BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ----o0o---- LÊ THÁI DUNG NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CÁC LOẠI ACID ĐẾN KHẢ NĂNG THU HỒI HỖN HỢP CAROTEN-PROTEIN TỪ ĐẦU TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP Ủ XI LÔ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Nha Trang, tháng 06 năm 2015 BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ----o0o---- LÊ THÁI DUNG NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CÁC LOẠI ACID ĐẾN KHẢ NĂNG THU HỒI HỖN HỢP CAROTEN-PROTEIN TỪ ĐẦU TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP Ủ XI LÔ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM GVHD: ThS. PHẠM THỊ ĐAN PHƯỢNG Nha Trang, tháng 06 năm 2015 i LỜI CẢM ƠN Đề tài này đã được hoàn thành nhờ sự giúp đỡ tận tình của rất nhiều thầy cô giáo, bạn bè, gia đình và các tập thể trường Đại học Nha Trang. Qua đây em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới các cá nhân và tập thể đã giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Trang Sĩ Trung đã tạo điều kiện cho tôi được tham gia Đề tài: Nghiên cứu sản xuất các sản phẩm giá trị gia tăng từ phế liệu tôm để ứng dụng trong nông nghiệp do Bộ Khoa học và Công nghệ cấp. Tôi xin chân thành gởi lời cám ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn ThS. Phạm Thị Đan Phượng hết lòng chỉ bảo, tạo điều kiệnđã hướng dẫn tận tình, thường xuyên theo dõi quá trình thực hiện đề tài. Cám ơn sự giúp đỡ của ThS. Nguyễn Công Minh, ThS. Nguyễn Thị Như Thường đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Xin chân thành cám ơn Ban Giám hiệu, các anh, chị tại Phòng Khoa Công nghệ Thực phẩm, Trung tâm thí nghiệm thực hành, Công nghệ sinh học và Môi trường Trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện cho tôi thuận lợi trong quá trình học tập, nghiên cứu đề tài. Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thành viên trong gia đình, các bạn đồng môn đã động viên,luôn bên cạnh và giúp đỡ để em có thể hoàn thành đề tài này. Trong quá trình nghiên cứu và tiến hành thực hiện đề tài cũng như quá trình hoàn thành báo cáo thì do kinh nghiệm thực tiễn, vốn kiến thức khoa học chưa sâu nên khả năng lập luận còn nhiều thiếu sót. Mong thầy cô và các bạn đóng góp ý kiến để bài báo cáo được hoàn thiện. Nha trang, tháng 6 năm 2015 Sinh viên thực hiện Lê Thái Dung ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. i MỤC LỤC .................................................................................................................. ii DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................... v DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... vi MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN....................................................................................... 3 1.1. Tổng quan về phế liệu tôm.................................................................................... 3 1.1.1. Giới thiệu chung về phế liệu tôm ....................................................................... 3 1.1.2. Thành phần, tính chất của phế liệu tôm đầu, vỏ tôm........................................... 3 1.2. Các nghiên cứu trong nước liên quan tới đề tài ..................................................... 4 1.3. Các nghiên cứu ngoài nước liên quan tới đề tài ..................................................... 6 1.4. Tìm hiểu về caroten – protein ............................................................................... 7 1.4.1. Bản chất của caroten – protein ........................................................................... 7 1.4.2. Carotenoid ......................................................................................................... 7 1.4.3. Bản chất của astaxanthin .................................................................................... 9 1.4.4. Protein ............................................................................................................. 12 1.4.5. Ứng dụng của caroten – protein ....................................................................... 12 1.5. Tách chiết caroten-protein bằng phương pháp ủ xi lô .......................................... 13 1.5.1. Phương pháp ủ xi lô ......................................................................................... 13 1.5.2. Vai trò của emzyme có trong phế liệu tôm ....................................................... 16 1.6. Vai trò của acid trong quá trình thủy phân protein .............................................. 16 1.7. Acid vô cơ .......................................................................................................... 17 iii 1.7.1. Acid clohydric (HCl) ....................................................................................... 17 1.7.2. Acid sulfuric (H2SO4) ..................................................................................... 18 1.8. Acid hữu cơ ........................................................................................................ 18 1.8.1. Acid lactic ....................................................................................................... 18 1.8.2. Acid formic ..................................................................................................... 19 1.8.3. Acid propionic ................................................................................................. 19 1.9. Các phương pháp tách chiết hỗn hợp caroten-protein trong quá trình sản xuất chitin ......................................................................................................................... 20 1.9.1. Phương pháp vật lí ........................................................................................... 20 1.9.2. Phương pháp hóa học ....................................................................................... 21 1.9.3. Phương pháp sinh học ..................................................................................... 22 1.10. Phương pháp thu hồi caroten – protein.............................................................. 23 1.10.1. Phương pháp thu hồi caroten – protein bằng pH ............................................. 23 1.10.2. Phương pháp thu hồi caroten – protein bằng nhiệt độ ..................................... 23 1.10.3. Phương pháp thu hồi caroten – protein bằng chất trợ lắng (chitosan) ............. 23 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................... 25 2.1. Vật liệu nguyên cứu ............................................................................................ 25 2.1.1. Nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng ................................................................. 25 2.1.2. Acid HCl ......................................................................................................... 26 2.1.3. Acid lactic ....................................................................................................... 26 2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 27 2.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ..................................................................... 27 2.2.2. Xác định nồng độ HCl bổ sung ........................................................................ 29 2.2.3. Xác định thời gian xử lý acid HCl ................................................................... 30 iv 2.2.4. Xác định nồng độ acid lactic ............................................................................ 32 2.2.5. Xác định thời gian xử lý acid lactic .................................................................. 33 2.3. Các phương pháp phân tích, kiểm tra. ................................................................. 35 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 36 3.1. Thành phần hóa học cơ bản của nguyên liệu ...................................................... 36 3.2. Điều kiện xử lý đầu tôm thích hợp acid HCl ..................................................... 36 3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ acid HCl sử dụng đến hiệu suất thu hồi và hàm lượng astaxanthin của hỗn hợp caroten-protein .......................................................... 37 3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân HCl đến hiệu suất thu hồi và hàm lượng astaxanthin của hỗn hợp caroten-protein .................................................................... 38 3.3. Điều kiện xử lý đầu tôm thích hợp với acid latic ................................................ 40 3.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ acid lactic sử dụng đến hiệu suất thu hồi và hàm lượng astaxanthin của hỗn hợp caroten-protein .......................................................... 40 3.3.2. Ảnh hưởng của thời gian xử lí acid lactic đến hiệu suất thu hồi và hàm lượng astaxanthin của hỗn hợp caroten-protein .................................................................... 42 3.4. Đề xuất hai quy trình thu hồi hỗn hợp caroten-protein tối ưu từ acid HCl và acid lactic .................................................................................................................. 44 3.4.1. Quy trình thu hồi hỗn hợp caroten-protein bằng acid HCl ................................ 44 3.4.2. Quy trình thu hồi hỗn hợp caroten-protein bằng acid lactic .............................. 45 3.5. Thành phần hóa học của hỗn hợp caroten-protein ............................................... 45 3.6. Đề xuất quy trình thu nhận hỗn hợp caroten-protein .......................................... 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................... 49 PHỤ LỤC.................................................................................................................. 53 v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm thẻ chân trắng. ............................ 4 Bảng 1.4. Các ứng dụng chính của hỗn hợp protein và carotenoid . ......................... 12 Bảng 1.9. Hàm lượng protein của phế liệu tôm trước và sau khi ép ........................... 20 Bảng 3.1. Thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm thẻ chân trắng ........................... 36 Bảng 3.4. Đánh giá cảm quan của hỗn hợp caroten-protein thu nhận từ đầu tôm............ 46 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Quy trình thu hồi caroten-protein từ phế liệu đầu tôm bằng chế phẩm vi sinh vật ( vi khuẩn Bacillus subtilic ) ........................................................................... 5 Hình 1.2. Các liên kết hóa học của astaxanthin với các phân tử khác trong tôm ......... 8 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của một vài astaxanthin ................................................... 9 Hình 1.4. Sự thay đổi cấu trúc phân tử astaxanthin khi tương tác với acid yếu ......... 11 Hình 1.5. Astacene.................................................................................................... 11 Hình 1.6. Crustaxanthin ............................................................................................ 12 Hình 2.1. Đầu tôm thẻ chân trắng.............................................................................. 25 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát .............................................................. 28 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ acid HCl thích hợp cho quá trình thủy phân. ......................................................................................................... 29 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian xử lý thích hợp với acid HCl ... 31 Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ acid lactic bổ sung cho quá trình thủy phân .......................................................................................................... 33 Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian xử lý thích hợp với acid lactic....... 34 Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ HCl đến hiệu suất thu hồi, hàm lượng astaxanthin của hỗn hợp caroten-protein. ................................................................. 37 Hình 3.2. Ảnh hưởng của thời gian xử lý HCl đến hiệu suất thu hồi, hàm lượng astaxanthin của hỗn hợp caroten-protein. ................................................................. 39 Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ acid lactic hiệu suất thu hồi, hàm lượng astaxanthin của hỗn hợp caroten-protein. ................................................................. 41 Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian xử lý acid lactic đến hiệu suất thu hồi, hàm lượng astaxanthin của hỗn hợp caroten-protein. ....................................................... 43 Hình 3.5. Quy trình thu hồi hỗn hợp caroten-protein bằng acid HCl ......................... 44 Hình 3.6. Quy trình thu hồi hỗn hợp caroten-protein bằng acid lactic ....................... 45 Hình 3.5. Quy trình thu hồi hỗn hợp caroten-protein ................................................. 47 1 MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Ngày nay, ngành công nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu ngày càng tăng mạnh. Đặc biệt sản lượng tôm xuất khẩu, theo báo cáo của bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông Thôn kim nghạch xuất khẩu năm 2014 ước tính đạt 7,9 tỷ USD, tăng 18% so với cùng kỳ năm ngoái. Sự tăng trưởng này chủ yếu nhờ vào kết quả xuất khẩu của mặt hàng tôm, với giá trị xuất khẩu cao nhất từ trước tới nay khoảng 4,1 tỷ USD, tăng 25% so với năm 2013. Và theo tổng cục thủy sản Việt Nam, trong năm 2014 tổng sản lượng đạt trên 660000 tấn bao gồm 400000 tấn tôm thẻ chân trắng và 260000 tấn tôm sú. Lượng phế liệu khoảng 240000 tấn/năm. Như vậy tôm là mặt hàng có mức tăng trưởng cao nhất trong nhóm các mặt hàng thủy sản xuất khẩu chính của Việt Nam.Nguyên liệu ngày một gia tăng nhanh hiện nay sẽ là nguồn cung cấp nguyên liệu khá dồi dào cho các ngành công nghiệp tận dụng nguồn nguyên liệu còn lại sau chế biến tôm để sản xuất ra các sản phẩm có giá trị khác. Tuy nhiên, hiện nay lượng nguyên liệu còn lại này chủ yếu chỉ được sử dụng để làm nguyên liệu cho quá trình sản xuất chitin mà chitosan màchưa chú trọng thu hồi các thành phần khác có giá trị, trong đó có protein. Các nghiên cứu cho thấy trong đầu tôm có chứa tới 50% hàm lượng protein [15] và có một lượng nhỏ carotenoid, tuy nhỏ nhưng mang chức năng sinh học quan trọng.Việc nghiên cứu thu nhận hỗn hợp caroten-protein ngày càng được quan tâm. Hỗn hợp carotenprotein được dùng để bổ sung vào thức ăn gia súc, nuôi trồng thủy sản, tăng màu sắc cho cá và tăng khả năng miễn dịch cho vật nuôi. Vì thế việc nghiên cứu thu hồi hỗn hợp caroten-protein từ đầu tôm là cần thiết. Những nghiên cứu trước đây nghiên cứu sử dụng các các loại acid để khử khoáng trong sản xuất chitin-chitosan mà chưa quan tâm đến các ảnh hưởng của các loại acid vô cơ và hữu cơ ảnh hưởng đến quá trình thu nhận hỗn hợp carotenprotein. 2 Đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng các loại acid đến khả năng thu hồi hỗn hợp carotenprotein từ đầu tôm bằng phương pháp ủ xilô” được đề xuất nhằm góp phần nâng cao sử dụng tài nguyên, đem lại giá trị kinh tế cao cho ngành thủy sản và giảm thiểu môi trường trong chế biến thủy sản tại Việt Nam. Kết quả của đề tài cũng sẽ là cơ sở để khuyến khích áp dụng công nghệ sản xuất caroten-protein vào trong công nghiệp. TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu ảnh hưởng các loại acid đến khả năngthu hồi hỗn hợp carotenprotein từ đầu tôm bằng phương pháp ủ xilô. NỘI DUNG: 1. Xác định thành phần hóa học của đầu tôm. 2. Xác định điều kiện thủy phân bằng acid chlohyric (nồng độ acid, thời gian ủ). 3. Xác định điều kiện thủy phân bằng acid lactic (nồng độ acid, thời gian ủ). 4. Đề xuất quy trình thu hồi hỗn hợp caroten-protein bằng phương pháp ủ xilô của từng acid. 5. Đánh giá chất lượng chế phẩm thu hồi từ hai quy trình trên và so sánh ưu nhược điểm của từng phương pháp. MỤC ĐÍCH Tìm được phương pháp thu hồi hỗn hợp caroten-protein hiệu quả nhất có thể áp dụng vào công nghiệp. Ý NGHĨA KHOA HỌC Đánh dấu bước đi quan trọng trong công tác nghiên cứu về tận thu chế phẩm caroten-protein: tìm ra phương pháp thu hồi hiệu quả ( sử dụng acid thích hợp) thu hồi caroten-protein đạt hiệu quả cao, tiết kiệm chi phí. Ý NGHĨA THỰC TIỄN Áp dụng công nghệ sản xuất caroten-protein vào trong công nghiệp. Sản xuất thức ăn cho cá hồi. PHẠM VI NGHIÊN CỨU Đầu tôm thẻ chân trắng từ tỉnh Khánh Hòa. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về phế liệu tôm 1.1.1. Giới thiệu chung về phế liệu tôm Trong những năm gần đây sản lượng tôm xuất khẩu ngày càng tăng. Vì vậy lượng phế liệu từ tôm cũng tăng mạnh. Tùy thuộc vào công nghệ chế biến và loại tôm khác nhau mà lượng phế liệu khác nhau từ 35-45% so với khối lượng của nguyên liệu ban đầu (Meyers, 1994) [22]. Việc tận dụng chế phẩm tạo ra sản phẩm có giá trị sử dụng là vấn đề được khuyến khích và đẩy mạnh để tăng nguồn lợi đồng thời góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường, đưa ngành thủy sản phát triển bền vững. 1.1.2. Thành phần, tính chất của phế liệu tôm đầu, vỏ tôm Hiện nay, việc nuôi tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) thương phẩm phát triển mạnh nên nguồn nguyên liệu còn lại sau chế biến tôm thẻ chân trắng thu được rất nhiều. Trong phế liệu tôm thành phần đáng kể nhất là chitin, calcicarbonat, sắc tố. Theo tạp chí khoa học học và công nghệ thủy sản (số 2/1995) thành phần hóa học của phế liệu tôm thẻ chân trắng đông lạnh. Protein: protein trong phế liệu tôm thường là loại protein không hoà tan do đó khó tách ly ra khỏi vỏ, tồn tại dưới 2 dạng: - Dạng tự do: Dạng này tồn tại trong cơ quan nội tạng và trong các cơ gắn phần vỏ. - Dạng phức tạp : Dạng này liên kết với chitin, CaCO3, như một phần thống nhất của vỏ tôm. Chitin: Tồn tại dưới dạng liên kết với protein, khoáng và nhiều hợp chất hữu cơ khác, chúng là nguyên nhân gây khó khăn cho việc tách và tinh chế chúng. Calci: Trong thành phần của vỏ tôm có chứa một lượng lớn muối vô cơ mà chủ yếu là CaCO3. Sắc tố: Trong vỏ tôm có nhiều loại sắc tố nhưng chủ yếu là astaxanthin là dẫn xuất của carotenoid, thường ở dạng liên kết với acid béo (ester hóa) hay với protein 4 tạo nên phức hợp chặt chẽ có màu xanh của tôm. Khi liên kết này bị phá vỡ thì astaxanthin dễ dàng bị oxy hóa thành astacene. Enzyme: Theo tạp chí thuỷ sản (số 5/1993) hoạt độ enzyme protease của đầu tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/g tươi. Qua nhiều nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký qua Coat Sephadex G 75 đã tách được ở đầu tôm 2 loại protease có khối lượng phân tử khác nhau. Ngoài ra còn có một số khoáng chất như P, K, Mg, Mn và Fe (Trang Sĩ Trung và cộng sự, 2010) [15]. Bảng 1.1. Thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm thẻ chân trắng [11] Chỉ tiêu Hàm lượng Hàm lượng ẩm (%) 78,7 ± 1,4 Hàm lượng protein (%)* 51,4 ± 3,3 Hàm lượng khoáng (%)* 20,4 ± 2,1 Hàm lượng lipid (%)* 14,3 ± 2,3 Chitin (%)* 10,5 ± 1,9 Carotenoid (mg/kg)* 110.9 ± 9,9 *Kết quả tính theo hàm lượng chất khô tuyệt đối 1.2. Các nghiên cứu trong nước liên quan tới đề tài Ngày nay, việc sử dùng phế liệu đầu tôm được nhiều nhà khoa học chú trọng, được biết đến nhiều nhất qua việc sản xuất chitin – chitosan, chiết rút các chất màu, chất mùi, phục vụ cho các ngành công nghệ. Trong thời gian gần đây việc nghiên cứu thu hồi hỗn hợp carotene – protein được chú trọng, góp phần tăng hiệu quả kinh tế, phát triển ngành thủy sản. Việc tận thu hỗn hợp caroten-protein chứa astaxanthin từ đầu tôm ngày càng được nghiên cứu nhiều hơn. Hoàng Thị Huệ An (2004) [1] nghiên cứu chiết xuất astaxanthin từ phế liệu vỏ tôm bằng dung môi. Trong khi đó năm 2009, Ngô Thanh Lĩnh cũng đã nghiên cứu sử dụng acid hữu cơ ở nồng độ thấp trong quy trình sản xuất chitin-chitosan để khử protein, khoáng nhưng đồng thời tận thu được dịch ủ, thu hồi caroten-protein. Phương pháp này thì tiết kiệm được chi phí nhưng tốn nhiều thời gian[7]. 5 Năm 2012, Phạm Thị Đan Phượng cũng sử dụng đơn lẻ một enzyme, kết hợp nhiều enzyme để thuỷ phân đầu tôm thẻ chân trắng thu hồi hỗn hợp caroten-protein (Alcalase 0,2% trong 2 giờ, Flavourzyme 0,1% trong 1giờ) cũng đã đạt được hiệu suất thu hồi đáng kể, thời gian ngắn (chỉ mất 3 giờ), chất lượng caroten-protein được nâng cao [11]. Bên cạnh đó còn có một số nghiên cứu sử dụng các loại vi khuẩn Bacillus subtilic [9] để tận thu caroten-protein. Phế liệu tôm (đầu tôm sạch, tươi) EDTA: 0,05% Xay - Tỷ lệ vi sinh vật/phế Ủ liệu: 5% - Thời gian: 3 ngày - Nhiệt độ phòng Lọc bằng vải lọc Bã Dịch (Caroten-protein) Sản xuất chitin Kết tủa Chitosan 1% Ly tâm Bột caroten-protein Hình 1.1. Quy trình thu hồi caroten-protein từ phế liệu đầu tôm bằng chế phẩm vi sinh vật (vi khuẩn Bacillus subtilic)[9] 6 1.3. Các nghiên cứu ngoài nước liên quan tới đề tài Trên thế giới, việc nghiên cứu sử dụng phế liệu từ tôm để sản xuất các sản phẩm giá trị gia đã thu hút được sựquan tâm của rất nhiều nhà nghiên cứu ở các nước có côngnghiệp chế biến thủy sản phát triển. Phần lớn các nghiên cứu được biết đến là để thu nhận chitin và chitosan từphế liệu tôm. Bên cạnh đó, việc thu nhận bột đạm giàu carotenoid cũng được quan tâm nghiên cứu, các sản phẩm protein thu được có thể ứng dụng trong chế biến thức ăn cho người hoặc gia súc ở dạng đạm giàu carotenoid hoặc chất mùi tôm. Các nghiên cứu này chủ yếu tập trung vào phế liệu của tôm sú hay các loại tôm đặc thù ở khu vực Châu Âu hay Bắc Mỹ; các nghiên cứu trên phế liệu tôm thẻ chân trắng thì còn rất hạn chế. Chen và Meyers (1982) [19] đã sử dụng acid trong quá trình lên men để thu nhận carotenoid. Armenta và Guerrero (2009) [17] đã cho thấy một hàm lượng amino acid cao của caroten-protein trong quá trình lên men, có thể được sử dụng trong chế độ ăn của con người và động vật do nồng độ acid amin thiết yếu cao. Carotenoid đặc biệt là astaxanthin từ phế liệu tôm cũng được quan tâm. Với những hiệu quả mang lại thì astaxanthin sử dụng rất phổ biến trong việc bổ sung làm thức ăn cho thủy sản để tăng màu sắc cho cá hồi và giáp xác, tăng hệ miễn dịch của vật nuôi. Bên cạnh đó thì các nghiên cứu cho thấy astaxanthin đóng vai trò quan trọng trong sinh sản và phát triển của cá hồi. Đặc biệt tính chất chống oxy hóa của carotenoid [19]. Sử dụng thức ăn có chứa carotenoid thường xuyên có khả năng bảo vệ tế bào và ngăn ngừa được nhiều loại bệnh trong đó có cả bệnh ung thư và bệnh tim mạch [20]. Carotenoid cũng có thể chống lại Hecolybacter pylori gây bệnh viêm loét dạ dày [19]. Vì vậy thu hồi hỗn hợp caroten-protein sao cho có hiệu quả là đều cần quan tâm. 7 1.4. Tìm hiểu về caroten – protein 1.4.1. Bản chất của caroten – protein * Caroten-protein Caroten-protein là một phức hợp liên kết hóa trị giữa protein và caroten. Caroten-protein trong tự nhiên đa dạng. Ở thực vật thường tồn tại với một lượng lớn của grana của lục lạp, ở động vật giáp xác: tôm, cua, ghẹ… Chúng tồn tại ở lớp ngoại bì, trong vỏ, các bộ phận cơ quan như trứng, dạ dày hay bạch huyết của chúng. Theo Zagalsky (1976) [28] phản ứng giữa các nhóm 4 và 4’ keto trong các vòng mang điện của β-astaxanthin là điều kiện tiên quyết cho phản ứng giữa nhóm carbonyl trong carotenoid với các gốc amin để hình thành caroten-protein. 1.4.2.Carotenoid Khi chất màu hóa học sử dụng trong thực phẩm ngày càng là mối nguy về sức khỏe cho người tiêu dùng thì chất màu mang nguồn gốc tự nhiên như caroten ngày càng được ứng dụng nhiều trong ngành công nghệ thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm. Sắc tố sử dụng rộng rãi nhất là caroten màu đỏ cam được tìm thấy chủ yếu trong tôm, cua, cá hồi, cá hồng là astaxanthin [17]. Astaxanthin có vai trò quan trọng để loại trừ hoặc ngăn chặn một số bệnh: chứng xơ vữa động mạch, ung thư, thoái hóa cơ thể và các bệnh về mắt. Caroten chiết tách từ các loài giáp xác xem như là một tiền tố vitamin A quan trọng và là nhóm chất chống oxy hóa [23] có hoạt tính sinh học mạnh, có hiệu quả đối với người và động vật có vú. Có khả năng nâng cao khả năng miễn dịch, ngăn ngừa triệu chứng lão hóa, bệnh thái hóa võng mạc bệnh Alzheimer, Parkinson, các bệnh có liên quan đến sự thừa cholesterol, một số căn bệnh ung thư. Trong phế liệu của các loại giáp xác thì carotenoid chủ yếu là astaxanthin (trên 95%) theo Amenta và Guerrore-Legarreta (2009) [17].Vì vậy trích ly carotenoid như trích ly astaxanthin. 8 Hình 1.2. Các liên kết hóa học của astaxanthin với các phân tử khác trong tôm [17] Astaxanthin cũng giống như các carotenoid khác tan trong lipid, có khối lượng phân tử là 596,8 Da và chủ yếu tập trung ở phần vỏ, thường tồn tại ở dạng tự do, dạng mono- hay ester với các acid béo không no mạch dài, hoặc dưới các phức hợp caroten-protein của đồng phân quang học. Hàm lượng astaxanthin trong tôm khác nhau tùy theo loài. Do cấu trúc có nhiều nối đôi nên astaxanthin là một chất chống oxy hóa hiệu quả, có khả năng bảo vệ màng tế bào và các mô khỏi bị tổn thương. Đặc tính chống oxy hóa thể hiện ở sự ngăn cản hình thành các gốc tự do bằng cách loại bỏ oxy tự do, trong trường hợp gốc tự do đã hình thành thì astaxanthin có thể liên kết với các gốc tự do đó để vô hoạt chúng, nhờ đó astaxanthin bảo vệ lipid khỏi oxy hóa. 9 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của một vài astaxanthin [17] 1.4.3. Bản chất của astaxanthin [20] 1.4.3.1. Tính chất vật lý Nhiệt độ nóng chảy 215 – 2160C, kết tinh từ piridin dạng vẩy tím, tan trong CS2, không tan trong nước. Khối lượng phân tử M = 596,82 Astaxanthin tự do trong không khí dễ bị oxy hoá thành astacene màu đỏ gạch * Sự hấp thụ ánh sáng và màu sắc của astaxanthin : 10 Astaxanthin hấp thụ rất mạnh bức xạ trong vùng 470 – 510 nm (cực đại hấp thụ thay đổi tùy theo dung môi sử dụng với hệ số tắt phân tử emax khoảng 105), tạo nên màu đỏ cam rất đẹp. Đặc tính hấp thụ ánh sáng của astaxanthin có thể bị thay đổi khi astaxanthin ở trạng thái liên kết với các phân tử khác. Chẳng hạn, trong tôm, cua…, astaxanthin thường liên kết với các phân tử protein tạo thành phức carotenprotein (tức crustacyanin ) có lmax = 628 nm, tạo nên màu xanh đặc trưng của các loài thủy sản khi còn sống. Dưới tác dụng nhiệt hoặc các tác nhân khác như acid, kiềm liên kết trên bị phá hủy và giải phóng trở lại astaxanthin tự do màu đỏ cam. * Tính tan : Astaxanthin là hợp chất ít phân cực nên kém tan trong nước, dễ tan trong các dung môi hữu cơ có độ phân cực thấp hay trung bình như piridin, diclorometan, cloroform, aceton, eter dầu mỏ. 1.4.3.2. Tính chất hóa học Do phân tử chứa chuỗi polyen với các nhóm keto, hydroxyl gắn với vòng đầu mạch, astaxanthin rất nhạy cảm với các tác nhân chất oxy hóa, acid và base. * Sự oxy hóa: Astaxanthin dạng tự do rất dễ bị oxy hóa bởi các tác nhân electrophyl như oxy phân tử, oxy nguyên tử hay các gốc tự do (như gốc hydroxyl, gốc peroxid…) nhưng khi tạo phức với protein hay ở dạng ester hóa thì bền hơn. Hoạt tính chống oxy hóa của astaxanthin (ký hiệu Ast) trong cơ thể được giải thích bởi khả năng bắt giữ các gốc tự do (ví dụ: gốc peroxid) tạo thành gốc cacbon trung tâm bền vững nhờ hiệu ứng cộng hưởng. * Phản ứng với acid : Astaxanthin phản ứng với các acid yếu theo một cân bằng thuận nghịch, tạo ra một phức hợp của các dạng cấu trúc (II) và (III) (Hình 1.3), gây ra sự dịch chuyển cực đại hấp thụ của nó về phía sóng dài; khi trung hòa bằng các base yếu (như dioxan) cấu trúc phân tử astaxanthin ban đầu lại được hồi phục. Tuy nhiên, khi phản ứng với các acid mạnh (như HCl, H2SO4 ) có thể xảy ra sự phân hủy chuỗi polyen của astaxanthin, làm nhạt màu đỏ cam. 11 Hình 1.4.Sự thay đổi cấu trúc phân tử astaxanthin khi tương tác với acid yếu [20] * Phản ứng với base:Trong môi trường kiềm, khi có mặt không khí, astaxanthin bị oxy hóa nhanhchóng thành astacene có màu đỏ thẫm : Hình 1.5. Astacene [20] * Phản ứng khử (hydrua hóa) : Khi xử lý bằng tác nhân khử NaBH4/ EtOH, các nhóm keto trong phân tử astaxanthin sẽ chuyển thành nhóm hydrroxyl, tạo thành crustaxanthin: làm chuyển dịch cực đại hấp thụ của astaxanthin khoảng 20 – 30 nm về phía sóng ngắn. Astaxanthin là sắc tố thuộc nhóm carotenoid có màu đỏ, tím, kết tinh, điểmnóng chảy 238-2400C. Astaxanthin dễ bị oxy hóa khi có mặt của oxy tạo thành astacene. Astaxanthin là loại carotenoid có tính acid, có thể tác dụng với rượu tạo ra muối không ổn định. Trong vỏ tôm nó tồn tại ở dạng phức hợp protein-astaxanthin. 12 Hình 1.6. Crustaxanthin [20] 1.4.4. Protein Protein là thành phần không thể thiếu được của tất cả các cơ thể sinh vật nhưng lại có đặc thù từng loài, từng cá thể của cùng một loài, từng cơ quan, của cùng một cá thể. Protein rất đa dạng về cấu trúc và chức năng, là nền tảng về cấu trúc và chức năng của cơ thể sống [3]. 1.4.5. Ứng dụng của caroten – protein Chế phẩm caroten-protein ngày càng được sử sụng nhiều trong nhiều lĩnh vực: y dược, mỹ phẩm, công nghệ thực phẩm, thức ăn cho thủy sản…. Bảng 1.4. Các ứng dụng chính của hỗn hợp protein và carotenoid [20] Lĩnh vực Công nghệ thực phẩm Nuôi trồng thủy sản Y dược Tính chất Chất mùi, chất màu, thực phẩm chức năng Tạo màu cho cá, tăng hệ miễn dịch, giảm stress cho vật nuôi Tăng hệ miễn dịch, chống lão hóa, ngăn chặn khả năng gây ung thư, tim mạch, bệnh về mắt… Mỹ phẩm Hạn chế và giảm nếp nhăn, chống lão hóa Với hàm lượng cao astaxanthin trong chế phẩm người ta sử dụng để làm thức ăn cho các đối tượng nuôi trồng thủy sản. - Trong kỹ thuật nuôi cá hồi: Chất lượng của cá hồi không chỉ được đánh giá qua hàm lượng protein, lipid, acid amin mà còn được đánh giá qua chất lượng màu 13 sắc của cơ thịt của chúng. Trong khi đó, cá hồi nuôi thì màu sắc của chúng không đáp ứng được các chỉ tiêu chất lượng và yêu cầu của khách hàng, vì vậy việc bổ sung astaxanthin trong thức ăn của cá là cần thiết để tăng màu sắc hồng của cơ thịt cá [13]. Theo S.ph. sozvatrev, 1982 cho thấy rằng bột đầu tôm có thể thay thế bột cá. Trong bột đầu tôm có hàm lượng đạm cao 60% và có khả năng làm tăng hàm lượng astaxanthin trong da và cơ cá hồi [10]. - Trong nuôi cá cảnh: Thức ăn có astaxanthin sẽ góp phần tạo màu sắc cho cá. Nếu cho cá ăn thích hợp thì cá sinh trưởng và phát triển tốt, màu sắc đẹp. - Trong phòng bệnh ở tôm: Theo Belinda K.Howell và Anthoy D. Matthew nghiên cứu thì nguyên nhân của bệnh đốm xanh ở tôm là do thiếu carotenoid trong khẩu phần ăn. Việc bổ sung carotenoid vào khẩu phần ăn là điều cần thiết [10]. 1.5. Tách chiết caroten-protein bằng phương pháp ủ xi lô Phương pháp ủ xi lô là một trong những phương pháp sinh học được sử dụng phổ biến hiện nay. Phương pháp này có ưu điểm là không gây ô nhiễm môi trường song đồng thời chất lượng của chitin và hỗn hợp chế phẩm caroten-protein vẫn có chất lượng cao. Trong khi đó, phương pháp bổ sung enzyme cũng là phương pháp sinh học thì khi sử dụng các loại enzyme thương mại thì giá thành cao, dẫn đến chi phí sản xuất tăng, vì vậy việc áp dụng vào sản xuất công nghiệp gặp nhiều khó khăn. Trong khi đó, phương pháp ủ xi lô tiết kiệm được chi phí nhờ sử dụng enzyme nội tại có sẵn trong đầu tôm. Vì vậy việc áp dụng phương pháp ủ xi lô vào sản xuất công nghiệp có tính khả thu cao. 1.5.1. Phương pháp ủ xi lô * Tổng quan Ủ xi lô hay còn được gọi là ủ chua là phương pháp đã được người dân sử dụng lâu đời để lên men cho gia súc và động vật nuôi. Quá trình ủ chua được lên men nhờ sự có mặt của các chủng vi khuẩn lactic có sẵn trong môi trường tự nhiên hoặc được cung cấp từ ngoài vào giúp cho sản phẩm ủ chua đạt chất lượng mong muốn. Đây là kết quả của quá trình lên men trong điều kiện yếm khí. 14 Phương pháp ủ chua thường được sử dụng trong nông nghiệp để ủ lên men cho nguyên liệu cây trồng, cỏ tươi để làm thức ăn cho động vật nuôi: trâu, bò, heo, gà…Người ta thường bổ sung muối, rỉ đường thích hợp cho quá trình lên men, đồng thời bổ sung thêm acid với nồng độ thích hợp để ức chế vi sinh vật gây thối, gây hư hỏng nguyên liệu. Quá trình ủ xi lô sẽ tạo thêm một số sản phẩm có giá trị như chất thơm, vitamin, kháng sinh ( Nizin, diplocacxin…) [12]. Ngoài việc áp dụng lên men nguyên liệu trên nông nghiệp, người ta còn ứng dụng đối với phế liệu cá, nội tạng bào ngư, phế liệu đầu vỏ tôm,… để sử dụng làm thức ăn cho động vật nuôi [12]. Việc áp dụng phương pháp ủ chua đối với phế liệu tôm được sử dụng khá phổ biến để bảo quản cũng như để chế biến dịch lên men và phối trộn thức ăn cho gia súc. Phế liệu tôm sau khi lên men làm thức ăn cho động vật ở dạng lỏng, đôi khi còn gọi là protein lỏng. Sự hóa lỏng của mô tôm là kết quả của việc thủy phân protein nhờ hoạt động của enzyme nội tại trong nguyên liệu, ngoài ra còn được hỗ trợ bằng cách bổ sung các acid hữu cơ do vi khuẩn lactic sinh ra, acid vô cơ thêm vào. Chất lượng của dịch ủ xi lô được đánh giá vào hàm lượng các acid amin thu được [5]. Phương pháp ủ xi lô đối với phế liệu tôm để thu hồi protein cũng như astaxanthin được sử dụng khá phổ biến hiện nay. Khi áp dụng phương pháo này sẽ tận thu phần lớn protein để làm thức ăn cho chăn nuôi từ phế liệu tôm, bên cạnh đó hàm lượng chất màu astaxanthin sẽ thu được trong dịch lên men, ủ chua bằng phương pháp sinh học sẽ ít ảnh hưởng đến thành phần astaxanthin này nên hàm lượng astaxanthin thu hồi được cao. Bên cạnh đó, quá trình ủ sẽ còn một lượng khoáng trong vỏ tôm cũng sẽ được tách ra một phần do kết hợp sử dụng hỗn hợp acid hữu cơ và vô cơ với nồng độ và tỷ lệ thích hợp trong quá trình ủ. Bã tôm sau khi được tách ra khỏi dịch ép sẽ được sử dụng cho việc sản xuất chitin. 15 * Ứng dụng của acid trong quá trình khử khoáng sản xuất chitin, chitosan Việc ứng dụng acid trong việc khử khoáng để sản xuất chitin, chitosan của phế liệu tôm đã được các nhà khoa học nghiên cứu rộng rãi, tiêu biểu là đề tài nghiên cứu của Pratya Charoenvuttitham ; John Shi ; Gauri S. Mittal [25] và các cộng sự, sử dụng acid hữu cơ để khử khoáng trong sản xuất chitin từ phế liệu tôm sú, với chế độ khử khoáng HCOOH 0,25M; acid citric 0,25M; nhiệt độ phòng, thời gian 30 phút, tỷ lệ 1/28 (v/w), hiệu suất khử khoáng là 88,1± 1,8%. Ngoài ra Nesreen Samir Mahmoud, Abdelkader Ghaly [24] sử dụng acid lactic và acid acetid ở các chế độ thời gian, nhiệt độ, nồng độ khác nhau cũng thu được kết quả khử khoáng đạt hiệu suất 82-95%. Thành phần canxicacbonat trong vỏ tôm sẽ tác dụng với acid lactic để tạo ra lactatcanxi ở dạng không hoà tan. Phản ứng này gần tương tự như quá trình khử khoáng bởi HCl trong phương pháp hoá học. Sơ đồ của phản ứng như sau: CaCO3 + 2CH3CHOHCOOH (CH3CHOHCOO)2Ca + H2O + CO2 Đồng thời trong quá trình này protein cũng bị hoá lỏng do hệ enzyme có sẵn trong nguyên liệu và do vi khuẩn lactic sinh ra [5]. Ưu điểm của việc sử dụng acid hữu cơ là ít ảnh hưởng đến tính chất, chất lượng chitosan, ít ảnh hưởng và tác động xấu đến môi trường. Đồng thời các sản phẩm trung gian của quá trình nếu thu hồi sử dụng không phải trung hòa và không ảnh hưởng đến sức khỏe con người hay vật nuôi. Qua đó, nhận thấy ưu điểm khi áp dụng phương pháp ủ xi lô kết hợp bổ sung acid hữu cơ cho phế liệu tôm là không những tách được đáng kể protein và khoáng trong vỏ tôm hạn chế lượng hóa chất sau này khi sản xuất chitin. Đồng thời còn có thể tận thu các thành phần giá trị trong dịch ủ để sản xuất thức ăn trong chăn nuôi, do nồng độ hóa chất sử dụng trong khi ủ là không cao. Như vậy, khi sử dụng phương pháp này để tách protein và khoáng trước khi sản xuất chitin thì có thể giảm bớt lượng hóa chất sử dụng cần thiết. Mặt khác, đối 16 với các sản phẩm cần thu hồi trong dịch ủ khi bổ sung acid hữu cơ sẽ làm tăng khả năng khử khoáng, protein và khả năng chiết astaxanthin nângcao chất lượng dịch ủ (Sachindra và cộng sự, 2006) [26]. Bên cạnh đó là việc lợi dụng enzyme protease trong phế liệu tôm để thủy phân protein, kết hợp với một lượng acid hữu cơ theo tỷ lệ thích hợp, ủ trong một thời gian nhất định, sẽ có bã tôm với hàm lượng khoáng, protein, sắc tố,.. tách ra đáng kể. Đồng thời thu hồi được dich ủ với hàm lượng protein và sắc tố cao. 1.5.2.Vai trò của emzyme có trong phế liệu tôm Các enzyme có trong đầu, vỏ tôm đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men. Cơ chế phân giải protein cũng giống như sử dụng xút để khử protein. Tuy nhiên, việc sử dụng enzyme đem đến nhiều mặt tích cực hơn như nâng cao chất lượng chitin, chitosan, hàm lượng protein – astaxanthin. Trong phế liệu tôm có chứa một số loại enzyme, theo tạp chí Khoa học và Công nghệ Thủy sản ( số 05/1993) thì hoạt độ enzyme của protease của đầu tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/g tươi. Trong đầu tôm có chứa enzyme tiêu hóa chymotrypsin và một vài loại enzyme khác có mặt trong phế liệu tôm như alkaline phosphatase,  -N-acetyl glucosaminse, chitinase cũng đượcứng dụng nhiều trong thực tế có tác dụng thủy phân hiệu quả. 1.6. Vai trò của acidtrong quá trình thủy phân protein Khi ủ phế liệu tôm, có thể sử dụng hỗn hợp acid hữu cơ và vô cơ như là acid formic, acid chlohydric, và/hoặc acid sunfuric, acid propyonic và hydrochloric và/hoặc acid sunfuric với các nồng độ khác nhau [4] nhằm mục đích hạ thấp pH ban đầu để khống chế quá trình gây thối do vi sinh vật gây thối, bảo quản nguyên liệu đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho chủng vi khuẩn lactic được bổ sung vào thực hiện quá trình lên men hiệu quả, đồng thời thúc đẩy enzyme nội tại hoạt động. Sự hiện diện của acid hữu cơ do chủng vi khuẩn lactic tạo ra và acid vô cơ hoặc hữu cơ bổ sung vào trong quá trình lên men lactic sẽ làm giảm pH của môi trường, ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây thối rữa, và do đó kéo dài thời gian 17 bảo quản cho nguyên liệu. Việc hạ pH môi trường bằng acid vô cơ hoặc acid hữu cơ và lên men bằng chủng vi khuẩn lactic trong quá trình ủ có những tác dụng sau: - Khi hạ pH bằng acid vô cơ ở giai đoạn đầu tiên trong quá trình lên men có tác dụng thủy phân đường thành những đường đơn nhằm cung cấp nguồn cacbon dồi dào cho sự phát triển của vi khuẩn lactic. Đồng thời ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây thối rữa, tạo môi trường thích hợp cho vi khuẩn lactic phát triển. - Tác dụng thủy phân protein trong phế liệu tôm do hoạt động của enzyme protease trong bản thân nguyên liệu, hạ pH thúc đẩy cho quá trình lên men lactic. - Ức chế hoạt động, sự phát triển của vi sinh vật gây thối, nấm mốc, bảo quản cho vỏ tôm không bị hư hỏng, đảm bảo chất lượng chitin sau này. - Với acid hữu cơ do vi khuẩn lactic tạo ra có tác dụng kháng khuẩn, decalxi hóa, tách khoáng ra khỏi vỏ tôm tạo điều kiện thuận lợi khi sản xuất chitin. - Mặt khác còn tạo thành dịch chứa protein, astaxanthin lỏng có giá trị về mặt dinh dưỡng khi thu hồi tận dụng làm thức ăn cho gia súc động vật nuôi, có tác dụng ngăn chặn sự oxy hóa astaxanthin, ổn định hàm lượng này để có thể tận thu dịch. 1.7. Acid vô cơ 1.7.1. Acid clohydric (HCl) Acid clohydric có công thức phân tử là HCl; có phân tử gam là 36,46 gam/mol; là một acid vô cơ mạnh, do sự hòa tan của khí hydro clorua (HCl) trong nước. Trong số sáu acid vô cơ mạnh phổ biến, acid clohydric là một acid monoproton ít có khả năng tạo phản ứng giảm số oxy hóa. Nó là một trong những acid mạnh ít độc hại nhất khi tiếp xúc bằng tay; ngoài tính acid, nó còn bao gồm các ion clo không phản ứng và không độc hại. Các dung dịch acid clohydric trung bìnhmạnh thì khá ổn định khi lưu trữ. 18 Acid clohydric thường được dùng phổ biến trong việc chuẩn độ dung dịch bazơ. Các acid chuẩn độ mạnh cho các kết quả chính xác hơn do có điểm cuối rõ ràng. Acid clohydric dạng hỗn hợp đẳng phí (gần 20,2%) có thể được dùng như một tiêu chuẩn cơ bản trong phân tích định lượng, mặc dù nồng độ chính xác của nó phụ thuộc vào áp suất khí quyển khi điều chế nó. 1.7.2. Acid sulfuric (H2SO4) Acid sulfuriccó công thức hóa học là H2SO4, là một chất lỏng sánh như dầu, không màu, không mùi, không bay hơi, nặng gần gấp 2 lần nước (H2SO4 98% có D = 1,84 g/cm3). Nó là một acid vô cơ mạnh. Nó hòa tan trong nước theo bất kỳ tỷ lệ nào.  Acid sunfuric là một đại lý proton mạnh mẽ.  Nó cũng là một tác nhân oxy hóa mạnh.  Acid sunfuric cũng là một chất khử nướcmạnh mẽ và được sử dụng để loại bỏ một phân tử nước từ nhiều hợp chất hữu cơ. 1.8. Acid hữu cơ 1.8.1. Acid lactic Acid lactic là hợp chất hữu cơ thu được bằng phương pháp lên men do tác nhân chủ yếu là vi sinh vật. Acid lactic (tên IUPAC: 2-hydroxypropanoic acid) hay acid sữa là một hợp chất hóa học đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh hóa. Acid lactic là một acid carboxylic với công thức hóa học C3H6O3, có một nhóm hydroxyl đứng gần nhóm carboxyl, làm cho nó có một alpha hydroxy acid (AHA). Trong dung dịch, nó có thể mất một proton từ nhóm acid tạo ra lactate CH3CH(OH)COO− có thể tan với nước hoặc ethanol. Trong công nghiệp, quá trình lên men acid lactic được thực hiện bởi vi khuẩn Lactobacillus. Trong y học, Lactate thường được sử dụng cho các chất lỏng hồi sức sau khi mất máu do chấn thương, phẫu thuật, hoặc một chấn thương đốt. 19 Tính chất: DL acid lactic là dịch lỏng dạng tinh thể, tan trong H2O, cồn, không tan trong CH3Cl, nhiệt độ nóng chảy 16,80C, nhiệt độ sôi 1220C. - Acid lactic có khối lượng phân tử là 98,08; là chất hữu cơ không màu, mùi nhẹ. - Acid lactic là một chất có độ hút ẩm cao, chất lỏng sánh đặc có sẵn trên thị trường ở những dạng khác nhau về chất lượng, và phụ thuộc vào độ tinh sạch có nhiều tiêu chuẩn khác nhau: acid lactic kỹ thuật, thực phẩm, dược phẩm và acid lactic plastic. - Chú ý là ở dạng đồng phần D-acid lactic hoặc L-acid lactic lần lượt có nhiệt độ nóng chảy là nhiệt độ sôi là 28 và 103 (0C). - Một tiêu chuẩn chất lượng quan trọng của acid lactic tinh sạch cao là sự bền nhiệt, ví dụ: không màu tạo thành khi làm nóng dung dịch 80% acid lactic đến 1800C. 1.8.2. Acid formic Acid formic (còn gọi là acid methanoic) là dạng acid carboxylic đơn giản nhất. Có công thức hóa học là HCOOH. Nó là một chất trung gian quan trọng trong tổng hợp hóa học và xảy ra tự nhiên, đáng chú ý nhất trong nọc độc của loài kiến. Acid formic là một chất lỏng không màu và rất hăng, thấm mùi ở nhiệt độ phòng. Nó là có thể trộn với nước và hầu hết các vùng cực hữu cơ dung môi, và có phần hơi hòa tan tronghydrocarbon. Trong hydrocarbon và trong giai đoạn bay hơi, nó bao gồm tạo liên kết hydro nhị trùng hơn là các phân tử cá nhân. Do xu hướng của nó để kết hydro, acid formic khí không tuân theo khí lý tưởng . 1.8.3.Acid propionic Acid propionic là một acid cacboxylic có nguồn gốc tự nhiên với công thức hóa họcCH3CH2COOH ( C3H6O2) Ở trạng thái tinh khiết và trong điều kiện thông thường, nó là một chất lỏng không màu có tính ăn mòn và mùi hăng. Giống như acid formic, dạng khí của nó vi phạm nghiêm trọng định luật khí lý tưởng do nó không chứa các phân tử acid propionic riêng rẽ mà lại có các cặp liên kết hydro giữa các phân tử. 20 Acid propionic ngăn cản sự phát triển của mốc và một số vi khuẩn. Do vậy, phần lớn acid propionic được sản xuất để sử dụng làm chất bảo quản cho cả thực phẩm dành cho con người cũng như thức ăn dành cho gia súc. 1.9.Các phương pháp tách chiết hỗn hợp caroten-protein trong quá trình sản xuất chitin 1.9.1.Phương pháp vật lí Đây là phương pháp làm giảm bớt hàm lượng protein trong phế liệu tôm trước khi đưa vào sản xuất chitin. Sơ đồ quy trình Nguyên liệu vỏ đầu Ép Bã ép Sản xuất chitin Dịch ép Sản xuất thức ăn gia súc Nguyên liệu được lấy ở dạng tươi từ nhà máy chế biến, trong quá trình vận chuyển bảo quản lạnh, sử dụng 2 loại máy ép là máy ép trục vít, và máy ép roto. Kết quả thu được như sau: Nhận thấy hàm lượng protein trong đầu tôm trước và sau khi ép có giảm, tuy hàm lượng protein còn lại là khá cao, nhưng cũng đã góp phần giảm bớt lượng protein trong phế liệu tôm trước khi đem sản xuất chitin, từ đó giảm được phần nào lượng hoá chất cần thiết sử dụng trong việc tách protein 21 Bảng 1.9. Hàm lượng protein của phế liệu tôm trước và sau khi ép [6] Nguyên Hàm lượng protein liệu trước khi ép (%) Hàm lượng protein Hàm lượng protein còn còn lại sau khi ép lại sau khi ép bằng máy bằng máy ép roto (%) ép trục vít (%) Đầu 25,8 21,8 18,3 Vỏ 23,9 18,7 17,5 1.9.2. Phương pháp hóa học Phương pháp hóa học là phương pháp được sử dụng phổ biến trong quy trình sản xuất chitin - chitosan hiện nay. Chitin không tồn tại độc lập mà nó thường liên kết với các thành phần khác như: Protein, khoáng, sắc tố… Vì vậy để thu được chitin cần phải loại bỏ các thành phần không phải là chitin trong phế liệu tôm. - Khử khoáng: Khoáng trong phế liệu tôm tồn tại ở dạng muối CaCO3, Ca3(PO4)2. Để khử khoáng trong đầu và vỏ tôm, ta thường sử dụng các acid mạnh như acid chlohydric, hay acid sunfuric,… cũng có thể dùng acid formic để biến đổi các muối không tan thành các muối có thể tan được và tách ra [2]. Phương trình phản ứng: CaCO3 + HCl  CaCl2 + H2O + CO2 CaCO3 + H2SO4 CaSO4 + H2O + CO2 CaCO3 + HCOOH  (HCOO)2Ca + H2O + CO2 Các nghiên cứu cho thấy rằng mức độ khử khoáng phụ thuộc vào nồng độ của acid được sử dụng. - Khử protein: Hóa chất được sử dụng để khử protein là NaOH, nồng độ NaOH sử dụng tùy thuộc vài loại nguyên liệu và tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch. Phương pháp này có 22 nhược điểm là thải ra môi trường một lượng NaOH rất lớn gây ô nhiễm môi trường, nồng độ NaOH thường dùng khoảng 6÷8% để khử protein. Phương trình phản ứng thủy phân protein trong môi trường kiềm. tcao H2N-CH-CO-NH-CH-CO H2N-CH-COOH + H2N-CH-CO-NH-CHNaOH R1 R2 polypeptid R1 acid amin R2 R3 peptid Phương pháp hóa học cho hiệu suất sản phẩm cao nhưng lại có nhược điểm thải ra môi trường một lượng lớn NaOH và ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm sản xuất chitin - chitosan sau này. Do đó, với hóa chất nồng độ cao, hay nồng độ thấp nhưng thời gian dài, hay nhiệt độ cao… đều sẽ ảnh hưởng chất lượng sản phẩm sau này. Vì vậy cần có hướng nghiên cứu kết hợp thêm với phương pháp sinh học trong việc tận thu sản phẩm trong dịch thải có chất lượng tốt hơn, giảm được lượng hóa chất sử dụng, nâng cao chất lượng cho sản phẩm chitin - chitosan, mà còn giải quyết được ô nhiễm môi trường trong quá trình sản xuất về sau. 1.9.3. Phương pháp sinh học Phương pháp này có thể sử dụng các loại enzyme khác nhau để thủy phân protein, từ đó protein sẽ được tách ra khỏi nguyên liệu. Điển hình là enzyme protease hay enzyme deacetylase để thay thế NaOH trong quy trình sản xuất chitin. Enzyme protease thường được sử dụng như là: Papain, Bromelin, và các enzyme động thực vật, vi sinh vật. Enzyme deacetylase thu được từ quá trình nuôi cấy vi sinh vật. Các vi sinh vật này thường tồn tại nhiều trên vỏ tôm, đặc biệt là vỏ tôm, vỏ ghẹ đang phân hủy. Người ta có thể tìm thấy tại đây có cả vi sinh vật sinh ra chitinase và chitosanase. Lợi ích của phương pháp sinh học này là sản xuất trong điều kiện nhiệt độ và áp suất tự nhiên, dung lượng thấp, bảo vệ được các sản phẩm phụ và những tác dụng đặc trưng [8]. 23 Tuy nhiên, do chi phí của phương pháp này cao, khá tốn kém, vì cần phải nghiên cứu để sản xuất ra enzyme để có thể sử dụng với một số lượng lớn trong sản xuất chitin. Nên hiện nay phương pháp sinh học vẫn chưa được áp dụng phổ biến và rộng rãi như là phương pháp hóa học trong sản xuất chitin – chitosan. 1.10. Phương pháp thu hồi caroten – protein 1.10.1. Phương pháp thu hồi caroten – protein bằng pH Điểm đẳng điện của protein (pI) là giá trị pH mà tại đó phân tử protein trung hòa về điện, ở giá trị pH = pI phân tử protein trung hòa điện, điện tích của protein bằng không, tương tác tĩnh điện giữa các phân tử protein và các phân tử nước bị giảm. Các phân tử protein tập hợp lại với nhau do lớp vỏ hydrat bên ngoài bị phá vỡ. Người ta lợi dụng tính chất này để kết tủa protein. Do không có sự thay đổi cấu trúc phân tử nên sau khi loại bỏ tác nhân gây kết tủa ra khỏi dung dịch thì các phân tử protein có thể hòa tan trở lại [14]. Cơ chế kết tủa bằng pH đẳng điện có thể mang tính thuận nghịch nên áp dụng để tách hợp chất protein có hoạt tính sinh học ra khỏi hỗn hợp mà vẫn đảm bảo giữ được hoạt tính và cấu trúc phân tử. 1.10.2. Phương pháp thu hồi caroten – protein bằng nhiệt độ Phương pháp thu hồi protein bằng xử lý nhiệt là phương pháp mà khi sử dụng nhiệt độ cao sẽ loại bỏ được lớp vỏ hydrat của protein, làm giảm khả năng hấp thụ của nước. Nhờ đó các phân tử protein kết tụ lại với nhau thành khối. Do mỗi loại protein khác nhau thì có độ biến tính khác nhau vì vậy độ biến tính của protein tỷ lệ thuận vào cường độ và thời gian khác nhau. Đa số protein biến tính ở nhiệt độ 45 – 500C. Protein khi được gia nhiệt ở điểm đẳng điện sẽ cho kết tủa nhanh hơn. Việc kết tủa protein bằng nhiệt có rất nhiều ưu điểm trong việc tách protein từ dung dịch mà khi chúng ta ít quan tâm đến hoạt tính hay cấu trúc của nó. Phương pháp kết tủa này xảy ra nhanh, triệt để, ít gây ô nhiễm môi trường. 1.10.3. Phương pháp thu hồi caroten – protein bằng chất trợ lắng (chitosan) Chitosan mang tính chất đặc trưng của điện tích dương nên có thể tương tác với phần lớn các chất hữu cơ mang điện tích âm. Nó thể hiện là một chất keo tụ, tạo bông tốt, có hiệu quả trong việc thu hồi các chất hữu cơ trong nước và đặc biệt là 24 protein. Phân tử chitosan cũng có khả năng hấp phụ, tạo cầu nối để liên kết các hạt keo protein đã kết tủa thành các phân tử có kích thước lớn hơn và lắng. Ngoài ra, chitosan còn có độ deacetyl cao thì trong dung dịch có chứa nhiều gốc amin tích điện dương sẽ trung hòa điện tích của các phân tử protein tích điện âm trong dung dịch nước rửa, giảm khả năng hydrat hóa, tập hợp lại và kết tụ [15]. Nồng độ chitosan cũng ảnh hưởng lớn đến hiệu quả thu hồi, cần sử dụng chitosan ở một nồng độ hợp lý vì khi tăng nồng độ chitosan làm tăng số điện tích cùng dấu và đẩy nhau tạo nên một mạng lưới keo cản trở quá trình keo tụ lắng xuống của các phân tử protein. Chitosan có độ deacetyl hóa càng cao thì các nhóm tích điện dương trên mạch chitosan càng nhiều, thuận lợi trong tương tác ion để thu hồi protein hòa tan. Ưu điểm của phương pháp này là không gây biến tính protein, không độc hại và hiệu quả thu nhận cao. Do đó phương pháp này áp dụng để tận thu các chế phẩm enzyme và các hợp chất có hoạt tính sinh học. 25 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu nguyên cứu 2.1.1. Nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng Đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) được lấy tại phân xưởng chế biến Công ty Cổ phần Nha Trang Seafoods (F17). Chất lượng đầu tôm tươi, không bị biến đổi màu sắc như đen đầu hay đỏ đầu, không bẩn nhiễm rác và tạp chất, được lưu giữ lạnh bằng thùng xốp cách nhiệt ([...]... đó, phương pháp ủ xi lô tiết kiệm được chi phí nhờ sử dụng enzyme nội tại có sẵn trong đầu tôm Vì vậy việc áp dụng phương pháp ủ xi lô vào sản xuất công nghiệp có tính khả thu cao 1.5.1 Phương pháp ủ xi lô * Tổng quan Ủ xi lô hay còn được gọi là ủ chua là phương pháp đã được người dân sử dụng lâu đời để lên men cho gia súc và động vật nuôi Quá trình ủ chua được lên men nhờ sự có mặt của các chủng vi... tách hợp chất protein có hoạt tính sinh học ra khỏi hỗn hợp mà vẫn đảm bảo giữ được hoạt tính và cấu trúc phân tử 1.10.2 Phương pháp thu hồi caroten – protein bằng nhiệt độ Phương pháp thu hồi protein bằng xử lý nhiệt là phương pháp mà khi sử dụng nhiệt độ cao sẽ loại bỏ được lớp vỏ hydrat của protein, làm giảm khả năng hấp thụ của nước Nhờ đó các phân tử protein kết tụ lại với nhau thành khối Do mỗi loại. .. phương pháp ủ xi lô Phương pháp ủ xi lô là một trong những phương pháp sinh học được sử dụng phổ biến hiện nay Phương pháp này có ưu điểm là không gây ô nhiễm môi trường song đồng thời chất lượng của chitin và hỗn hợp chế phẩm caroten- protein vẫn có chất lượng cao Trong khi đó, phương pháp bổ sung enzyme cũng là phương pháp sinh học thì khi sử dụng các loại enzyme thương mại thì giá thành cao, dẫn đến. .. màu, chất mùi, phục vụ cho các ngành công nghệ Trong thời gian gần đây việc nghiên cứu thu hồi hỗn hợp carotene – protein được chú trọng, góp phần tăng hiệu quả kinh tế, phát triển ngành thủy sản Việc tận thu hỗn hợp caroten- protein chứa astaxanthin từ đầu tôm ngày càng được nghiên cứu nhiều hơn Hoàng Thị Huệ An (2004) [1] nghiên cứu chiết xuất astaxanthin từ phế liệu vỏ tôm bằng dung môi Trong khi đó... triển Phần lớn các nghiên cứu được biết đến là để thu nhận chitin và chitosan từphế liệu tôm Bên cạnh đó, việc thu nhận bột đạm giàu carotenoid cũng được quan tâm nghiên cứu, các sản phẩm protein thu được có thể ứng dụng trong chế biến thức ăn cho người hoặc gia súc ở dạng đạm giàu carotenoid hoặc chất mùi tôm Các nghiên cứu này chủ yếu tập trung vào phế liệu của tôm sú hay các loại tôm đặc thù ở khu... định nồng độ acidHCl Xác định nồng độ acid lactic Xác định thời gian xử lý acid HCl Xác định thời gian xử lý acid lactic Phân riêng Phần bã Phần dịch thủy phân Sản xuất chitinchitosan Thu hồi hỗn hợp caroten- protein Đánh giá hiệu suất thu hồi, xác định hàm lượng astaxanthin Đề xuất quy trình ủ xi lô bằng acid HCl Đề xuất quy trình ủ xi lô bằng acid lactic Đánh giá chất lượng chế phẩm thu được từ hai quy... ủ xi lô bằng acid lactic Đánh giá chất lượng chế phẩm thu được từ hai quy trình Đề xuất nghiên cứu hoàn thiện quy trình thu hồi hỗn hợp caroten- protein bằng phương pháp ủ xi lô Hình2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát Thu hồi hỗn hợp caroten- protein và đánh giá hiệu suất thu hồi, hàm lượng astaxanthin của hỗn hợp ... 1% Ly tâm Bột caroten- protein Hình 1.1 Quy trình thu hồi caroten- protein từ phế liệu đầu tôm bằng chế phẩm vi sinh vật (vi khuẩn Bacillus subtilic)[9] 6 1.3 Các nghiên cứu ngoài nước liên quan tới đề tài Trên thế giới, việc nghiên cứu sử dụng phế liệu từ tôm để sản xuất các sản phẩm giá trị gia đã thu hút được sựquan tâm của rất nhiều nhà nghiên cứu ở các nước có côngnghiệp chế biến thủy sản phát triển... ra, acid vô cơ thêm vào Chất lượng của dịch ủ xi lô được đánh giá vào hàm lượng các acid amin thu được [5] Phương pháp ủ xi lô đối với phế liệu tôm để thu hồi protein cũng như astaxanthin được sử dụng khá phổ biến hiện nay Khi áp dụng phương pháo này sẽ tận thu phần lớn protein để làm thức ăn cho chăn nuôi từ phế liệu tôm, bên cạnh đó hàm lượng chất màu astaxanthin sẽ thu được trong dịch lên men, ủ chua... hiện nay phương pháp sinh học vẫn chưa được áp dụng phổ biến và rộng rãi như là phương pháp hóa học trong sản xuất chitin – chitosan 1.10 Phương pháp thu hồi caroten – protein 1.10.1 Phương pháp thu hồi caroten – protein bằng pH Điểm đẳng điện của protein (pI) là giá trị pH mà tại đó phân tử protein trung hòa về điện, ở giá trị pH = pI phân tử protein trung hòa điện, điện tích của protein bằng không, ... CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM o0o LÊ THÁI DUNG NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CÁC LOẠI ACID ĐẾN KHẢ NĂNG THU HỒI HỖN HỢP CAROTEN- PROTEIN TỪ ĐẦU TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP Ủ XI LÔ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành... ảnh hưởng đến trình thu nhận hỗn hợp carotenprotein 2 Đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng loại acid đến khả thu hồi hỗn hợp carotenprotein từ đầu tôm phương pháp ủ xilô” đề xuất nhằm góp phần nâng cao... trình thu hồi hỗn hợp caroten- protein tối ưu từ acid HCl acid lactic 44 3.4.1 Quy trình thu hồi hỗn hợp caroten- protein acid HCl 44 3.4.2 Quy trình thu hồi hỗn hợp caroten- protein