TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y  NGUYỄN TƯỜNG VI ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ VI KHUẨN DẠ CỎ TRÂU ĐẾN GAS VOLUME, TỶ LỆ TIÊU HÓA CỦA BÃ MÍA, RƠM VÀ THÂN LÁ CÂY BẮP TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH THÚ Y Cần Thơ, 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ VI KHUẨN DẠ CỎ TRÂU ĐẾN GAS VOLUME, TỶ LỆ TIÊU HÓA CỦA BÃ MÍA, RƠM VÀ THÂN LÁ CÂY BẮP TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO GVHD: Ths. PHẠM HOÀNG DŨNG Cần Thơ, 2013 Sinh viện thực hiện: NGUYỄN TƯỜNG VI MSSV: LT11678 LỚP: CN11167L1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y Đề tài: “ Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu đến gas volume, tỷ lệ tiêu hóa của bã mía, rơm và thân lá cây bắp trong điều kiện in vitro ” do sinh viên Nguyễn Tường Vi thực hiện tại phòng nghiên cứu chuyên khoa E103, Bộ môn Chăn nuôi, Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ. Thời gian thực hiện từ tháng 8 đến tháng 12 năm 2013. Cần Thơ, Ngày….tháng….năm 2013 2013 Cần Thơ, Ngày….tháng….năm Duyệt Bộ Môn (Ký và ghi họ tên) Duyệt Giáo Viên Hướng Dẫn (Ký và ghi họ tên) Ths.Phạm Hoàng Dũng Cần Thơ, Ngày….tháng….năm 2013 Duyệt Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học ứng Dụng i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài “ Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu đến gas volume, tỷ lệ tiêu hóa của bã mía, rơm và thân lá cây bắp trong điều kiện in vitro ” là công trình nghiên cứu của bản thân. Tất cả các số liệu, kết quả được trình bày trong luận văn tốt nghiệp này là trung thực và chưa từng được ai công bố ở bất kỳ công trình nghiên cứu nào trước đây. SINH VIÊN THỰC HIỆN (Ký và ghi họ tên) Nguyễn Tường Vi ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn quí thầy cô trong Bộ môn Thú Y, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ cùng tất cả quí thầy cô của Trường Đại học Cần Thơ đã truyền đạt tận tình những kiến thức cơ sở cũng như chuyên môn giúp tôi có được những thuận lợi nhất định trong học tập và trong quá trình làm luận văn tốt nghiệp. Xin ghi nhớ công ơn và chân thành cảm ơn những kiến thức, kinh nghiệm và công sức vô cùng quí báu của thầy Hồ Quảng Đồ đã tận tình hướng dẫn, định hướng và đào tạo để tôi hoàn thành thật tốt đề tài luận văn của mình. Xin chân thành cảm ơn thầy Phạm Hoàng Dũng đã truyền đạt kinh nghiệm và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt chương trình học và làm luận văn. Cảm ơn anh Võ Phương Ghil đã tận tình chỉ dẫn tôi, đã theo sát hướng dẫn và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình làm luận văn. Cảm ơn những người bạn đã tham gia học tập và nghiên cứu cùng tôi. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả!. TÁC GIẢ LUẬN VĂN (Ký và ghi họ tên) Nguyễn Tường Vi iii MỤC LỤC Trang Trang bìa .................................................................................................................. Trang duyệt ..............................................................................................................i Lời cam đoan .......................................................................................................... ii Lời cảm ơn ............................................................................................................. iii Mục lục ...................................................................................................................iv Danh mục viết tắt ................................................................................................... vii Danh mục bảng ..................................................................................................... viii Danh mục hình ........................................................................................................ix Tóm lược ................................................................................................................. x CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU ..................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề.................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu....................................................................................................... 1 CHƯƠNG 2. CƠ SỞ LÝ LUẬN ............................................................................ 2 2.1 Vi khuẩn phân giải cellulose trong dạ cỏ trâu bò ........................................ 2 2.2 Ảnh hưởng của các loại vi khuẩn dạ cỏ lên quá trình sinh khí ................... 2 2.3 Sơ lược về phương pháp tìm ra vi khuẩn phân giải xơ phân lập từ dạ cỏ trâu .......................................................................................................................... 3 2.4 Phương pháp sinh khí in vitro ..................................................................... 6 2.5 Hệ sinh thái dạ cỏ ........................................................................................ 9 2.5.1 Môi trường sinh thái dạ cỏ ............................................................... 9 2.5.2 Hệ vi sinh vật dạ cỏ .......................................................................... 9 2.6 Vi sinh vật phân giải cellulose trong điều kiện yếm khí ............................ 11 2.7 Vai trò của pH trong dạ cỏ ......................................................................... 12 2.8 Vai trò của NH3 trong quá trình lên men dịch dạ cỏ .................................. 12 2.9 Thực liệu thí nghiệm .................................................................................. 13 iv 2.9.1 Thân lá cây bắp ............................................................................... 13 2.9.2 Rơm rạ............................................................................................. 13 2.9.3 Bã mía ............................................................................................. 14 2.10 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước ................................... 14 2.10.1 Tình hình nghiên cứu trong nước ................................................. 14 2.10.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................... 16 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 18 3.1 Phương tiện nghiên cứu ............................................................................. 18 3.1.1 Địa điểm, thời gian.......................................................................... 18 3.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất .............................................................. 18 3.2 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 19 3.2.1 Bố trí thí nghiệm ............................................................................. 19 3.2.2 Tiến hành thí nghiệm ...................................................................... 21 3.3 Phương pháp xử lý thống kê ...................................................................... 23 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................... 24 4.1 Thành phần hóa học của thức ăn thí nghiệm (%)....................................... 24 4.2 Các thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu đến gas volume, tỷ lệ tiêu hóa của bã mía, rơm khô, thân lá cây bắp trong điều kiện in vitro ........................................................................................................................ 25 4.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu đến gas volume và tỷ lệ tiêu hóa của bã mía trong điều kiện in vitro ......................... 25 4.2.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu đến quá trình sinh khí của bã mía………… ................................................................................ 25 4.2.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu đến tỷ lệ tiêu hóa DM, NDF, ADF, ADL của bã mía trong điều kiện in vitro............................ 26 4.2.1.3 Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu đến hàm lượng NH3 (mg/l), pH của bã mía trong điều kiện in vitro .................................... 27 v 4.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu đến gas volume và tỷ lệ tiêu hóa của rơm trong điều kiện in vitro .............................. 28 4.2.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu đến quá trình sinh khí của rơm…………… ................................................................................ 28 4.2.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu đến tỷ lệ tiêu hóa DM, NDF, ADF, ADL của rơm trong điều kiện in vitro ................................ 29 4.2.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu đến hàm lượng NH3 (mg/l), pH của rơm trong điều kiện in vitro ........................................ 30 4.2.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu đến gas volume và tỷ lệ tiêu hóa của thân lá cây bắp trong điều kiện in vitro ............. 31 4.2.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu đến quá trình sinh khí của thân lá cây bắp ................................................................................... 31 4.2.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu đến tỷ lệ tiêu hóa DM, NDF, ADF, ADL của thân lá cây bắp trong điều kiện in vitro .............. 32 4.2.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu đến hàm lượng NH3 (mg/l), pH của thân lá cây bắp trong điều kiện in vitro ...................... 33 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................... 34 5.1.Kết luận ............................................................................................................ 34 5.2 Đề nghị ............................................................................................................. 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 36 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH .......................................................................................... 41 PHỤ CHƯƠNG ..................................................................................................... 44 vi DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT Các ký hiệu, chữ viết tắt Ý nghĩa ADF Xơ axit (Acid detergent fiber) Ash Khoáng tổng số (Total ash) CP Đạm thô (Crude protein) DM Vật chất khô (Dry matter) DMD Tỉ lệ tiêu hóa vật chất khô ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long g Gram NDF Xơ trung tính (Neutral detergent fiber) OM Vật chất hữu cơ (Organic matter) P Xác xuất (Probabbility) SEM Sai số chuẩn trung bình (Standard error mean) TL.Khí sinh ra Tổng lượng khí sinh ra TLTH Tỉ lệ tiêu hóa ĐC Nghiệm thức đối chứng không chủng dịch vi khuẩn dạ cỏ trâu NT1 Nghiệm thức chủng 0,5% dịch vi khuẩn dạ cỏ trâu NT2 Nghiệm thức chủng 1% dịch vi khuẩn dạ cỏ trâu NT3 Nghiệm thức chủng 2% dịch vi khuẩn dạ cỏ trâu vii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1 Tóm tắt các giai đoạn nhuộm Gram vi khuẩn ......................................... 5 Bảng 3.1 Lượng cân các hóa chất có trong 1 lít dung dịch đệm ........................... 22 Bảng 4.1 Thành phần hóa học của thức ăn thí nghiệm (%) ................................... 24 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu lên quá trình sinh khí sinh ra tại thời điểm 6 giờ 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ (ml/gDM) của bã mía ................. 25 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu đến tỷ lệ tiêu hóa DM, NDF, ADF, ADL của bã mía trong điều kiện in vitro ........................................... 26 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu đến hàm lượng NH3, pH của bã mía trong điều kiện in vitro ........................................................................ 27 Bảng 4.5 Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu lên quá trình sinh khí sinh ra tại thời điểm 6 giờ 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ (ml/gDM) của rơm ..................... 28 Bảng 4.6 Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu đến tỷ lệ tiêu hóa DM, NDF, ADF, ADL của rơm trong điều kiện in vitro ............................................... 29 Bảng 4.7 Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu đến hàm lượng NH3, pH của rơm trong điều kiện in vitro ............................................................................ 30 Bảng 4.8 Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu lên quá trình sinh khí sinh ra tại thời điểm 6 giờ 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ (ml/gDM) của thân lá cây bắp ... 31 Bảng 4.9 Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu đến tỷ lệ tiêu hóa DM, NDF, ADF, ADL của thân lá cây bắp trong điều kiện in vitro ............................. 32 Bảng 4.10 Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu đến hàm lượng NH3, pH của thân lá cây bắp trong điều kiện in vitro ..................................................... 33 viii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 2.2 Thân lá cây bắp .............................................................................................17 Hình 2.3 Bã mía ...........................................................................................................17 Hình 2.4 Rơm khô........................................................................................................17 Hình 4.1 Biểu đồ tổng lượng khí sinh ra tại thời điểm 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ (ml/g) ...........................................................................................................................28 ix TÓM LƯỢC Đề tài nghiên cứu “ Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu đến gas volume, tỷ lệ tiêu hóa của bã mía, rơm và thân cây bắp trong điều kiện in vitro ” được thực hiện tại phòng Chăn nuôi Chuyên khoa E103 - Bộ môn Chăn nuôi, Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ. Đề tài thực hiện dựa vào kết quả của thí nghiệm “ảnh hưởng của các nhóm vi khuẩn dạ cỏ lên gas volume để tuyển chọn ra nhóm vi khuẩn cho phân giải thức ăn tốt nhất” tiếp tục cho thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ lên gas volum. *Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu lên quá trình sinh khí (gas volume), pH, NH3 và tỷ lệ tiêu hóa của bã mía trong điều kiện in vitro. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 4 nghiệm thức (NT) và 5 lần lặp lại. Trong đó NT2 đến NT4 lần lượt bổ sung vi khuẩn dạ cỏ trâu (có mật số 107 CFU/ml) với 3 mức độ lần lượt là 0,5%, 1%, 2%. Các chỉ tiêu theo dõi : + Hàm lượng gas volume 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ và 24 giờ. + pH. + NH3. + Tỷ lệ tiêu hóa của bã mía trong điều kiện in vitro. Kết quả đạt được: Ở nồng độ vi khuẩn 1% đã cho thấy hàm lượng gas volume sinh ra thấp nhất và tỷ lệ tiêu hóa cao nhất. *Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu lên quá trình sinh khí (gas volume), pH, NH3, tỷ lệ tiêu hóa của rơm trong điều kiện in vitro. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 4 nghiệm thức và 5 lần lặp lại. Trong đó NT2 đến NT4 lần lượt bổ sung vi khuẩn dạ cỏ trâu (có mật số 107 CFU/ml) với 3 mức độ lần lượt là 0,5%, 1%, 2%. x Các chỉ tiêu theo dõi : + Hàm lượng gas volume 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ và 24 giờ. + pH. + NH3. + Tỷ lệ tiêu hóa của bã mía trong điều kiện in vitro. Kết quả đạt được: Ở nồng độ vi khuẩn 1% đã cho thấy hàm lượng gas volume sinh ra thấp nhất và tỷ lệ tiêu hóa cao nhất. *Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu lên quá trình sinh khí (gas volume), pH, NH3, tỷ lệ tiêu hóa của thân lá cây bắp trong điều kiện in vitro. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 4 nghiệm thức và 5 lần lặp lại. Trong đó NT2 đến NT4 lần lượt bổ sung vi khuẩn dạ cỏ trâu (có mật số 107 CFU/ml) với 3 mức độ lần lượt là 0,5%, 1%, 2%. Các chỉ tiêu theo dõi : + Hàm lượng gas volume 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ và 24 giờ. + pH + NH3. + Tỷ lệ tiêu hóa của bã mía trong điều kiện in vitro. Kết quả đạt được: Ở nồng độ vi khuẩn 1% đã cho thấy hàm lượng gas volume sinh ra thấp nhất và tỷ lệ tiêu hóa cao nhất. xi CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Ngành chăn nuôi đăc biệt là chăn nuôi trâu, bò khá phát triển ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) do đặc trưng của vùng địa hình này thích hợp. Đặc biệt, giá thành thịt bò cao và được tiêu thụ mạnh do nhu cầu của thị trường ngày càng tăng. Tuy nhiên, nước ta nói chung và vùng ĐBSCL nói riêng cũng gặp không ít khó khăn trong chăn nuôi bò do khan hiếm về số lượng và hạn chế về chất lượng của thức ăn. Bên cạnh đó thì nguồn phụ phế phẩm ở ĐBSCL rất phong phú và đa dạng như rơm rạ, bã mía, thân cây bắp... vẫn chưa được khai thác và sử dụng triệt để. Phần lớn các phế phẩm này vứt bỏ ngoài đồng ruộng, ủ làm phân bón và sử dụng làm chất đốt gây ô nhiễm môi trường (Đỗ Thị Cẩm Hường, 2012). Mặt khác các phế phẩm này chứa hàm lượng cellulose cao nên tỷ lệ tiêu hóa thấp (Đỗ Thị Cẩm Hường, 2012). Nhiều nghiên cứu cho thấy cellulase là một hệ enzyme phức tạp, được tổng hợp bởi nhiều vi sinh vật, phổ biến là nấm và vi khuẩn (Imamanuel et al ., 2006). Tuy nhiên, việc nghiên cứu khả năng sinh cellulase của các dòng vi khuẩn vẫn còn khiêm tốn so với nấm (Ekpergin, 2006). Mặt khác, sự phân giải chất xơ không được thực hiện ở hệ tiêu hóa của động vật mà do hoạt động của chủ yếu của vi khuẩn sống trong cơ quan tiêu hóa của chúng thực hiện. Trong hệ thống tiêu hoá của trâu có hệ vi sinh vật dạ cỏ phong phú, nên có thể tiêu hoá chất khô, đặc biệt là chất xơ, cao hơn các gia súc khác. Trâu có thể tận dụng được nhiều loại cỏ, lá cây, một số loại cỏ nước và phế phụ phẩm của trồng trọt mà các gia súc khác (kể cả bò) không sử dụng được. Vì vậy, bổ sung vào thức ăn của vật nuôi một lượng vi khuẩn dạ cỏ trâu thích hợp có khả năng thủy phân xơ nhằm năng cao tỷ lệ tiêu hóa chất xơ, giảm chi phí do tận dụng được nguồn phụ phẩm sẵng có là một vấn đề cần quan tâm và cũng góp phần làm giảm ô nhiễm môi trường. Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu đến gas volume, tỷ lệ tiêu hóa của bã mía, rơm và thân lá cây bắp trong điều kiện in vitro”. 1.2 MỤC TIÊU Tìm ra nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu thích hợp để tăng khả năng sử dụng một số phụ phẩm nông nghiệp cơ bản nhằm để chăn nuôi bò thịt trong điều kiện in vitro. 1 CHƯƠNG 2. CƠ SỞ LÝ LUẬN 2.1 VI KHUẨN PHÂN GIẢI CELLULOSE TRONG DẠ CỎ TRÂU, BÒ Thông qua hoạt động của hệ vi sinh vật dạ cỏ, cellulose sẽ được sử dụng như nguồn cung cấp dinh dư ng chủ yếu cho loài nhai lại như: trâu, bò, dê cừu… Hệ vi sinh vật dạ cỏ của thú nhai lại rất phong phú, bao gồm: vi khuẩn, nấm và protozoa (Denis và cs., 2003). Cả 3 loài vi sinh vật trên đều có khả năng sản xuất các enzyme phân giải cellulose. Tuy nhiên, vi khuẩn đóng vai trò chính, trong đó ba giống vi khuẩn có khả năng tiết các enzyme phân giải cellulose nhiều nhất: Fibriobacter succinogenes; Ruminococcus albus; Ruminococcus flavefaciens (Satoshi Koike và Yasuo Kobayashi, 2001). Theo Paul . eimer (1996), có rất nhiều enzyme phân giải cellulose như: endoglucanase, exoglucanase, β- glucosidase, xylanase, cellodextrinase. Tuy nhiên, 3 enzyme có chức năng chính trong phân giải cellulose là: endoglucanase, exoglucanase, β glucosidase (ww.hua.edu.vn) 2.2 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LOẠI VI KHUẨN DẠ CỎ LÊN QUÁ TRÌNH SINH KHÍ Protozoa có số lượng khoảng 1 triệu con/1g thức ăn dạ cỏ, có khả năng sinh sản rất nhanh (4-5 thế hệ / ngày), là anh lính tiên phong khi tấn công phá vở màng celluloz (màng xơ khó tiêu hóa nhất của tế bào thực vật). Từ đó, phóng thích các thành phần dinh dư ng bên trong như tinh bột, đường, các protid… chúng sử dụng một phần cho sự phát triển bản thân chúng, mặt khác giúp vi khuẩn phát triển. Vi khuẩn tiếp tục phân giải cellulose. Protozoa chuyển phần cellulose đã phá vở thành những dư ng chất cho chúng và một phần chuyển thành Acid bay hơi như Acid Acetic, Acid propionic , acid butyric. Nhóm vi khuẩn cộng sinh ở dạ có có số lượng rất lớn, trong 1 gam thức ăn dạ cỏ chứa tới 109 tế bào; trong đó, nhóm vi khuẩn có men cellulaza để phân giải chất xơ, Treptococcus, Vi khuẩn lactic… quan trọng nhất là nhóm vi khuẩn lên men cellulose. Chúng có khả năng chuyển celluose, hemicellulose thành các sản phẩm đường mạch ngắn như disaccaric, polysaccaric và sau đó tiếp tục biến thành các Acid béo bay hơi, Acid lactic, nhóm vi khuẩn lactic, Streptococcus cũng góp phần chuyễn hóa chất bột đường. Quá trình phân giải chất xơ của dạ cỏ sẽ tạo thành sản phẩm là các Acid béo bay hơi (Acid acetic/60 – 70%, Acid propionic/15-20 %, 2 Acid butyric /10-15 %), các thể khí như CO2, CH4, H2, O2 , N2… Các acid béo bay hơi chính là nguồn cung năng lượng cho các hoạt động của cơ thể trâu bò, là chất béo của sữa bò. Các thể hơi sinh ra tích tụ ở 1/3 trên của dạ cỏ được thải ra ngoài bằng cách ợ hơi. Sự có mặt của hệ thống vi sinh vật còn giúp trâu bò sử dụng được nguồn Nitơ phi protein như carbamic, muối amon tạo thành Protid của chính bản thân vi sinh vật, xác vi sinh vật lại là nguồn cung chất đạm cho trâu bò ở phần sau đường tiêu hóa.Các hoạt động trên chỉ có thể diễn ra thuận lợi khi dạ cỏ có độ pH thích hợp từ 6,4 – 7. Nếu pH giảm (do thiếu lượng Bicarbonate natri trong nước bọt, do khẩu phần có nhiều thức ăn tinh, hệ thống vi khuẩn lactic hoạt động mạnh làm pH dạ cỏ chuyễn sang acid) sẽ ức chế sự phân giải chất xơ, giảm khả năng tiêu hóa. Thậm chí các acid ở da cỏ thâm nhiễm vào máu gây tình trạng nhiễm acid máu, gây rối loạn chức năng trao đổi O2, CO2 của hồng cầu. Có độ ẩm cao 70 -80%, nên phải cho uống đầy đủ nước sạch, có nhiệt độ từ 38 – 410C (Khuyennongtphcm.com). 2.3 SƠ LƯỢC VỀ PHƯƠNG PHÁP TÌM RA VI KHUẨN PHÂN GIẢI XƠ PHÂN LẬP TỪ DẠ CỎ TRÂU Mục đích: Tuyển chọn những dòng vi khuẩn dạ cỏ trâu có khả năng phân hủy mạnh cơ chất phụ phẩm nông nghiệp. Nguyên tắc: Phương pháp phân lập giống thuần đều dựa trên các bước: chuaarn bị mẫu, cấy trải mẫu lên môi trường M1, quan sát và cấy chuyển những khuẩn lạc khác nhau về hình dạng, màu sắc đặc trưng, tiếp tục cấy rìa để tách ròng vi khuẩn. Tiến hành thí nghiệm: Thu mẫu dịch dạ cỏ: Dùng ống inox có đầu nhọn vô trùng để thu dịch dạ cỏ, mẫu dịch được trữ lạnh khoảng 40C trong quá trình vận chuyển về phòng thí nghiệm. Đồng nhất mẫu: cho 50ml dịch dạ cỏ vào bình tam giác có chứa 90ml nước cất vô trùng, lắc trộn mẫu 150 vòng/phút; sau đó để lắng khoảng 10 phút. Dịch huyền phù chứa vi khuẩn dùng để phân lập. Cấy trải vi sinh vật Dùng micro pipette hút 15µl dịch vi khuẩn ở mỗi nồng độ pha loãng 10 , 10-4, 10-3, 10-2 chuyển vào đĩa petri có chứa môi trường M1, sau đó dùng que trải dàn đều giọt vi khuẩn trên khắp mặt thạch đĩa để mẫu khô tự nhiên. Tiến hành ủ mẫu vi khuẩn trong bình thủy tinh kỵ khí (dùng đèn cầy đốt hết khí ở trong bình ) ở nhiệt độ 380C trong 48 giờ. (Nguyễn Thị Bảo Yến, 2012 ) -5 3 Mỗi khuẩn lạc rời tiếp tục cấy chuyển trên môi trường M1 cho đến khi ròng ( khuẩn lạc đồng nhất trong đĩa cấy ). Sau đó mỗi chủng được kiểm tra độ ròng trên kính hiển vi, quan sát mô tả đặc điểm khuẩn lạc, hình dạng tế bào,... Nguyễn Thị Bảo Yến, 2012 ) Quan sát mô tả khuẩn lạc: Nuôi cấy mỗi vi khuẩn trên đĩa petri riêng ở điều kiện 380C, trong 48 giờ. Quan sát và mô tả khuẩn lạc bằng kính lúp ở độ phóng đại 5X dựa vào một số đặc điểm sau. + Hình dạng: dang tròn có kích thước nhỏ ( punctiform ) và lớn ( circular ); dạng không đều ( irregular ), dạng thoi ( spindle ), rễ cây dạng sợi ( filamentous ) và rễ ( rhizoid ). + Độ nổi: dạng phẳng ( flat ) thường thấp và ngang với mặt môi trường; dạng lài ( raised ) có chiều cao khuẩn lạc khá hơn dạng phẳng nhưng có hai dốc ( phía vành khuẩn lạc lài xuống ); dạng mô (convef ) thường nổi mô cao lên trên môi trường đặc; dạng nổi cầu chồng do nhiều khuẩn lạc có độ nổi phát triển chồng lên nhau và có dạng như nổi gò ( pulvinat ); nổi bướu ( umponate ) nổi hố (umbilicate ). + Dạng bìa: có 5 dạng bìa phổ biến như sau: bìa nguyên ( entire ); bìa gợn sóng ( curled ); bìa chia thì ( lobate ); bìa răng cưa ( erose ); bìa sợi ( filamentous ). + Màu sắc: khuẩn lạc thường có màu trắng trong, trắng đục, xám, đỏ, vàng... (Nguyễn Thị Bảo Yến, 2012 ) Mô tả vi khuẩn Mục đích: đánh giá sơ bộ về nhuãng đặc điểm hình thái của vi khuẩn Nguyên tắc: Vi khuẩn có cấu tạo đơn bào, đa số chúng có đường kính từ 0,2-2µm. Hình dạng vi khuẩn có thể là hình cầu, hình que, hình xoắn hay hình dấu phẩy; các tế bào có thể tồn tại đơn lẻ, hay có thể kết đôi, kết chuỗi và kết chùm. Chúng sinh sản chủ yếu băng hình thức phân đôi tế bào, một số loài có khả năng di động nhờ chúng có tiên mao hay tiêm mao. Khi quan sát vi khuẩn, nói chung khi quan sát các đặc điểm có tính đặc trưng như hình dạng, kiểu liên kết giữa các tế bào, khả năng di động, sự hình thành bào tử và nhuộm gram ( Nguyễn Đức Lượng et al.,2004) + Hình dạng: trạng thái vi khuẩn được quan sát bằng phương pháp giọt ép ở vật kính 100x. 4 + Khả năng di động vi khuẩn: vi khuẩn được chuyển vào môi trường thạch bán lỏng ( 0,3 – 0,6% thạch ); đặc ống nghiệm thẳng đứng, ủ ở nhiệt độ 380C và quan sát sau 3 ngày. + Thử nghiệm catalase: phát hiện enzyme catalase trong vi khuẩn bằng cách chi dung dịch H2O2 vào có hiện tượng sủi bọt khí. + Kích thước: nhuộm màu vi khuẩn ( nhuộm đơn ) rồi quan sát kích thước vi khuẩn dưới trắc vi thị kính với độ phóng đại 100 lần (Nguyễn Thị Bảo Yến, 2012 ) Nhuộm gram vi khuẩn Gram vi khuẩn được khảo sát dựa theo phương pháp nhuộm Gram của nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853-1938). Ông phát triển kỷ thuật này vào năm 1984 để phân biệt các Pneumococcus và Klebsiella Pneumoniae. Mục đích: xác định loại Gram của vi khuẩn Nguyên tắc: dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iot mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau. Bảng 2.1 Tóm tắt các giai đoạn nhuộm Gram vi khuẩn Giai đoạn Gram dương Gram âm Crystal violet Tế bào nhuộm tím xanh Tế bào nhuộm tím xanh Dung dịch iot Iot dán cristal violet bám chặt vào vách tế bào Cristal violet vẫn không bám chặt vào vách tế bào Rửa bằng cồn axeton Không tẩy cristal violet Tẩy cristal violet ra khỏi vách tế bào Safranin hay Fuchsin Vách tế bào còn cristal violet nên có màu tím xanh Vách tế bào không có cristal violet nên có màu hồng của Fuchsin (Cao Ngọc Điệp và Nguyền Hữu Hiệp, 2009). Các bước nhuộm Gram vi khuẩn Chuẩn bị mẫu vật Nuôi cấy mỗi vi khuẩn trên từng đĩa petri riêng ở điều kiện 380C trong 24 giờ Nhỏ 1 giọt nước cất đã khử trùng lên giữa lame. Hơ đầu kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội. Dùng kim cấy lấy 1 ít khuẩn lạc cho vào giọt nước, trải ra cho đều và thật mỏng theo hình xoắn ốc. 5 Hơ miếng mặt dưới của lame có chứa vi khuẩn trên ngọn lửa đèn cồn cách khoảng 10cm khoảng 3 lần để cố định vi khuẩn lên miếng lame (Nguyễn Thị Bảo Yến, 2012) 2.4 PHƯƠNG PHÁP SINH KHÍ IN VITRO Đây là một dạng phát triển của kỹ thuật đánh giá sự tiêu hóa thức ăn in vitro là sự thay đổi cách đo đạc trong kỹ thuật, từ sự xác định thức ăn không bị tiêu hóa còn lại sang việc đo lượng khí sinh ra trong quá trình tiêu hóa thức ăn in vitro gọi là kỹ thuật sinh khí in vitro (in vitro gas production) được chuẩn hóa và đề xuất ở Đức (Menke et al, 1979). Phương pháp sinh khí in vitro ra đời dựa trên nền tảng của in vitro Tilley và Terry (1963), sự tiêu hóa vi sinh vật dạ cỏ có thể quan sát được trong điều kiện ống nghiệm dưới sự tham gia của vi sinh vật đa dạng có trong môi trường nước bọt nhân tạo của McDougall (1948). Kết quả của sự lên men này có thể quan sát từ thức ăn còn lại sau khi tiêu hóa ở in vitro Tilley và Terry (1963) hoặc từ sản phẩm sinh ra của sự tiêu hóa ở phương pháp sinh khí in vitro của Menke et al, (1979). Nguyên lý hoạt động của sinh khí in vitro cũng như phương pháp in vitro Tilly và Terry (1963). Thức ăn được ủ trong môi trường dịch dạ cỏ có chất đệm yếm khí ở 390C, sẽ được tiêu hóa bởi các vi sinh vật dạ cỏ. sau khi bắt đầu ủ, thức ăn được tiêu hóa sinh ra các acid béo bay hơi và một lượng khí là CO2, CH4, H2. Acid béo bay hơi giải phóng kích thích chất đệm sinh khí và đo lường trong hệ thống sinh khí in vitro. Lượng khí sinh ra trong hệ thống sinh khí in vitro có thể được ghi nhận qua một hay nhiều thời điểm khác nhau. Sự sinh khí này được xem như là sản phẩm hoạt tiêu hóa thức ăn của vi sinh vật dạ cỏ và phản ánh được khả năng tiêu hóa của mỗi loại thức ăn. - Nguyên lý sinh khí Khi thức ăn được ủ trong môi trường in vitro, sẽ được chuyển thành các acid béo bay hơi, khí (CO2 và CH4) và tế bào vi sinh vật. trong môi trường in vitro có chất đệm bicarbonate, khi acid béo bay hơi sinh ra lập tức CO2 được giải phóng ổn định pH. Như vậy lượng khí sinh ra trong hệ thống khí in vitro bao gồm khí sinh ra trực tiếp từ sự lên men là CO2, CH4 và H2, và khí sinh ra gián tiếp từ sự lên men là CO2. Đối với thức ăn thô, khoảng 50% khí sinh ra từ chất đệm và phần còn lại là lượng khí sinh ra trực tiếp từ quá trình lên men (Blümmel và Ørskov,1993). Còn đối với thức ăn hỗn hợp, khí sinh ra từ chất đệm khoảng 60% (Getachew et al..,1998). 6 Người ta thấy rằng mỗi mmol acid béo bay hơi sinh ra sẽ giải phóng khoảng 0,8-1,0 mmol CO2 từ dung dịch đệm (Beuvink và Spoelstra, 1992; Blümmel và Ørskov, 1993). Đặc biệt lượng khí sinh ra có mối tương quan cao với acid béo bay hơi và từ đó người ta xem lượng khí sinh ra như một chỉ thị để đo lường sản phẩm sinh ra từ quá trình lên men trong kỹ thuật sinh khí in vitro (Blümmel và Ørskov,1993). Lượng khí sinh ra còn phụ thuộc vào thành phần dư ng chất của thức ăn, thức ăn chứa nhiều carbohydrate có lượng khí sinh ra cao. Trong khi sự lên men của đạm giải phóng khí chỉ với lượng nhỏ và khí sinh ra từ sự lên men béo thì không đáng kể (Makkar, 2004). Dự đoán tỉ lệ tiêu hóa và năng lượng trao đổi thức ăn Việc dự đoán tỉ lệ tiêu hóa thức ăn và trao đổi từ thành phần hoá học thông qua các hàm hồi qui trước đây đã được ứng dụng rộng rãi. Sau đó có nhiều phương pháp phân tích khác được ra đời như tỉ lệ tiêu hóa in vitro, in situ, enzyme, in vitro sinh khí…Các phương pháp này đã được đánh giá và phân tích trong nhiều báo cáo khoa học và cho thấy chúng dự đoán được các tham số trên thí nghiệm in vitro xác thực hơn phương pháp phân tích hóa học ( Lopéz et att., 2000). Đặc biệt phương pháp in vitro sinh khí được sản xuất bởi Menke et al. (1979) rất hữu dụng trong việc dự đoán tỉ lệ tiêu hóa và trao đổi thức ăn (Makkar, 2004). Natarja et al. (1998) cho biết thêm sử dụng in vitro sinh khí kết hợp với thành phần hóa học đánh giá 96% sự thay đổi tỉ lệ tiêu hóa thức ăn. Dự đoán mức tiêu thụ thức ăn Yếu tố chính làm hạn chế khả năng sử dụng thức ăn thô của gia súc nhai lại là mức tiêu thụ thức ăn. Cho nên việc dự đoán mức tiêu thụ thức ăn, đặt biệt là thức ăn thô xơ là một chỉ tiêu quan trọng trong dinh dư ng gia súc nhai lại. Phương pháp nền tảng để dự đoán chỉ tiêu này là quan sát trong điều kiện in vitro. Sau đó hệ thống tẩy rửa Van Soest ra đời và cho thấy NDF ( xơ trung tính) có mối liên hệ với mức tiêu thụ thức ăn. Đặc biệt khi in vitro sinh khí ra đời người tin tưởng vào in vitro sinh khí hơn khi dự đoán mức tiêu thụ thức ăn ( Getachew et al., 1998). Bước đầu người ta thấy rằng khí sinh ra từ DM lên men có mối liên hệ có ý nghĩa với mức tiêu thụ và sau đó khi kiểm chứng với khí lên men từ NDF cho thấy diễn tả được 82% sự thay đổi về mức tiêu thụ thức ăn trong khi chỉ có 75% ở DM (Blümmel và Becker, 1997). Dự đoán tốc độ tiêu hóa thức ăn 7 Trong các quan điểm mới gần đây về sự tiêu hóa thức ăn ở gia súc nhai lại, không chỉ quan tâm về tiềm năng tiêu hóa mà còn rất quan tâm đến hiệu quả tiêu hóa (phạm vi tiêu hóa) của thức ăn, vì sự tận dụng thức ăn ở thú không chỉ phụ thuộc vào tiềm năng tiêu hóa cảu thức ăn mà còn phụ thuộc rất lớn vào tốc độ thức ăn đi qua đường tiêu hóa. Tham số phạm vi tiêu hóa sẽ diễn tả tốt 2 yếu tố trên. Diễn tả được phạm vi tiêu hóa thức ăn sẽ cung cấp một cơ sở hữu dụng để đánh giá khả năng tận dụng được dư ng chất từ thức ăn đó cho nhai lại. Trong nhiều báo cáo gần đây người ta thấy rằng phân tích động lực lên men thức ăn bằng in vitro sinh khí thuận tiện hơn nhờ ít tốn thời gian, chi phí và công lao động. Dự đoán acid béo bay hơi Chỉ số acid béo bay hơi trong dạ cỏ giữ vai trò quan trọng trong ước lượng thức ăn. Acid béo bay hơi là kết quả hoạt động lên men thức ăn của vi sinh vật là nguồn năng lượng quan trọng cung cấp cho vật chủ trong hệ thống sinh lý dinh dư ng của thú nhai lại. Như diễn tả trên acid béo bay hơi và lượng khí trong hệ thống in vitro sinh khí có mối liên hệ với nhau. Xuất phát từ đó, có nhiều nghiên cứu ra đời nhằm tìm mối liên hệ giữa acid béo bay hơi ở in vivo và in vitro sinh khí để dự đoán chỉ số này hữu hiệu hơn (Brown et al., 2002). Các kết quả đã cho thấy rất có tiềm năng trong dư đoán acid béo bay hơi ở in vivo bởi in vitro sinh khí. Dự đoán methan Trong quá trình tiêu hóa thức ăn trong dạ cỏ, ngoài các sản phẩm chính tạo ra là các acid béo bay hơi và protein vi sinh vật có vai trò cung cấp năng lượng và đạm cho gia súc còn tạo ra thêm một số sản phẩm phụ khác như CO2, CH4, H2,…Trong đó đáng lưu ý nhất là CH4, nó làm ô nhiễm môi trường khi được bài thải ra ngoài bằng sự ợ hơi..Chính vì vậy có nhiều nghiên cứu tìn cách giảm lượng methan trong tiêu hóa nhai lại để nâng cao năng suất vật nuôi và giảm ô nhiễm môi trường (Getachew et al., 2005). Trong truyền thống, sự bài thải methan từ gia súc nhai lại được xác định từ trong điều kiện thú sống, điều này làm tốn nhiều kinh phí trong đánh giá. Trong một trắc nghiệm gần đây, Getachew et al. (2005) thấy rằng in vitro sinh khí có thể dùng để xác định methan thải ra từ sự tiêu hóa. Trên thực tế đã có một số nghiên cứu sử dụng in vitro sinh khí để dự đoán methan trong quá trình tiêu hóa thức ăn của vinh sinh vật dạ cỏ để đưa ra các chiến lược làm giảm methan và cho kết qủa rất tiềm năng (Getachew et al., 2005). Dự đoán các chất kháng dưỡng 8 In vitro sinh khí có thể dùng để xác định các chất kháng dư ng trong thức ăn và nó tỏ ra có ích hơn các phương pháp khác (Makkar, 2004). Để xác định được mức độ ảnh hưởng của chất kháng dư ng trong thức ăn bằng in vitro sinh khí người ta sẽ bổ sung thêm chất bất hoạt của kháng dư ng vào hệ thống in vitro sinh khí và so với sự sinh khí ở trường hợp không bổ sung chất bất hoạt. Makkar (2004) cho biết in vitro sinh khí đã được ứng dụng nhiều trong các nghiên cứu về ảnh hưởng và tương tác của các chất kháng dư ng như phenol, tannin, saponin. Tổng hợp từ nhiều nghiên cứu, Makkar (2004) kết luận rằng in vitro sinh khí là một công cụ đơn giản, rẻ tiền và khó thay thế để nghiên cứu các ảnh hưởng và tương tác các chất kháng dư ng chứa trong thức ăn gia súc nhai lại. 2.5 HỆ SINH THÁI DẠ CỎ 2.5.1 Môi trường sinh thái dạ cỏ Chất chứa dạ cỏ là một hỗn hợp gồm thức ăn ăn vào, vi sinh vật dạ cỏ, các sản phẩm trao đổi trung gian, nước bọt và các chất chế tiết qua vách dạ cỏ. Dạ cỏ có môi trường thuận lợi cho vi sinh vật kỵ khí bắt buộc và tùy ý sống và phát triển (Trần Cừ, 1979, Nguyễn Xuân Trạch, 2007). VSV dạ cỏ có vai trò trong quá trình tiêu hóa thức ăn của vật chủ, thủy phân chất xơ, tổng hợp protein từ amoniac (Nguyễn Xuân Trạch, 2007). 2.5.2 Hệ vi sinh vật dạ cỏ Vi sinh vật dạ cỏ gồm nấm với số lượng 103 – 104 tế bào/ml; vi khuẩn 1010 -1011 tế bào/ml và nguyên sinh động vật là 105 – 106 tế bào/ml ( ouany và Ushida, 1999). Trong đó, vi khuẩn và nấm có vai trò tiêu hóa thức ăn quan trọng hơn động vật nguyên sinh (Hungate, 1966). Số lượng vi sinh vật dạ cỏ biến đổi theo mùa và trong suốt ngày đêm, thành phần của khẩu phần thức ăn (Eadie và Hobson, 1962; Duncan et al. , 1953; Gale et al., 1949) Chức năng của nấm trong dạ cỏ là: mọc chồi phá v cấu trúc thành tế bào thực vật, làm giảm độ bền chặt của cấu trúc này, góp phần phá v các mãnh thức ăn trong quá trình nhai lại, tiết ra các loại men thủy phân hầu hết các loại glucid. Như vậy sự có mặt của nấm giúp làm tăng tốc độ tiêu hóa xơ điều này đặc biệt có ý nghĩa đối với việc tiêu hóa thức ăn thô xơ bị lignin hóa (Nguyễn Xuân Trạch, 2007). Vi khuẩn bị cạnh tranh mạnh bởi động vật nguyên sinh (Hungate, 1966; Coleman, 1975). Coleman (1975) cho biết trong một giờ động vật nguyên sinh ăn 102 -104 tế bào vi khuẩn của dạ cỏ. New et al. (1998) cho biết thêm mỗi loại vi khuẩn có mức độ nhạy cảm khác nhau đối với động vật nguyên sinh và tác 9 giả điều tra cho thấy Entodinium candatum ăn Prevotella sp. nhiều hơn Streptococcus bovis. Tác dụng chính của nguyên sinh động vật trong dạ cỏ là tiêu hóa tinh bột và đường, xé rách màng tế bào thực vật, tích lũy polysaccharite và bảo tồn nối đôi của các acid béo không no (Nguyễn Xuân Trạch, 2007). Tuy nhiên, nguyên sinh động vật ăn khoảng 90% protein vi khuẩn trong dạ cỏ. Cho nên khi dạ cỏ được loại bỏ nguyên sinh động vật đã có sự đáp ứng tốt trên sự phân hủy cellulose khả năng tiêu hóa thức ăn, tăng được lượng protein thoát qua và giảm ammonia dạ cỏ ( ounany và Ushida, 1999). Itabashi et al. (1989) cho biết sự hiện diện của nguyên sinh động vật làm giảm lượng peptid trôi xuống ruột. Theo ouany (1994) sự loại bỏ nguyên sinh động vật đã hạn chế được khí methane từ 30 – 45% và không ảnh hưởng lên acid béo bay hơi. Tuy nhiên, khi khẩu phần cân bằng dư ng chất loại bỏ nguyên sinh động vật đã làm tỉ lệ tiêu hóa giảm, tiêu hóa xơ giảm đi 10% khi cừu loại bỏ nguyên sinh động vật ( ouany và Ushida, 1999). Có lẽ do sự hiện diện của nguyên sinh động vật khuyến khích sự hoạt động của vi khuẩn để cạnh tranh với nguyên sinh động vật (Wiliam và Coleman, 1992). Theo Trần Cừ (1979) những loài vi sinh vật khác nhau sống ở dạ cỏ có quan hệ chặt chẽ và phụ thuộc lẫn nhau. Sự sinh trưởng của một loài vi sinh vật này có thể phụ thuộc một cách đặc biệt vào sự có mặt của các loài khác và tổng số hoặc tỷ lệ mỗi loài có thể được biến đổi ở các điều kiện khác nhau. Trong lúc một số vi sinh vật sinh trưởng thì một số khác chết và phân hủy khiến cho ở mỗi thời điểm nhất định trong dạ cỏ mật số vi sinh vật khác nhau. ounany và Ushida (1999) kết luận rằng việc loại bỏ nguyên sinh động vật chỉ có ích khi khẩu phần thấp đạm và giàu năng lượng. Ruột già có hiện diện các vi sinh vật làm nhiệm vụ tiếp tục lên men các monosaccharid, acid amin không được hấp thu ở ruột non, các chất tiết nội sinh và các carbohydrate cấu trúc thoát qua sự lên men tại dạ cỏ tạo thành các acid béo bay hơi. Người ta ước tính được cellulose có khả năng tiêu hóa được trong ruột già nhai lại có thể lên đến 10% tổng cellulose (Phillipson, 1977). Bằng kỹ thuật in vitro người ta nghiên cứu thấy rằng sản phẩm lên men xơ của vi sinh vật ở ruột sau tương tự như vi sinh vật dạ cỏ (Váradyová et al., 2000). Nhưng ở ruột sau không có sự hiện diện của nguyên sinh động vật và nấm (Demeyer và Graeve, 1991; López et al., 2000) cho nên sự lên men xơ bởi vi sinh vật ruột sau kém hơn dạ cỏ (Váradyová et al., 2000; López et al, 2000; Omed et al, 2000).  Nhu cầu dinh dưỡng của vi sinh vật dạ cỏ 10 Nồng độ NH3 thích hợp trong dạ cỏ là 50 – 250 mg/ml dịch dạ cỏ (Nguyễn Xuân Trạch, 2007). Các loại khoáng, đặc biệt là photpho và lưu huỳnh cũng như một số vitamin (A, D, E) rất cần cho VSV dạ cỏ và cần được bổ sung thường xuyên vì chúng thường thiếu trong thức ăn thô. Photpho cần thiết cho cấu trúc acid nucleic và màng tế bào của VSV, cũng như cần cho các hoạt động trao đổi chất và năng lượng của chúng. Lưu huỳnh là thành phần cần thiết khi tổng hợp một số acid amin (Nguyễn Xuân Trạch, 2007). Bổ sung acid valeric và iso valeric vào chất chứa dạ cỏ sẽ kích thích sự tiêu hóa cellulose in vitro, acid valeric và iso valeric không chỉ kích thích hoạt tính của vi sinh vật thủy phân xơ mà còn kích thích sự sinh tổng hợp protit vi khuẩn trong dịch dạ cỏ bò cái (Huhtanen và Elliott, 1956; Bently et al, 1954). 2.6 VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE TRONG ĐIỀU KIỆN YẾM KHÍ Ở điều kiện yếm khí, vai trò của nấm và xạ khuẩn không quan trọng, còn vi khuẩn chiếm ưu thế trong điều kiện này. Nấm sợi phân giải cellulose mạnh hơn vi khuẩn vì chúng tiết vào môi trường lượng enzyme ngoại bào nhiều hơn vi khuẩn. Vi khuẩn thường tiết vào môi trường phức hệ enzyme cellulase không hoàn chỉnh chỉ thuỷ phân được cơ chất đã cải tiến như giấy lọc và CMC, còn nấm tiết vào môi trường hệ thống cellulase hoàn chỉnh nên có thể thuỷ phân cellulose hoàn toàn. Các vi khuẩn phân giải cellulose trong điều kiện yếm khí phần lớn thuộc chi Clostridium. Chi vi khuẩn này có khả năng hình thành nội bào tử và chịu đựng được nhiệt độ cao. Các glucose được các sinh vật hấp thụ trực tiếp qua màng tế bào. Bên trong tế bào vi sinh vật, glucose được phân giải tiếp thành CO2 và H2O trong điều kiện hiếu khí. Còn trong điều kiện yếm khí, glucose được phân giải cho ra acid hữu cơ và cồn ethanol. Riêng cồn sẽ được các loại vi khuẩn methanhoá phân giải thành methan. Các loại acid hữu cơ sinh ra trong quá trình phân giải trong điều kiện yếm khí có khác nhau tuỳ loại vi sinh vật phân giải như: acetic acid, lactic acid, formic acid, butyric acid, succinic acid... So với sự phân giải trong điều kiện hiếu khí, quá trình phân giải cellulose trong điều kiện yếm khí ít bị ảnh hưởng bởi hàm lượng nitơ. Có lẽ do trong điều kiện yếm khí, sự đồng hoá chất hữu cơ của vi sinh vật không lớn nên không cần nhiều nitơ. 2.7 VAI TRÒ CỦA pH TRONG DẠ CỎ 11 Trong dạ cỏ pH được điều chỉnh liên tục bởi các quá trình lên men. Các axit béo bay hơi tạo ra trong quá trình lên men được hòa tan bởi các muối kiềm của nước bọt, dung dịch đệm bicarbonat, photphat natri và kali có pH > 8.2. Ngoài ra, các axit béo còn được trung hòa bởi NH3 tạo ra trong quá trình các vi sinh vật phân giải protein. Mặt khác, phần lớn các axit béo bay hơi tạo ra được hấp thu qua màng nhầy của dạ cỏ, do đó hạn chế sự thay đổi độ pH trong dạ cỏ. Khi pH dạ cỏ thấp dẫn đến thay đổi số lượng vi khuẩn phân giải cellulose, amylose và thường protozoa cũng bị mất theo. Giá trị pH còn phụ thuộc vào thời gian sau khi ăn, môi trường trung tính ở dạ cỏ luôn được duy trì để đảm bảo cho quá trình lên men được liên tục. Khối lượng vi sinh vật trong dạ cỏ được duy trì ở mức ổn định do sự duy chuyển số lượng vi sinh vật xuống dạ dưới, chết và phân hủy vi sinh vật ngay trong dạ cỏ. Mêtan và cacbonic cũng là sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men. Khi pH dạ cỏ thấp, cacbonic tách khỏi dung dịch và tích tụ ở túi vùng lưng, sau đó được thải ra qua ợ hơi (Hungate et al., 1952). Khi độ pH cao, hầu hết các khí cacbonic sản sinh trong quá trình lên men hay từ nước bọt xuống được hấp thu và thải ra qua phổi. 2.8 VAI TRÒ CỦA NH3 TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN DỊCH DẠ CỎ Theo Presston and Leng (1987) NH3 trong dịch dạ cỏ bao gồm các protein, peptid, axit amin và các nguyên liệu nitơ hòa tan khác. Urê, axit uric và nitrate được chuyển hóa nhanh chóng thành NH3 trong dạ cỏ. Các axit nucleic trong dịch dạ cỏ có lẽ cũng được phân giải rất mạnh thành NH 3. Hầu hết các khẩu phần chủ yếu là phụ phẩm nông nghiệp và cỏ có tỉ lệ tiêu hóa thấp thì hạn chế chủ yếu đối với sinh trưởng vi sinh vật dạ cỏ là nồng độ NH 3 trong dịch dạ cỏ. Nồng độ NH3 phải cao hơn mức giới hạn trong ngày. Để có tỉ lệ tiêu hóa tối đa trong dạ cỏ thì qua đó cũng có khối lượng vi sinh vật lớn nhất, lượng NH3 luôn biến động theo khẩu phần. Nồng độ NH3 trong dịch dạ cỏ đòi hỏi đảm bảo tối đa cho vi sinh vật tăng trưởng trong phòng thí nghiệm có giá trị 20 ÷ 50 mg/lít dịch dạ cỏ. Để thức ăn được phân giải tối đa bởi vi sinh vật dạ cỏ thì nhu cầu tối thiểu nồng độ NH3 trong dạ cỏ cao hơn đã được trình bày cho những thức ăn có chất lượng thấp, nồng độ NH3 khoảng 60 ÷ 100 mg/lít. Theo Alvarez et al., (1983) cho biết, với loại cỏ chứa một lượng protein thô đáng kể thì hình như vi sinh vật bám vào sợi xơ phụ thuộc vào nitơ có trong thành phần thức ăn. Hiệu suất sinh trưởng của loại vi sinh vật này ít bị ảnh hưởng bởi lượng NH3 trong dịch dạ cỏ. Đối với loại thức ăn nhiều xơ ít nitơ hoặc các loại thức ăn chủ yếu là carbohydrate hòa tan (như mía) thì nồng độ NH3 tới hạn phải cao hơn so với thức ăn giàu protein. 12 Thiếu NH3 dẫn đến giảm hiệu quả hệ thống vi sinh vật dạ cỏ mặc dù con đường tổng hợp axit amin ở vi sinh vật dạ cỏ chưa được xác định rõ. Tuy nhiên người ta thấy rằng NH3 đóng vai trò quan trọng cho việc tổng hợp có hiệu quả axit amin và protein ở vi sinh vật. Tốc độ tổng hợp của vi sinh vật cao nhất ở nồng độ NH3 từ 5 ÷ 8 mgN/100 ml dịch dạ cỏ (Satter and Styler, 1974). 2.9. THỰC LIỆU THÍ NGHIỆM 2.9.1 Thân lá cây bắp Thân lá cây bắp sau thu hoạch có giá trị dinh dư ng cao nhất trong tất cả các loại phụ phế phẩm từ ngũ cốc, và vì thế nó có tiềm năng lớn trong việc cải thiện dinh dư ng cho gia súc. Theo kết quả nghiên cứu của (Đinh Văn Cải và cộng tác 1999) thì thân cây bắp sau thu hoạch có 25-26% chất khô; 32% xơ thô; 68,7% NDF; Tỷ lệ tieu hoá chất hữu cơ: 53,3% và năng lượng trao đổi cho trâu bò: 7,46 M /kg chất khô. Cản trở lớn nhất đối với việc sử dụng thân cây bắp sau thu hoạch là khô cứng vì vậy cần thiết bị cán dập, chặt ngắn, phơi khô trước khi cho ăn hoặc phơi khô dùng dần. 2.9.2 Rơm rạ Rơm rạ ở nước ta có khối lượng rất lớn nhưng tỷ lệ sử dụng trong chăn nuôi trâu bò còn rất khiêm tốn. Phần lớn chúng được sử dụng làm chất đốt, làm phân bón hay dung làm chất ủ. Ngoài ra chúng còn có thể sử dụng như một nguồn thức ăn chính để nuôi trâu bò. Rơm rạ còn là chất xơ rất tốt để phối hợp với thức ăn nhuyễn, những thức ăn đắt tiền khác trong chăn nuôi trâu bò sữa hay vỗ béo thịt. Rơm lúa rất giàu Kali (K) hòa tan nhưng thiếu Canxi (Ca) có khả năng hấp thu, vì thế gia súc được nuôi dư ng bằng rơm lúa là chính thì cần phải bổ sung thêm nguồn Ca dễ tiêu. Rơm lúa còn có thành phần lignin thấp (6-7%) nhưng thành phần Silic cao (12-16%) so với các loại phế phẩm cây trồng khác (thường có khoảng 10-12% Silic). Thành phần Silic cao là nguyên nhân chính dẫn đến tỷ lệ tiêu hóa kém. Phần thân lúa được tiêu hóa nhiều hơn lá vì thế nên gặt lúa ở mức càng thấp càng tốt. Thành phẩn khóa học (% khối lượng) của rơm rạ gồm chủ yếu là xenluloza (60%), lignin (14%), chất béo (1,9%) và protein (3,4%). Thành phần nguyên tố (% khối lượng): C~44%, H ~5%, N~0,92%, O ~49%. Khẩu phần chủ yếu là rơm lúa với một lượng nhỏ thức ăn bổ sung sẽ làm cho bê tăng trưởng chậm, tuổi đẻ lứa đầu lúc 4-5 năm, còi xương và bò có tỷ lệ đậu thai thấp. 13 2.9.3 Bã mía Bã mía chiếm 25-30% trọng lượng mía đem ép. Trong bã mía chứa trung bình 49% là nước, 48% là xơ (trong đó chứa 45-55% cellulose) 2,5% là chất hoà tan (đường). Bã mía có thể dùng làm nguyên liệu đốt lò, hoặc làm bột giấy, ép thành ván dùng trong kiến trúc, cao hơn là làm ra Furfural là nguyên liệu cho ngành sợi tổng hợp.(http://vi.wikipedia.org/wiki/M%C3%ADa). Thành phần hóa học trong bã mía : Cellulose 46,0 %, Hemicelluloses 24,5 %, Lignin 20,0 %, Chất béo 3,4 %, Tro 2,4 %, Silica 2,0 %. Bổ sung acid valeric và iso valeric vào chất chứa dạ cỏ sẽ kích thích sự tiêu hóa cellulose in vitro, acid valeric và iso valeric không chỉ kích thích hoạt tính của vi sinh vật thủy phân xơ mà còn kích thích sự sinh tổng hợp protit vi khuẩn trong dịch dạ cỏ bò cái (Huhtanen và Elliott, 1956; Bently et al, 1954). 2.10 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƯỚC 2.10.1 Tình hình nghiên cứu trong nước Đỗ Thị Cẩm Hường (2012) đã phân lập được 62 dòng vi khuẩn từ dạ cỏ bò và tuyển chọn dược 3 dòng vi khuẩn có khả năng thủy phân bã mía mạnh (BM13, BM21, BM49). Kết quả cho thấy với 6% (v/v) tổ hợp 3 dòng vi khuẩn này đem ủ 3 ngày trong điều kiện in vitro cho khả năng phân giải bã mía tốt các nghiệm thức đối chứng là: 7,61% DM , 5,81% NDF, 7,59% tỷ lệ tiêu hóa xơ thô. Danh Mô (2003, 2009) nghiên cứu và kết luận việc sử dung 42ml dung dịch dạ cỏ và 8ml dung dịch đệm có thể thay thế được 10ml dịch dạ cỏ và 40ml dư ng chất từ hóa chất bao gồm trypticase, NaHPO4, KH2PO4, MgSO4, CaCl2, MnCl2, CoCl2, và FeCl3 và chất đệm trong nghiên cứu in vitro truyền thống. Phương pháp này có thể sử dụng để đánh giá tỷ lệ tiêu hóa thức ăn nhanh thay cho in vitro truyền thống, giảm được việc sử dụng hóa chất và chi phí, ít phức tạp, giảm lao động trong quá trình pha chế hóa chất so với phương pháp truyền thống, và khắc phục tình trạng thiếu hóa chất trong các phòng thí nghiệm. Các kết quả chỉ ra rằng nguồn dịch dạ cỏ (DDC) gia súc nhai lại có chứa các dư ng chất cần thiết cho vi sinh vật phát triển và sử dụng ở mức đọ 42ml dịch dạ cỏ với 8ml (42DDC) dung dịch đệm thay cho các hóa chất Goering và Van Soest (GVS) đề nghị làm nguồn dư ng chất cho vi sinh vật để xác định tỷ lệ tiêu hóa thức ăn thô in vitro. Nguồn dịch dạ cỏ thu lấy từ lò mổ có tiềm năng tận dụng làm nguồn vi sinh vật để xác định tỷ lệ tiêu hóa và nguồn dư n chất thay gia súc mổ lỗ dò trong xác định tỉ lệ tiêu hóa in vitro. Phân cũng có 14 thể làm nguồn vi sinh vật chủng trong nghiên cứu tiêu hóa thức ăn in vitro (VSVP) Kỹ thuật xác định tỷ lệ tiêu hóa in vitro 42DDC có giá thành thấp và bảo vệ môi trường so với in vitro GSV và in vitro VSVP do tận dụng được vật liệu sẵn có và ít dùng hóa chất. Kỹ thuật tiêu hóa in vitro 42DDC có thể ứng dụng để đánh giá chất lượng thức ăn thô, mức tiêu thụ thức ăn và mức tăng khối lượng của gia súc nhai lại. Kỹ thuật này có mối quan hệ tuyến tính gần với kỹ thuật ước lượng tỉ lệ tiêu hóa in vivo (R2 > 0,93), in sacco (R2 = 0,83), in vitro GVS (R2 = 0,93), sinh khí in vitro (R2 = 0,82) và in vitro VSVP R2 = 0,90). Qui trình kỹ thuật in vitro 42DDC là ủ yếm khí 0,5g mẫu với 42ml DDC + 8ml dung dịch đệm ở 40oC, và sau đó là xử lý với dung dịch tẩy trung tính ở 85oC trong 12 giờ. Trần Hồ Diễm Đoan (2013) khi thực hiện thí nghiệm in vitro để khảo sát khả nằng phối hợp phân giải bã bã mía của các dòng vi khuẩn dạ cỏ dê và bò đã tìm ra 2 dòng vi khuẩn dê (DD7 và DD9) khi kết hợp với các dòng vi khuẩn dạ cỏ bò cho hiểu quả cao nhất với 27mm đường kính thủy phân và 11,13 % DM bã mía phân giải được. Khi giải trình tự gen cho thấy dòng DD9 đồng hình đến 94% với dòng Bacillus Subtilis RC24. Khi phối hợp các dòng vi khuẩn dạ cỏ bò (BM13, BM21, BM49) với DD9 cho kết quả phân giải bã mía tốt nhất (21,27 DM, 8,17 cellulose, 10,22% hemicellulose). Nguyễn Đức Lượng và Nguyễn Phượng Hải (1996) nghiên cứu thành công việc tuyển chọn vi sinh vật tổng hợp cellulase cao để xử lý chất hữu cơ chứa cellulose. Hà Thanh Toàn et al.,, (2010) khảo sát khả năng phân giải rác thải hữu cơ của 3 dòng vi khuẩn gồm có 1 dòng vi khuẩn bình nhiệt (300C)(dòng C1b), 2 dòng vi khuẩn ái nhiệt (550C)(dòng 3a1 và 3a2). Kết quả cho thấy 2 nghiệm thức C2 (chủng vi khuẩn phân giải cellulose bình nhiệt dòng C1b) và nghiệm thức C4 (chủng vi khuẩn ái nhiệt dòng 3a2)đạt được các chỉ tiêu phù hợp nhất. Hơn nữa 2 nghiệm thức này có lượng khí CO2, CH4 thải ra rất thấp, không gây ảnh hưởng đến môi trường. Võ Văn Phước Huệ (2011) phân lập các dòng vi khuẩn từ mẫu đất trồng lúa và dạ cỏ bò, có khả năng tổng hợp cellulose trên cơ chất rơm rạ và giấy photocopy từ đất trồng lúa và dạ cỏ bò. Kết quả thu được 4 dòng vi khuẩn (Q4, Q5, Q7 và Q8) có khả năng phân giải cellulose mạnh nhất. Trong đó, các dòng vi khuẩn cho thấy ba dòng Q5, Q7 và Q8đồng hình 99% với dòng Bacillus megaterium, dòng vi khuẩn Q4 đồng hình 99% với dòng Cellulomonas flavigena. 15 2.10.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới Abou-Taleb et al, (2009) Khảo sát sự ảnh hưởng của các nhân tố dinh dư ng và môi trường đến sản xuất cellulase của hai dòng vi khuẩn Bacillus alcalophilus S39 và Bacillus amyloliquefaciens C23 phân hủy cellulose. Xác định được rằng 1% CMC và 0,7% yeast là hàm lượng cung cấp carbon, nitơ và 3% vi khuẩn chủng vào ở điều kiện pH 7 là thích hợp nhất để sản xuất cellulase của hai dòng vi khuẩn này. Oyeleke và Okusanmi (2008), đã tiến hành phân lập và khảo sát hoạt tính thủy phân cellulose của vi sinh vật từ dạ cỏ động vât nhai lại như bò, cừu và dê. Kết quả phân lập được một số dòng vi khuẩn và nấm có khả năng thủy phân cellulose như P. eruginosa, Streptococcus, Bacillus, Penicillin, Aspergillus, Mucor và Fusarium. Clostridium papyrosolvens cũng được phát hiện có khả năng tổng hợp cellulase. Clostridium papyrosolvens được nuôi cấy 48h trong điều kiện kỵ khí ở 350C cho dịch trích có hoạt tính CMCase cao. CMCase có nhiệt độ tối thích là 350C và pH tối thích là 6,5 đến 7,5 (Rani và Thirumale, 2004). 16 Hình 2.2: Thân lá cây bắp Hình 2.4: Rơm khô Hình 2.3: Bã mía 17 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 3.1.1 Địa điểm, thời gian Địa điểm: Đề tài tiến hành tại Phòng Chăn nuôi chuyên khoa - E103, Bộ môn chăn nuôi, Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ. Dịch dạ cỏ dùng để thí nghiệm in vitro được lấy trên cơ thể của bò đực lai Sind, đã được mổ lỗ dò tại trại bò Tầm Vu, Quận Cái Răng, TP. Cần Thơ Thời gian: Đề tài được thực hiện hơn 4 tháng từ ngày 15/08/2013 đến ngày 15/12/2013. 3.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất Dụng cụ dùng để lấy dịch dạ cỏ của bò: - Bình đá dùng để giữ ẩm, khi lấy dịch từ dạ cỏ của bò sẽ được trữ trong keo nhựa, keo nhựa được đựng trong bình đá đảm bảo nhiệt độ của dịch dạ cỏ không bị thay đổi đáng kể khi duy chuyển về phòng thí nghiệm. Vi sinh vật trong dịch dạ cỏ có thể bị chết nếu dịch dạ cỏ không đảm bảo nhiệt độ cho vi sinh vật hoạt động. - Bơm tiêm 50 ml/cc dùng để hút dịch ra khỏi dạ cỏ thông qua ống nhựa dẻo được đặt trong ống uPVC. - Ống uPVC đường kính 18 mm. - Ống nhựa dẻo đường kính 6 mm. - Keo nhựa dung tích 5 lít, dùng để trữ dịch dạ cỏ khi lấy dịch ra khỏi dạ dày của bò. Bộ dụng cụ thí nghiệm tỉ lệ tiêu hóa - Túi vải lọc mẫu. - Bình tam giác. - Beaker 50ml, 250ml, 500ml. - Ống đong 10ml, ống hút. - Pipette. - Phiễu đong. - Ống chuẩn độ. 18 - Bộ Kjeldahl. Thiết bị dùng để thí nghiệm : -Bath water dùng để ủ in vitro - Tủ sấy xác định trọng lượng - Lò nung. - Tủ lạnh. - Cân điện tử. - Máy chụp ảnh kỹ thuật số. - Máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu. - Tủ hút. - Keo ủ dùng để ủ thực liệu khảo sát trong 24 giờ. - Bơm tiêm đo thể tích khí dùng để đo thể tích khí sinh ra tương ứng khi ta ủ thực liệu. Hóa chất: acetone, NaOH 40%, H2SO4 đậm đặc, axid boric… 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1. Bố trí thí nghiệm *Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu lên quá trình sinh khí (gas volume), pH, NH3 và tỷ lệ tiêu hóa của bã mía trong điều kiện in vitro. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu lên quá trình sinh khí (gas volume), pH, NH3 và tỷ lệ tiêu hóa của bã mía trong điều kiện in vitro Lặp Lại Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 NT1 - - - - - NT2 - - - - - NT3 - - - - - NT4 - - - - - N.Thức Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 4 nghiệm thức (NT) và 5 lần lặp lại. Trong đó NT2 đến NT4 lần lượt bổ sung vi khuẩn dạ cỏ trâu (có mật số 107 CFU/ml) với 3 mức độ lần lượt là 0,5%, 1%, 2%. 19 Các chỉ tiêu theo dõi : + Hàm lượng gas volume 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ và 24 giờ. + pH. + NH3. + Tỷ lệ tiêu hóa của bã mía trong điều kiện in vitro. *Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu lên quá trình sinh khí (gas volume), pH, NH3 và tỷ lệ tiêu hóa của rơm trong điều kiện in vitro. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu lên quá trình sinh khí (gas volume), pH, NH3 và tỷ lệ tiêu hóa của rơm trong điều kiện in vitro Lặp Lại Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 NT1 - - - - - NT2 - - - - - NT3 - - - - - NT4 - - - - - N.Thức Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 4 nghiệm thức và 5 lần lặp lại. Trong đó NT2 đến NT4 lần lượt bổ sung vi khuẩn dạ cỏ trâu (có mật số 107 CFU/ml) với 3 mức độ lần lượt là 0,5%, 1%, 2%. Các chỉ tiêu theo dõi : + Hàm lượng gas volume 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ và 24 giờ. + pH. + NH3. + Tỷ lệ tiêu hóa của bã mía trong điều kiện in vitro. *Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu lên quá trình sinh khí (gas volume), pH, NH3 và tỷ lệ tiêu hóa của thân lá cây bắp trong điều kiện in vitro. 20 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu lên quá trình sinh khí (gas volume), pH, NH3 và tỷ lệ tiêu hóa của thân lá cây bắp trong điều kiện in vitro Lặp Lại Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 NT1 - - - - - NT2 - - - - - NT3 - - - - - NT4 - - - - - N.Thức Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 4 nghiệm thức và 5 lần lặp lại. Trong đó NT2 đến NT4 lần lượt bổ sung vi khuẩn dạ cỏ trâu (có mật số 107 CFU/ml) với 3 mức độ lần lượt là 0,5%, 1%, 2%. Các chỉ tiêu theo dõi : + Hàm lượng gas volume 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ và 24 giờ. + pH + NH3. + Tỷ lệ tiêu hóa của bã mía trong điều kiện in vitro. 3.2.2 Tiến hành thí nghiệm -Bước 1: Cân 1gDM mẫu thức ăn theo các bảng lượng cân các nghiệm thức ứng với từng mức độ khi đem đi thí nghiệm, cẩn thận không được vương vãi mẫu, sau khi cân xong cho mẫu vào keo ủ tối màu. -Bước 2: Pha dung dịch đệm. Dung dịch đệm được sử dụng trong thí nghiệm là theo mô tả của Tilley and Terry (1963). Công thức pha dung dịch đệm được tính theo bảng 3.1. 21 Bảng 3.1 Lượng cân các hóa chất có trong 1 lít dung dịch đệm STT Hóa chất Lượng cân (g/lít) 1 NaHCO 3 50,96 2 KCl 2,94 3 CaCl 2 0,21 4 Na 2 HPO 4 .12H 2 O 5 NaCl 2,44 6 MgSO 4 .7H 2 O 0,62 7 Cystein 1,32 48,36 Dung dịch đệm sau khi pha xong được sục khí CO2 cho đến khi chuyển từ đục sang trong suốt. Chúng ta có thể làm ấm dung dịch đệm bằng cách cho thùng chứa dung dịch vào bồn ủ khoảng 15 phút, nhiệt độ nước trong bồn ủ được kiểm soát ở 38ºC trước khi sử dụng để tạo điều kiện nhiệt độ tốt, tránh sốc nhiệt cho vi sinh vật dạ cỏ. - Bước 3: Lấy dịch dạ cỏ. Dịch dạ cỏ được thu thập và được giữ ấm trong thùng đá sau đó nhanh chóng chuyển về phòng thí nghiệm. Tại đây dịch dạ cỏ được lọc qua 4 lớp vải muslin vào lọ, bơm khí CO2 rồi đậy kín tạo yếm khí và ủ ấm ở nhiệt độ 38ºC trước khi dùng để thực hiện thí nghiệm. Dựa vào số lượng đơn vị thí nghiệm và lượng thực liệu khi đem ủ là bao nhiêu từ đó ta cũng tính được lượng dung dịch dạ cỏ cần thí nghiệm là bao nhiêu. Đối với 1 gDM thực liệu ta cần 20 ml dung dịch dạ cỏ. -Bước 4: Trộn dịch dạ cỏ đã lấy vào dung dịch đệm tạo hỗn hợp dung dịch đệm và dịch dạ cỏ, khuấy đều cho lượng vi sinh vật trong dịch dạ cỏ phân bố đều trước khi chia ra từng lọ ủ. Dùng ống đong, đong 200 ml hỗn hợp dịch dạ cỏ và dung dịch đệm cho vào keo ủ đã có sẵn 1 gDM thực liệu, dùng đũa thủy tinh khuấy đều cho thực liệu thấm ướt hoàn toàn, tránh để thực liệu dính trên thành keo ủ, dùng bình tia chứa nước cất rửa thực liệu bị dính trên đũa thủy tinh vào trong keo ủ, tránh thất thoát mẫu ảnh hưởng đến kết quả, đậy kính keo ủ. -Bước 5: Dùng nút nhôm đóng kín xung quanh kẽ hở giữa nắp keo ủ và miệng keo ủ ngăn không cho không khí đi vào. Sắp xếp các keo ủ thực liệu vào khung inox cho vào buồng ủ, nhiệt độ ủ là 38ºC, tiến hành ủ và theo dõi lượng khí sinh ra tương ứng sau 24 giờ. 22 - Tính tỷ lệ tiêu hóa. Sau khi mẫu ủ trong 24 giờ đem ra lọc bằng túi vải đã xác định trọng lượng, lọc xong đem sấy ở 105oC cho đến khi trọng lượng không đổi. Công thức tính tỷ lệ tiêu hóa: Dư ng chất trước khi ủ - Dư ng chất sau khi ủ %TLTH = x 100 Dư ng chất trước khi ủ 3.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ THỐNG KÊ Số liệu thô được nhập vào bảng tính Microsoft Excel 2003. Sau đó được xử lý thống kê bằng phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) theo mô hình tuyến tính tổng quát (General Linear Model) trên p hần mềm Minitab 16. 23 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thành phần hóa học của thức ăn thí nghiệm (%) Bảng 4.1. Thành phần hóa học của thức ăn thí nghiệm (%) Thực liệu Bã mía Rơm khô Thân lá cây bắp %DM %ADF %NDF %CP %OM Ash 84,37 47,68 81,24 4,48 96,05 3,95 90,2 45,51 68,5 4,7 85,47 14,53 15,23 35,46 65,2 9,45 92,36 7,64 Hàm lượng vật chất khô của bã mía chiếm 84,37% (bảng 4.1). Phần trăm này thấp hơn so với kết quả báo cáo của Đỗ Thị Cẩm Hường (2012) nghiên cứu trên bã mía là 93,69% . Kết quả thấp là do bã mía trước khi tiến hành thí nghiệm đã được rửa sạch và sấy khô. Tỷ lệ NDF của bã mía thu được 81,24% kết quả này thấp hơn kết quả của Đỗ Thị Cẩm Hường (2012) là 89,05%. Tỷ lệ ADF của bã mía là 47,68% và tỷ lệ protein thô là 4,48% thấp hơn Nguyễn Nhật Xuân Dung et al, (2006) là 4,88% Rơm lúa là nguồn thức ăn dự trữ cho bò, nó có hàm lượng vật chất khô khá cao, qua nghiên cứu ta thấy rơm chiếm 90,2% hàm lượng vật chất khô cao hơn so với kết quả nghiên cứu của Danh Mô và Nguyễn Văn Thu (2008) là 83,2% DM và cao hơn báo cáo của Võ Phương Ghil (2011) là 87,81%. Hàm lượng protein thô của rơm trong thí nghiệm này rất thấp 4,7% kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Danh Mô và Nguyễn Văn Thu (2008) lần lượt là 4,74% và 4,68%. Hàm lượng NDF của rơm là 68,5% thấp hơn so với kết quả báo cáo của Võ Phương Ghil (2011) là 73,24%. Hàm lượng ADF là 45,51% cũng gần với nghiêm cứu của Võ Phương Ghil (2011) là 48,60%, nhưng cao hơn so với kết quả của Nguyễn Nhật Xuân Dung et al, (2009) là 36,44%. Hàm lượng vật chất khô của thân lá cây bắp trong thí nghiệm này là 15,23% tương đương với kết quả nghiên cứu của Danh Mô và Nguyễn Văn Thu (2008) là 15,1%. Hàm lượng NDF và ADF lần lượt là 65,2% và 35,46% thấp so với kết quả của Trương Tuấn Khải (2000) là 66,9% hàm lượng NDF và 42,08% hàm lượng ADF kết quả này thấp hơn là do thân lá cây bắp của thí nghiệm này được lấy lúc còn tươi và non nên hàm lượng xơ thấp. Hàm lượng protein thô chiếm 9,45% kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Trương Tuấn Khải (2000) là 9,0% CP. 24 4.2. Các thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu đến gas volume, tỷ lệ tiêu hóa của bã mía, rơm khô, thân lá cây bắp trong điều kiện in vitro. 4.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu đến gas volume và tỷ lệ tiêu hóa của bã mía trong điều kiện in vitro. 4.2.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu đến quá trình sinh khí của bã mía. Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn dạ cỏ trâu lên quá trình sinh khí sinh ra tại thời điểm 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ và 24 giờ (ml/gDM) của bã mía. Thời gian (giờ) NT T.L Gas gTH/gA.V Gas volume/ gDM tiêu hóa 6 12 18 24 ĐC 31,3b 29,4a 26,7a 27,9b 115,30d 0,258d 447,36a NT2 31,2b 27,2a 31,4a 32,4b 122,20c 0,293c 416,88b NT3 32,9a 30,9a 32,4a 35,6b 131,80a 0,389a 338,86d NT4 23,8b 26,2a 34,2a 41a 125,20b 0,320b 392,30c SEM 2,195 2,480 2,406 2,274 0,496 0,004 6,060 P 0,042 0,547 0,193 0,007 0,000 0,000 0,000 ĐC: nghiệm thức đối chứng không chủng dịch vi khuẩn, NT2: nghiệm thức chủng 0,5% dịch vi khuẩn dạ cỏ trâu, NT3: nghiệm thức chủng 1% dịch vi khuẩn dạ cỏ trâu, NT4: nghiệm thức chủng 2% dịch vi khuẩn dạ cỏ trâu. Các chữ a, b, c, d khác nhau trên cùng một cột là khác biệt có ý nghĩa thống kê (P[...]... 2.4 PHNG PHP SINH KH IN VITRO õy l mt dng phỏt trin ca k thut ỏnh giỏ s tiờu húa thc n in vitro l s thay i cỏch o c trong k thut, t s xỏc nh thc n khụng b tiờu húa cũn li sang vic o lng khớ sinh ra trong quỏ trỡnh tiờu húa thc n in vitro gi l k thut sinh khớ in vitro (in vitro gas production) c chun húa v xut c (Menke et al, 1979) Phng phỏp sinh khớ in vitro ra i da trờn nn tng ca in vitro Tilley... oỏn cỏc cht khỏng dng 8 In vitro sinh khớ cú th dựng xỏc nh cỏc cht khỏng d ng trong thc n v nú t ra cú ớch hn cỏc phng phỏp khỏc (Makkar, 2004) xỏc nh c mc nh hng ca cht khỏng d ng trong thc n bng in vitro sinh khớ ngi ta s b sung thờm cht bt hot ca khỏng d ng vo h thng in vitro sinh khớ v so vi s sinh khớ trng hp khụng b sung cht bt hot Makkar (2004) cho bit in vitro sinh khớ ó c ng dng nhiu trong. .. sacco (R2 = 0,83), in vitro GVS (R2 = 0,93), sinh khớ in vitro (R2 = 0,82) v in vitro VSVP R2 = 0,90) Qui trỡnh k thut in vitro 42DDC l ym khớ 0,5g mu vi 42ml DDC + 8ml dung dch m 40oC, v sau ú l x lý vi dung dch ty trung tớnh 85oC trong 12 gi Trn H Dim oan (2013) khi thc hin thớ nghim in vitro kho sỏt kh nng phi hp phõn gii bó bó mớa ca cỏc dũng vi khun d c dờ v bũ ó tỡm ra 2 dũng vi khun dờ (DD7... tiờu húa vi sinh vt d c cú th quan sỏt c trong iu kin ng nghim di s tham gia ca vi sinh vt a dng cú trong mụi trng nc bt nhõn to ca McDougall (1948) Kt qu ca s lờn men ny cú th quan sỏt t thc n cũn li sau khi tiờu húa in vitro Tilley v Terry (1963) hoc t sn phm sinh ra ca s tiờu húa phng phỏp sinh khớ in vitro ca Menke et al, (1979) Nguyờn lý hot ng ca sinh khớ in vitro cng nh phng phỏp in vitro Tilly... phm hot tiờu húa thc n ca vi sinh vt d c v phn ỏnh c kh nng tiờu húa ca mi loi thc n - Nguyờn lý sinh khớ Khi thc n c trong mụi trng in vitro, s c chuyn thnh cỏc acid bộo bay hi, khớ (CO2 v CH4) v t bo vi sinh vt trong mụi trng in vitro cú cht m bicarbonate, khi acid bộo bay hi sinh ra lp tc CO2 c gii phúng n nh pH Nh vy lng khớ sinh ra trong h thng khớ in vitro bao gm khớ sinh ra trc tip t s lờn men... 24 gi + pH + NH3 + T l tiờu húa ca bó mớa trong iu kin in vitro *Thớ nghim 3: nh hng ca nng vi khun d c trõu lờn quỏ trỡnh sinh khớ (gas volume), pH, NH3 v t l tiờu húa ca thõn lỏ cõy bp trong iu kin in vitro 20 S b trớ thớ nghim 3: nh hng ca nng vi khun d c trõu lờn quỏ trỡnh sinh khớ (gas volume), pH, NH3 v t l tiờu húa ca thõn lỏ cõy bp trong iu kin in vitro Lp Li Ln 1 Ln 2 Ln 3 Ln 4 Ln 5 NT1... l do s hin din ca nguyờn sinh ng vt khuyn khớch s hot ng ca vi khun cnh tranh vi nguyờn sinh ng vt (Wiliam v Coleman, 1992) Theo Trn C (1979) nhng loi vi sinh vt khỏc nhau sng d c cú quan h cht ch v ph thuc ln nhau S sinh trng ca mt loi vi sinh vt ny cú th ph thuc mt cỏch c bit vo s cú mt ca cỏc loi khỏc v tng s hoc t l mi loi cú th c bin i cỏc iu kin khỏc nhau Trong lỳc mt s vi sinh vt sinh trng... tiờu húa thc n in vitro (VSVP) K thut xỏc nh t l tiờu húa in vitro 42DDC cú giỏ thnh thp v bo v mụi trng so vi in vitro GSV v in vitro VSVP do tn dng c vt liu sn cú v ớt dựng húa cht K thut tiờu húa in vitro 42DDC cú th ng dng ỏnh giỏ cht lng thc n thụ, mc tiờu th thc n v mc tng khi lng ca gia sỳc nhai li K thut ny cú mi quan h tuyn tớnh gn vi k thut c lng t l tiờu húa in vivo (R2 > 0,93), in sacco (R2... et al., 2005) Trong truyn thng, s bi thi methan t gia sỳc nhai li c xỏc nh t trong iu kin thỳ sng, iu ny lm tn nhiu kinh phớ trong ỏnh giỏ Trong mt trc nghim gn õy, Getachew et al (2005) thy rng in vitro sinh khớ cú th dựng xỏc nh methan thi ra t s tiờu húa Trờn thc t ó cú mt s nghiờn cu s dng in vitro sinh khớ d oỏn methan trong quỏ trỡnh tiờu húa thc n ca vinh sinh vt d c a ra cỏc chin lc lm gim... men thc n ca vi sinh vt l ngun nng lng quan trng cung cp cho vt ch trong h thng sinh lý dinh d ng ca thỳ nhai li Nh din t trờn acid bộo bay hi v lng khớ trong h thng in vitro sinh khớ cú mi liờn h vi nhau Xut phỏt t ú, cú nhiu nghiờn cu ra i nhm tỡm mi liờn h gia acid bộo bay hi in vivo v in vitro sinh khớ d oỏn ch s ny hu hiu hn (Brown et al., 2002) Cỏc kt qu ó cho thy rt cú tim nng trong d oỏn acid