ ẩm cao (75 ºC, 90%), nước khuếch tán và thoát ra ngoài nhanh do đó hàm lượng nước trong tỏi giảm mạnh; ở 4 ngày tiếp theo, nhiệt độ giảm xuống còn 65 ºC làm cho khả năng thoát hơi nước của tỏi chậm lại, do đó hàm lượng nước trong tỏi thay đổi không nhiều; tiếp tục giảm nhiệt độ và độ ẩm ở 6 ngày kế tiếp, với độ ẩm tương đối thấp và thời gian kéo dài làm cho hàm lượng nước của tỏi tiếp tục giảm nhanh. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với một 39 số nghiên cứu khác. Bae và cộng sự (2013) nghiên cứu về sự thay đổi của S-allyl cysteine và các tính chất hóa lý của tỏi đen trong quá trình lên men, các mẫu tỏi được lên men trong thời gian 45 ngày ở các nhiệt độ khác nhau (40,55,70 và 85 ºC) trong cùng độ ẩm không khí tương đối 70%, hàm lượng nước ban đầu của tỏi tươi nguyên liệu là 66,1%, giá trị này ở ngày lên men thứ 45 giảm còn 53,4% (ở 40 ºC) và 45,3% (ở 85 ºC). Kết quả này cho thấy, hàm lượng nước của tỏi phụ thuộc vào nhiệt độ lên men, nhiệt độ lên men càng cao thì hàm lượng nước còn lại của tỏi càng thấp [24]. Theo nghiên cứu khác của Choi và cộng sự (2014), mẫu tỏi đươc lên men ở điều kiện nhiệt độ 70 ºC và độ ẩm tương đối 90%, hàm lượng nước ban đầu của tỏi tươi là 64,21%, trong khi hàm lượng này của tỏi trong ngày lên men thứ 14 và 35 lần lượt là 31,77 và 29,88% [28]. Như vậy, dựa vào kết quả nghiên cứu và kết quả của các nghiên cứu trước đó cho thấy: hàm lượng nước của tỏi giảm dần theo thời gian lên men. Tuy nhiên, sự biến đổi hàm lượng nước của tỏi phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ và độ ẩm của quá trình lên men. 3.3. Sự thay đổi hàm lượng tro của tỏi theo thời gian lên men Tro là thành phần còn lại của thực phẩm sau khi nung cháy hết các chất hữu cơ. Tro thực chất chỉ gồm các loại muối khoáng có trong thực phẩm. Sự thay đổi hàm lượng tro của tỏi trong thời gian lên men được thể hiện ở Hình 3.3. 40 Hình 3.3. Sự thay đổi hàm lượng tro của tỏi theo thời gian lên men Theo kết quả thí nghiệm thu được cho thấy hàm lượng tro của tỏi thay đổi không đáng kể theo thời gian lên men, điều này do hàm lượng các chất khoáng của tỏi ít bị biến đổi trong quá trình lên men. Kết quả nghiên cứu cho thấy, hàm lượng tro trong tỏi lên men không có sự khác biệt nhiều so với tỏi nguyên liệu. 3.4. Sự thay đổi hàm lượng acid tổng của tỏi theo thời gian lên men Hàm lượng acid tổng của tỏi theo thời gian lên men được thể hiện ở Hình 3.4 41 Hình 3.4 Sự thay đổi hàm lượng acid tổng của tỏi theo thời gian lên men Theo kết quả nghiên cứu, hàm lượng acid tổng trong tỏi nguyên liệu ban đầu là 0,41 mg/kg, trong khi đó hàm lượng này trong tỏi ở ngày lên men thứ 7 và 13 lần lượt là 2,57 và 3,04 mg/kg. Như vậy, sau 13 ngày lên men, hàm lượng acid tổng của tỏi tăng gấp 7 lần. Hàm lượng acid tổng của tỏi tăng theo thời gian lên men là do trong quá trình lên men có sự hình thành các acid cacboxyl (được tạo ra bởi quá trình oxy hóa nhóm aldehyt trong aldohexo, các hợp chất có tính acid, các acid amin cơ bản giảm do liên kết với đường). Theo Choi và cộng sự (2014), hàm lượng acid tổng của tỏi tăng trong 35 ngày lên men ở điều kiện 70 ºC và độ ẩm 90% [28]. Dựa vào kết quả thu được và kết quả các nghiên cứu trước đó có thể kết luận rằng: Hàm lượng acid tổng của tỏi tăng dần theo thời gian lên men. 42 3.5. Sự thay đổi hàm lượng polyphenol tổng số của tỏi theo thời gian lên men Polyphenol là hợp chất chống oxy hóa phổ biến ở các loài thực vật với hơn 8000 hợp chất đã được tìm thấy với cấu trúc từ đơn giản là acid phenol đến cấu trúc phức tạp là tannin . Theo nhiều nghiên cứu, polyphenol đã được chứng minh là hợp chất chống oxy hóa chính của thực vật. Bên cạnh đó, polyphenol còn có tác dụng chống ung thư thông qua một loạt các cơ chế, phát huy tác dụng có lợi cho hệ thống mạch máu thông qua một cảm ứng bảo vệ của chất chống oxy hóa,…Hàm lượng phenolic từ thực vật càng cao thì hoạt tính chống oxy hóa càng mạnh (Theo Marja và cộng sự, 1999) [40]. Sự thay đổi hàm lượng polyphenol tổng số của tỏi trong quá trình lên men được thể hiện ở Hình 3.5. Hình 3.5. Sự thay đổi hàm lượng polyphenol tổng số theo thời gian lên men Hàm lượng polyphenol tổng số tăng theo thời gian lên men. Hàm lượng polphenol tổng số trong tỏi nguyên liệu ban đầu là 11,89 mg GAE/g chất khô, trong khi đó hàm lượng này trong tỏi ở ngày lên men thứ 5 và 13 lần lượt là 17,50 và 43 48,45 mg GAE/g chất khô. Như vậy sau 13 ngày lên men, hàm lượng polyphenol tăng lên khoảng 4 lần. Sự thay đổi hàm lượng polyphenol tổng số là do dưới tác dụng của nhiệt độ, các quá trình sinh hóa xảy ra như phá vỡ cấu trúc cellusose thực vật, tạo điều kiện giải phóng các hợp chất polyphenol; đồng thời, nhiệt độ cao có thể ức chế các enzym oxy hóa liên quan đến các chất chống oxy hóa như polyphenol, flavonoid,…làm cho hàm lượng polyphenol tăng. Ngoài ra, sự tăng hàm lượng polyphenol tổng số còn do sự tăng của các hợp chất polyphenol phức tạp từ các giai đoạn sau của phản ứng hóa nâu phi enzym [35]. Theo nghiên cứu khác của Kim và cộng sự (2012), tỏi được lên men theo một lịch trình cụ thể từng bước (B1: 90 ºC, độ ẩm 100% trong 34h; B2: 60 ºC, độ ẩm 60% trong 6h; B3: 70 ºC, độ ẩm 75% trong 48h; B4: 70 ºC, độ ẩm 60% trong 60h; B5: 65 ºC, độ ẩm 50% trong 192h), mẫu thu được sau mỗi bước lên men tương ứng lần lượt là BG1, BG2, BG3, BG4 và BG5, kết quả cho thấy hàm lượng polyphenol tổng số trong tỏi đen cao hơn 4-10 lần so với tỏi tươi nguyên liệu (tùy vào điều kiện lên men) [35]. Theo kết quả nghiên cứu khác của Choi và cộng sự (2014), hàm lượng polyphenol tổng số trong tỏi đen tăng đáng kể so với tỏi tươi nguyên liệu sau khi lên men 35 ngày trong điều kiện nhiệt độ 70 ºC, độ ẩm 95% [28]. Theo Marja và cộng sự (1999), khi nghiên cứu hàm lượng polyphenol của 92 loại thực vật ăn được và không ăn được đã báo cáo rằng hàm lượng polyphenol của chúng dao động khá rộng từ 0,2 – 155,3 mg GAE/g chất khô. Cũng theo nhóm tác giả này những loài thực vật có hàm lượng polyphenol lớn hơn 20 mg GAE/g chất khô thì có hoạt tính chống oxy hóa mạnh. Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng polyphenol trong tỏi đen cao hơn mức khuyến cáo của Marja và cộng sự (1999) khoảng 2 lần. Điều này cũng cho phép dự đoán rằng dịch chiết từ tỏi đen có hoạt tính chống oxy hóa mạnh [35]. Polyphenol của tỏi đen là hợp chất chống oxy hóa mạnh và mạnh hơn nhiều thực vật khác. Theo Anesini và cộng sự (2008), hàm lượng polyphenol tổng số của 44 trà xanh là 21,02 mg GAE/g chất khô [20]. Theo Malencic và cộng sự (2011), hàm lượng polyphenol tổng số của 2 loại đậu nành màu nâu và đen dao động từ 4,946,22 mg GAE/g chất khô [40]. Qua kết quả nghiên cứu kết hợp với các nghiên cứu trước đó, cho thấy: Hàm lượng polyphenol tổng số của tỏi tăng dần theo thời gian lên men. Tuy nhiên, hàm lượng polyphenol tổng số còn phụ thuộc vào nhiệt độ lên men, do đó có sự biến đổi khác nhau trong mỗi quy trình lên men. 45 3.6. Sự thay đổi hoạt tính chống oxy hóa của tỏi theo thời gian lên men (A) (B) Hình 3.6. Sự thay đổi khả năng khử gốc tự do DPPH (A) và tổng năng lực khử (B) của tỏi theo thời gian lên men 46 Theo kết quả nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng polyphenol tổng số theo thời gian lên men cho thấy hàm lượng polyphenol tăng dần trong quá trình lên men. Polyphenol là hợp chất chống oxy hóa phổ biến ở các loài thực vật. Trong nghiên cứu này, sự thay đổi khả năng chống oxy hóa của tỏi được nghiên cứu sử dụng 2 phương pháp là bắt gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử. Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở Hình 3.5 A&B. Tương tự như sự thay đổi hàm lượng polyphenol, khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử của tỏi tăng dần theo thời gian lên men. Khả năng bắt gốc tự do DPPH của tỏi tăng liên tục từ ngày 0 đến ngày 11, sau 11 ngày lên men khả năng bắt gốc tự do DPPH tăng khoảng 3 lần (từ 16,50 đến 59,44%). Tổng năng lực khử Fe của tỏi được đánh giá bằng độ hấp thụ quang ở bước sóng 700nm. Năng lực khử Fe của tỏi tăng liên tục trong quá trình lên men. Cụ thể, năng lực khử Fe của tỏi nguyên liệu là 0,23, trong khi đó giá trị này của tỏi sau 5 và 13 ngày lên men lần lượt là 0,39 và 0,55. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với một số nghiên cứu trước đây, theo Choi và cộng sự (2014), tỏi được lên men trong 35 ngày ở điều kiện nhiệt độ 70 ºC và độ ẩm 90%, khả năng khử gốc tự do DPPH của tỏi lên men ở ngày thứ 7 và 21 lần lượt là 37,32 và 74,48% cao hơn so với tỏi tươi nguyên liệu (4,65%). Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng thời gian lên men đến ngày thứ 35 thì khả năng khử gốc tự do DPPH của tỏi đen giảm xuống còn 63,09%. Cũng theo nghiên cứu này, tổng năng lực khử của tỏi tăng gấp khoảng 10 lần so với tỏi tươi nguyên liệu sau 21 ngày lên men (từ 30,55 Mn TE đến 322,70 Mn TE). Để đánh giá sự thay đổi sự thay đổi hoạt tính chống oxy hóa của tỏi theo thời gian lên men, Choi và cộng sự đã sử dụng các phương pháp như khả năng khử gốc tự do DPPH, ABTS, FRAP và tổng năng lực khử và kết quả thu được đều cho thấy rằng hoạt tính chống oxy hóa của tỏi tăng theo thời gian lên men và đạt cao nhất vào ngày thứ 21 trong 35 ngày lên men [28]. Sự tăng lên của hoạt tính chống oxy hóa trong tỏi theo thời gian lên men có thể được giải thích như sau: các chất chống oxy hóa chính của tỏi như polyphenol, flavonoid và S-allyl cysteine tăng lên trong quá trình lên men. Thật vậy, nghiên cứu này đã chỉ ra rằng polyphenol tăng theo thời gian lên men. Theo Choi và cộng sự 47 (2014), mẫu tỏi được lên men trong 35 ngày ở điều kiện nhiệt độ 70 ºC và độ ẩm 90%, hàm lượng flavonoid tăng dần theo thời gian lên men, hàm lượng flavonoid của tỏi tươi nguyên liệu là 3,22 mg RE/g, trong khi hàm lượng này của tỏi ở ngày lên men thứ 14 và 35 lần lượt là 8,34 và 15,70 mg RE/g [28]. Theo Wang và cộng sự (2010), tỏi sau khi lên men 40 ngày ở điều kiện nhiệt độ 65-80ºC và độ ẩm 7080% có hàm lượng S-allyl cysteine tăng gấp 8 lần so với tỏi tươi nguyên liệu [50]. Theo Vũ Bình Dương và cộng sự (2012) nghiên cứu định lượng S-allyl-L-cysteine trong tỏi đen Lý Sơn bằng sắc khí lỏng hiệu năng cao, kết quả hàm lượng S-allyl-Lcysteine của tỏi thay đổi theo thời gian lên men và đạt cao nhất sau 35 ngày lên men [2]. Theo kết quả thu được và kết quả các nghiên cứu trước có thể kết luận rằng: Hoạt tính chống oxy hóa của tỏi tăng dần theo thời gian lên men. 48 (A) (B) Hình 3.7. Mối tương quan giữa hàm lượng polyphenol tổng số với khả năng khử gốc tự do DPPH (A) và tổng năng lực khử (B). 49 Để chứng minh cho đóng góp của polyphenol vào khả năng chống oxy hóa của dịch chiết tỏi đen, mối tương quan giữa hàm lượng polyphenol tổng số với khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử của tỏi trong quá trình lên men được mô tả (Hình 3.6 A&B). Kết quả cho thấy polyphenol là nhóm hợp chất đóng góp chính vào khả năng chống oxy hóa của tỏi, thể hiện qua sự tương quan chặt chẽ giữa hàm lượng polyphenol với hoạt tính chống oxy hóa, với hệ số tương quan là 0,95 cho khả năng bắt gốc tự do DPPH và 0,82 cho tổng năng lực khử. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Thitilertdecha và cộng sự (2008) trên đối tượng quả chôm chôm, Thitilertdecha và cộng sự đã khẳng định rằng chôm chôm có khả năng chống oxy hóa cao có thể là do thành phần phenolic của nó [5]. Theo Fu và cộng sự (2011) nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của 51 loại thảo dược và trà sản xuất tại Trung Quốc cũng cho thấy mối tương quan cao giữa hàm lượng polyphenol tổng số với khả năng chống oxy hóa [7]. Điều này chỉ ra rằng polyphenol chính là thành phần chống oxy hóa chính trong thực vật. Như vậy, trong quá trình lên men hàm lượng polyphenol cũng như khả năng chống oxy hóa của dịch chiết tỏi đen tăng lên đáng kể sau 13 ngày. Điều này cho thấy tiềm năng sử dụng tỏi đen trong việc ngăn ngừa và phòng một số bệnh, đăc biệt là những bệnh liên quan đến quá trình oxy hóa. Hàm lượng polyphenol tổng số có mối tương quan chặt chẽ với khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử của tỏi trong thời gian lên men. 50 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN Tỏi đen là một sản phẩm được chú ý rất lớn trong thời gian gần đây bởi những hoạt tính y dược quý của nó. Mặc dù vậy, việc tiêu thụ tỏi đen tại thị trường Việt Nam còn tương đối hạn chế. Một trong những nguyên nhân này là thiếu bằng chứng khoa học về khả năng chữa bệnh của nó. Ngoài ra, sản phẩm tỏi đen có mặt trên thị trường Việt Nam hầu hết đều có nguồn gốc từ nước người như Nhật Bản và Hàn Quốc; điều này dẫn đến giá thành sản phẩm cao. Để khắc phục những vấn đề này, nghiên cứu hiện tại đánh giá sự thay đổi một số thành phần lý hóa và khả năng chống oxy hóa của tỏi đen theo thời gian lên men. Đây là lần đầu tiên thực hiện nghiên cứu trên đối tượng tỏi Phan Rang. Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng polyphenol, một nhóm hợp chất quý trong thực phẩm, tăng lên khoảng 4 lần sau hơn 10 ngày lên men. Cùng với đó, khả năng chống oxy hóa của tỏi cũng tăng liên tục theo quá trình lên men. Kết quả nghiên cứu này là bằng chứng quan trọng cho việc sử dụng tỏi đen như một nguồn dược liệu quý. Kết quả cũng là cơ sở quan trọng để đề xuất quy trình sản xuất tỏi đen từ nguồn nguyên liệu trong nước, trong đó có tỏi Phan Rang. Để có thể triển khai sản xuất rộng rãi tỏi đen, các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào một số hướng dưới đây: - Nghiên cứu trên các đối tượng tỏi nguyên liệu khác nhau. Nước ta có rất nhiều loài tỏi khác có chất lượng cao và đã có thương hiệu trên thị trường như tỏi Lý Sơn, tỏi Hà Nội,... Thành phần hóa học của mỗi loài tỏi là khác nhau, vì vậy cần tiến hành nghiên cứu trên từng loài tỏi cụ thể. - Lên men tỏi trong các điều kiện khác nhau về nhiệt độ và độ ẩm. Ở mỗi điều kiện lên men khác nhau về nhiệt độ và độ ẩm sẽ có những thay đổi khác nhau về thành phần hóa lý cũng như hoạt tính chống oxy hóa của tỏi theo thời gian lên men. - Trong quá trình lên men tỏi, có rất nhiều sự thay đổi của các hoạt chất sinh học, do đó cần đánh gía toàn diện sự thay đổi các hoạt tính sinh học của tỏi trong thời gian lên men bên cạnh khả năng chống oxy hóa. 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1. Lê Tuấn Anh (2014), Thu nhận polyphenol từ cây bắp và thử nghiệm trong sản xuất đồ uống, Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Nha Trang. 2. Vũ Bình Dương và cộng sự (2012), Nghiên cứu định lượng S-allyl-L-cystein trong tỏi đen Lý Sơn bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, Tạp chí y dược học quân sự, Học viện quân y Việt Nam. 3. Vũ Bình Dương, Nguyên Văn Long (2015), Nghiên cứu tính an toàn của dịch chiết tỏi đen Lý Sơn trên thực nghiệm, Tạp chí y dược học quân sự, Học viện quân y Việt Nam. 4. Lại Thị Ngọc Hà, Vũ Thị Thư (2009), Stress oxi hóa và các chất chống oxy hóa tự nhiên, Tạp chí Khoa học và phát triển 2009, số 5, tr.667-677. 5. Nguyễn Thanh Hải, Bùi Thị Nho (2013), Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết tỏi (Allium sativum L) đối với E.coli gây bệnh và E.coli kháng Ampicillin, Kanamycin,Tạp chí khoa học và phát triển 2013, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. 6. Nguyễn Thị Mỹ Hiền (2014), Nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ sargassum mcclurel in vitro và ứng dụng để hạn chế sự oxy hóa lipid trên thịt cá thu, Đồ án tốt nghiệp, Trường Đại học Nha Trang. 7. Đặng Văn Hợp và cộng sự (2005), Phân tích kiểm nghiệm thực phẩm thủy sản, Nhà xuất bản 8. Nguyễn Thị Mỹ Li (2014), Nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của dịch chiết trà giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum in vitro và ứng dụng để hạn chế oxy hóa lipid trên cơ thể cá thu, Đồ án tốt nghiệp, Trường Đại học Nha Trang. 9. Trần Thị Luyến (1998), Công nghệ chế biến sản phẩm lên men, Nhà xuất bản nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh. 10. Hồ Thị Ánh Như (2014), Nghiên cứu tách chiết và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ hạt tiêu, Đồ án tốt nghiệp, Trường Đại học Nha Trang. 52 11. Heinrich P.Koch-Larry D.Lauson (2000) - Trần Việt Thắng dịch, Tỏi-khoa học ứng dụng và chữa bệnh, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật. 12. Bùi Thị Tho (2011), Cây tỏi và ứng dụng trong thú y, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. 13. Cao Thị Minh Thùy (2014), Nghiên cứu khả năng chống oxy hóa lipid của acid ascorbic đến chất lượng của cá lớp phi lê đông lạnh, Đồ án tốt nghiệp Đại học, Trường Đại học Nha Trang. 14. Tiêu chuẩn Việt Nam 7038:2002 15. Hoàng Thị Trang (2014), Nghiên cứu tính chất hóa lý và đặc tính sinh học của lectin chiết từ củ tỏi, Đồ án tốt nghiệp Đại học, trường Đại học Nha Trang. 16. Nguyễn Thị Ngọc Trinh (2014), Nghiên cứu tính chất hóa lý và đặc tính sinh học của lectin chiết từ lá tỏi (Allium sativum L), Đồ án tốt nghiệp Đại học, Trường Đại học Nha Trang. 17. Lê Ngọc Tú (2003), Hóa học thực phẩm. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. 18. Hồ Anh Sơn và Vũ Bình Dương (2014), Nghiên cứu tác dụng bảo vệ của dịch chiết tỏi đen đối với một số cơ quan lympho trên chuột bị chiếu xạ, Tạp chí y dược học quân sự, Học viện quân y Việt Nam. Tài liệu Tiếng Anh 19. Amagase, H., Petesch, B. L., Matsuura, H., Kasuga, S., Itakura, Y.,(2001). Intake of Garlic and Its Bioactive Coponents. 20. Anesini, C., Ferrado, G. E., and filip R.,(2008). Total polyphenol contents and antioxidant capacity of commercially available tea (Camellia sinensis) in Argentina, Journal of Argicultural and Food Chemistry, 56, pp 9225-9229. 21. Antolovich, M ., Prenzler, P. D., Patsalides, E., Donald, S. M and Robards, K .,(2001). Methods for testing antioxidant activity, School of Science and Technology, Charles Sturt University, pp. 183–198. 22. AOAC (1990). Official Methods of Analysis of AOAC International, 15th ed.; Association of Official Analytical of Official Aanalytical Communities: Washington, DC, USA. 53 23. Apak, R., Gorinstein, S., Böhm, V., Schaich, K. M., Özyürek, M., and Güçlü, K., (2013). Methods of measurement and evaluation ofnatural antioxidant apacity/activity (IUPAC Technical Report), Pure Appl. Chem, 85(5), pp. 957–998 24. Bae S. U., Cho S. Y., Won Y. D., Lee S. H.,Park H. J. (2013). Change in Sallyl cysteine contents and physicochemical properties of black garlic during heat treatment, Food science and technology 55, pp. 397-402. 25. Bligh, E. G., & Dyer, W. J. (1959). A rapid method of total extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology, 37, 911-917. 26. Cavallito C.J and Bailey, J.H (1944). Allicin , the antibacterial principle of Allium sativum I. Isolation, physical properties and bacterial cation. J. Am. Chem. Soc, 66, pp 1950-1951. 27. Celline, L., Campi, E. D., Masulli, M., Bartolomeo, S. D., Allocati, N.. Inhibition of Helicobacter pylory by garlic extracts (Allium sativum).FEMS Immunology and Medical Microbiology, 13, 273-277. 28. Choi, S. I., Cha H. S., Lee Y. S. (2014). Physicochemical and Antioxidant Properties of Black Garlic, Molecule, 19, pp. 16811-16823. 29. Cies’lik, E., Greda, A., Adamus, W. (2004), Contents of polyphenols in fruit and vegetables, Food Chemistry, pp 135-142. 30. Fu, H.Y., Shieh, D.E. (2002). "Antioxidant and free radical scavenging activities of edible mushrooms", Journal of Food Lipid, 9, p. 35-46. 31. Ghani, M. J. Abdul (2010). Determination of Alliin and Allicin in different types Garlic using High Performance Liquid Chromatography, J. of university of anbar for pure science: Vol 4:No 2:2010. 32. Ide, N., Benjamin, H. S. Lau (1999). S-Allylcysteine Attenuates Oxidative Stress in Endothelial Cells, Drug development and Industrial Phamarcy, pp. 619-624. 33. Iris F. F. Benzie and J. J. Strain (1996). The Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP) as a Measure of ‘‘Antioxidant Power’’: The FRAP Assay, analytical biochemistry, pp. 239,70–76. 54 34. ISO 6496. (1999). Animal feeding stuffs - Determination of moisture and other volatile matter content. Geneva, Switzerland: The International Organization for Standardization 35. Kim, J. S., Kang, O. J., Gweo, O. C., (2012). Comparison of phenolic acid and flavonoids in black garlic at difierent thermal processing steps, Journal of functional food 5, pp. 80-86. 36. Kim, J. Y., Hwang, Y. J., Hwang, K. A., Om A. S., Kin J. H., Cho K. J.(2011). The beneficial effects of aged black garlic extract on obesity and hyperlipidemia in rats fed a high-fat diet., 3160. 37. Kim, M. S., Kim M. J., Bang, W. S., Kim, K. S., Park, S. S. (2012). Determination of S-allyl-L-cystein, Diallyl Disulfide, and Total Amino Acids of Black Garlic after Spontaneous Short-term Fermention, Journal of the Korea Society of Food Science and nutrition, pp. 661-665. 38. Lee, Y. M., Gwenon, O. C, Seo, Y. J., Im J., Kang M. J., Kim, M. J., Kim, J. I.(2009). Antioxidant effect of garlic and aged black garlic in animal model of type 2 diabetes mellitus, Nutrition Research and Practice, pp 156-161. 39. Maldonado, ME, C. C., J, P.C.,(2005). Aged garlic extract, garlic power extract, S-allylcysteine, diallylsulfide and diallyldisulfide donotinterfere with the antibiotic activity of gentamicin. Phytotherapy Research, 19, pp 252-254. 40. Malencic, D., Jelena, C., Jegor, M.,(2012). Polyphenol content and antioxidant properties of colored soybean seeds from central Europe, J Med Food, pp 89-95. 41. Marja P., Hopia, A. I., Vuorela, H. J., Rauha, J. P., Pihlaja, K., Kulaja, K., Heinonen, M., (1999). Antioxidant Activity of Plant Extracts Containing Phenolic Compounds, pp 3954-3962. 42. Meyers, M. (2006), Garlic an herb Society of America Guide, pp 8. 43. Miao, Y., Chen, J., Zhou, G., Xu, X., Zhang, Q., Wang, J. (2014). The Antihypertensive Effect of Black Garlic (Allium Sativum) in Spontaneously Hypertensive Rats via Scavenging of Free Radicals. 55 44. Oyaizu, M. (1986). Antioxidative activity of browning products of glucosamine fractionated by organic solvent and thin-layer chromatography, Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, 35, pp. 771-775. 45. Purev, U., Chung, M. J., Oh, D. H., (2012), Individual differences on immunostimulatory activity of raw and black garlic extract in human primary immune cells.. 46. Sangeetha, T., Darlin-quine, S (2006). Preventive effect of S-allyl cysteine sulfoxide (allin) on cardiacmarker enzym sand lipids in isoproterenolinducedmyocardialinjury, Journal of Phamacy and Phamacology, 58, 7617-623. 47. Singleton, V.L., Orthofer, R., Lamuela-Raventos, R.M. (1999).Analysis of total phenol andother oxidation substrates and antioxidants by means of Folin– Ciocalteu reagent, Method Enzymol, 299, p. 152–78. 48. Singh N. and Rajini P. S. (2004). Free radical scavenging activity of an aqueous extract of potato pell. Food chemistry, 85, pp 611-616. 49. Vauzour, D., Mateos, A. R., Corona, G., Concha, M. J. O., Spencer, J. P.E(2010). Polyphenols and Human Health: Prevention of Disease and Mechanisms of Action, Nutrients, 2, 1106-1131. 50. Wang, D., Feng, Y., Liu, J., Yan, J., Wang, M., sasaki, J. I., Lu, C. (2010). Black garlic (Allium sativum) extracts enhance the immune system, Medicinal and Aromatic Plant Science and Biotechnology, pp 37-40. Tài liệu Internet 51. http://www.botanyvn.com/ 52. http://fnc.vn/ 53. http://tapchiyduochocquansu.vn/ 54. http://trungtamnghiencuuthucpham.vn/ 1PL PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: Xác định hàm lượng ẩm theo tiêu chuẩn ISO 6496:1999 Nguyên lý: Dùng nhiệt độ cao để làm bay hơi hết hơi nước trong mẫu, sau đó dựa vào hiệu số khối lượng của mẫu trước và sau khi sấy để tính hàm lượng ẩm có trong mẫu. Chuẩn bị mẫu: Cát được rửa sạch, phơi khô và đem sấy ở nhiệt độ 130 ºC trong khoảng 2 giờ, lấy ra để nguội ở bình hút ẩm rồi đem cân, làm lại thao tác trên đến khi nào giữa 2 lần cân liên tiếp sai khác không quá 5.10-4. Cốc và mẩu đũa thủy tinh được sấy ở nhiệt độ 100-105 ºC trong khoảng 1 giờ, lấy ra làm nguội ở bình hút ẩm rồi đem cân; làm lại thao tác trên đến khi nào giữa 2 lần cân liên tiếp sai khác không quá 5.10-4. Mẫu tỏi được đồng nhất bằng đũa thủy tinh trước khi lấy mẫu. Tiến hành: Cho 1 thìa cát và mẩu đũa thủy tinh vào cốc sấy, đem cân (m1). Tiếp tục cho 4g mẫu vào cốc sấy, đem cân (m2). Dùng mẩu thủy tinh dàn đều mẫu và cát. Sau đó, đem cốc sấy ở nhiệt độ 103 ºC trong 4 giờ. Sau 4 giờ, lấy cốc ra để nguội ở bình hút ẩm 30 phút, rồi đem cân (m3). Công thức tính hàm lượng ẩm: %W = (m2 – m3)/(m3 – m1) Trong đó: W: hàm lượng ẩm của mẫu (%) m1: Khối lượng cốc sấy, mẩu đũa thủy tinh và cát m2: Khối lượng cốc sấy, mẩu đũa thủy tinh, cát và mẫu trước khi sấy. m3: Khối lượng cốc sấy, mẩu đũa thủy tinh, cát và mẫu sau khi sấy. 2PL PHỤ LỤC 2: Xác định hàm lượng tro theo TCVN 7038:2002 Nguyên lý: Dùng sức nóng (550-600 ºC) nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ. Phần còn lại đem cân và tính ra hàm lượng tro toàn phần trong thực phẩm. Tiến hành: Nung cốc sứ đã được rửa sạch ở lò nung tới 550-600 ºC đến khối lượng không đổi. Để nguội ở bình hút ẩm và cân ở cân phân tích chính xác đến 10-4. Cho vào chén khoảng 5g mẫu, nung ở bếp điện cho đến khi thành tro đen không bốc cháy nữa. Sau đó, cho tất cả vào lò nung và tăng nhiệt độ từ từ cho đến 550-600 ºC. Nung cho đến tro trắng, nghĩa là đã loại hết các chất hữu cơ, thông thường nung khoảng 7-8 giờ. Trong trường hợp còn tro đen, lấy ra để nguội, cho thêm vài giọt H2O2 10 thể tích hoặc HNO3 đậm đặc và nung lại cho đến tro trắng. Để nguội trong bình hút ẩm và đem cân. Tiếp tục nung thêm ở nhiệt độ trên trong 30 phút nữa rồi để nguội trong bình hút ẩm rồi cân, lặp đi lặp lại thao tác này cho tới trọng lượng không đổi. Kết quả giữa 2 lần nung và cân liên tiếp sai số không quá 5.10-4g. Công thức tính: X (%) = (G2 – G)/(G1 –G) Trong đó: X: hàm lượng tro theo phần trăm (%) G1: Khối lượng cốc nung và mẫu (g) G2: Khối lượng chén nung và tro trắng (g) G: Khối lượng chén nung (g) Chú ý: Khi cốc nung còn nóng để vào bình hút ẩm, nhớ để nắp hé mở lúc đầu hoặc mở vòi không khí trên nắp bình hút ẩm tránh không khí nóng nở ra đẩy bật làm vỡ nắp bình. 3PL PHỤ LỤC 3: Xác định hàm lượng acid tổng Hàm lượng acid tổng trong tỏi được xác định theo phương pháp chuẩn độ của AOAC:1990. 6 g tỏi được đồng hóa với 50 mL nước cất sau đó đem li tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong thời gian 15 phút. Dịch li tâm được chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến đến pH 8,3. Thể tích NaOH 0,1N sử dụng được dùng để tính toán hàm lượng acid tổng. Kết quả được thể hiện là mg acid tartaric/kg tỏi. PHỤ LỤC 4: Xác định hàm lượng polyphenol tổng số Hàm lượng polyphenol tổng được xác định bằng phương pháp của Singleton và cộng sự (1999) với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Lấy 0,1 ml dịch chiết trộn với 0,9 ml nước cất . Sau đó, cho thêm 1 ml thuốc thử Folin - Ciocalteu 10% và 2,5 ml Na2CO3 7,5%. Lắc đều hỗn hợp bằng máy Vortex. Hỗn hợp được giữ ở chỗ tối ở nhiệt độ phòng trong 30 phút trước khi đo ở bước sóng 760 nm trên máy quang phổ kế (Spectrophotometry, Carry 50, Varian, Australia). Kết quả được báo cáo bởi mg acid gallic/ g nguyên liệu khô. Mỗi phân tích được tiến hành lặp lại 2 lần, kết quả báo cáo là giá trị trung bình. PHỤ LỤC 5: Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH Khả năng khử gốc tự do được xác định được xác định bằng phương pháp của Fu và cộng sự (2002) với một vài sự hiệu chỉnh nhỏ. Lấy 0,02 ml mẫu dịch chiết trộn với nước cất để đạt được thể tích tổng cộng là 3 ml. Sau đó thêm 1 ml dung dịch DPPH. Đồng thời, chuẩn bị mẫu trắng bằng cách tương tự như trên nhưng thay thế 1 ml dung dịch DPPH bằng 1 ml dung dịch Ethanol và chuẩn bị mẫu control bằng cách lấy 1 ml dung dịch DPPH và 3 ml dung dịch nước cất. Tất cả ống nghiệm được lắc đều bằng máy Vortex và để yên trong tối 20 phút. Sau đó, đo độ hấp thụ quang học ở bước sóng 517 nm (Spectrophotometry, Carry 50, Varian, Australia). Khả năng khử gốc tự do được xác định bằng công thức: DPPH (%) = 100.(A1 – A0)/A0 4PL Trong đó: A0: Độ hấp thụ quang học của mẫu trắng không có dịch chiết. A1: Độ hấp thụ quang học của mẫu có dịch chiết. Kết quả báo cáo bới giá trị %DPPH, giá trị này càng cao thì hoạt tính khử gốc DPPH càng cao. Mỗi phân tích được tiến hành lặp lại 2 lần, kết quả báo cáo là giá trị trung bình. PHỤ LỤC 6: Xác định tổng năng lực khử . Năng lực khử được xác định theo phương pháp của Oyaizu (1986) với một vài sự hiệu chỉnh nhỏ. Lấy 1ml dịch chiết trộn với đệm phosphate pH=6,6 để đạt được thể tích cuối cùng 1,5 ml trước khi thêm 0,5 ml K3(Fe[CN]6) 1%. Hỗn hợp được ủ ở 50 °C trong 20 phút, sau đó thêm 0,5 ml TCA 10% và 2ml nước cất, cuối cùng cho thêm 0,4ml AlCl3 0,1%. Độ hấp thu quang học được xác định tại bước sóng 700nm (Spectrophotometry, Carry 50, Varian, Australia). Độ hấp thu quang học càng cao thì năng lực khử càng mạnh. Mỗi phân tích được tiến hành lặp lại 2 lần, kết quả báo cáo là giá trị trung bình. [...]... được sự thay đổi hoạt tính chống oxy hóa của tỏi theo thời gian lên men 3 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu Tỏi Phan Rang được lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu trong đề tài này: - Tên khoa học: Allium sativum - Tên Tiếng Việt: Tỏi - Tên Tiếng Anh: Garlic 3.2 Phạm vi nghiên cứu Xác định sự thay đổi hoạt tính chống oxy hóa của tỏi theo thời gian lên men thông qua việc đánh giá sự thay. .. thay đổi hàm lượng tro của tỏi theo thời gian lên men - Xác định sự thay đổi hàm lượng acid tổng của tỏi theo thời gian lên men - Xác định sự thay đổi hàm lượng polyphenol tổng số của tỏi theo thời gian lên men - Xác định sự thay đổi hoạt tính chống oxy hóa của tỏi theo thời gian lên men 3 5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 5.1 Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là nguồn tài liệu tham... thay đổi một số thành phần hóa lý và hoạt tính chống oxy hóa của tỏi ở từng ngày lên men 4 Nội dung nghiên cứu - Nguyên liệu tỏi tươi được tiến hành xác định một số thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa, đây là yếu tố nghiên cứu đầu vào làm căn cứ để so sánh với sản phẩm đầu ra - Xác định sự thay đổi hàm lượng nước của tỏi theo thời gian lên men - Xác định sự thay đổi hàm lượng tro của tỏi theo. .. cứu này lựa chọn tỏi Phan Rang để tiến hành nghiên cứu, vì đây là loài tỏi có chất lượng cao và được người tiêu dùng ưa chuộng; đặc biệt chưa có một công bố nào về hoạt tính chống oxy hóa của tỏi đen từ nguồn nguyên liệu này Xuất phát từ những vấn đề trên, trong nghiên cứu này tiến hành Nghiên cứu sự thay đổi hoạt tính chống oxy hóa của tỏi (Allium sativum) Phan Rang theo thời gian lên men 2 Mục tiêu... hơn Theo một số nghiên cứu cho thấy hàm lượng polyphenol tổng số của tỏi tăng dần theo thời gian lên men và có hoạt tính sinh học cao Theo Choi và cộng sự (2014), sự thay đổi hàm lượng polyphenol tổng số của tỏi sau 35 ngày lên men ở điều kiện nhiệt độ 70 ºC và độ ẩm không khí tương đối 95% được thể hiện ở bảng sau (Bảng 1.5)s Bảng 1.5 Sự thay đổi hàm lượng polyphenol tổng số của tỏi theo thời gian lên. .. nghiên cứu khác [24] Theo Wang và cộng sự (2010), tỏi sau khi lên men 40 ngày ở nhiệt độ 65-80 ºC và độ ẩm 70-80%, hàm lượng SAC tăng gấp 8 lần so với tỏi tươi [50] Sự biến đổi về cảm quan của tỏi sau khi lên men Màu sắc: màu đen Sự biến đổi cường độ màu nâu của tỏi theo thời gian lên men có liên quan chặt chẽ đến phản ứng biến nâu phi enzym dưới tác dụng của nhiệt như phản ứng Maillard, phản ứng oxy. .. amin chống mỏi mệt, thúc đẩy sự phân hủy của đường, kiểm soát sự gia tăng lượng đường trong máu Theo Miao và cộng sự (2014), tỏi đen có tác dụng chống chứng tăng huyết áp và hạn chế sự hình thành gốc tự do [43] Chống oxy hóa, cải thiện làn da: Tác dụng chống oxy hóa của tỏi đen rất cao nhờ các chất chống oxy hóa Dẫn xuất Tetrahydro-β-carboline trong tỏi đen được xem như chất có khả năng chống ôxy hóa. .. phòng chống sự phát triển của tế bào ung thư (Ide và Lau, 1996; Bae và cộng sự, 2014) [24], [32] Kết quả của nhiều nghiên cứu cho thấy sự tăng hoạt chất S-allyl cysteine (SAC) là sự thay đổi quan trọng nhất trong quá trình lên men tỏi đen Hàm lượng SAC trong tỏi tươi khoảng 20-30 µg/g, sau khi lên men hàm lượng này của tỏi đen cao gấp 5-6 lần so với tỏi tươi (Bae và cộng sự, 2014; Wang và cộng sự, 2010)... tắc hoạt động, các chất chống oxy hóa được phân thành 2 loại: các chất chống oxy hóa bậc I, các chất chống oxy hóa bậc II 1.5.2.1 Cơ chế hoạt động của các chất chống oxy hóa Các chất chống oxy hóa bậc 1: Vô hoạt các gốc tự do Khử các gốc tự do: 20 L* + A LH + A* LOO* + AH LOOH + A* LO* + AH LOH + A* Tạo hợp chất với các gốc tự do: A* + LOO* LOOA A* + LO* LOA Các chất chống oxy hóa bậc II: ngăn chặn sự. .. xảy ra Theo Choi và cộng sự (2014) cho thấy hàm lượng carbohydrat của tỏi tăng khoảng 6 lần trong thời gian lên men, từ 2,73 g/kg (ở ngày lên men thứ 7) đến 16,07 g/kg (ở ngày lên men thứ 35) và nhiều số liệu cao hơn so với hàm lượng carbohydrat của tỏi tươi là 1,52 g/kg [28] Theo nghiên cứu khác của Wang và cộng sự (2010), hàm lượng cacbohydrat trong tỏi tươi là 28,7%, sau khi tỏi được lên men trong ... Sự thay đổi màu sắc tỏi theo thời gian lên men .36 3.2 Sự thay đổi hàm lượng nước tỏi theo thời gian lên men 37 3.3 Sự thay đổi hàm lượng tro tỏi theo thời gian lên men .39 3.4 Sự thay. .. thay đổi hàm lượng acid tổng tỏi theo thời gian lên men 40 v 3.5 Sự thay đổi hàm lượng polyphenol tổng số tỏi theo thời gian lên men 42 3.6 Sự thay đổi hoạt tính chống oxy hóa tỏi theo thời gian. .. bố hoạt tính chống oxy hóa tỏi đen từ nguồn ngun liệu Xuất phát từ vấn đề trên, nghiên cứu tiến hành Nghiên cứu thay đổi hoạt tính chống oxy hóa tỏi (Allium sativum) Phan Rang theo thời gian lên