BỘYTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI • • • • LÊ THỊ THU TRANG NGHIÊN cúu XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ■ Dư LƯỢNG HOÁ CHẤT 2,4-0 TRONG Dược LIỆU ■ ■ * ■ BẰNG SÂC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸĐẠI HỌC KHÓA 2(102-2007) Người hướng dẫn Nơi thực hiện : TS. Trần Việt ÌSùng ThS. Nguyễn Tường Vy Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương Thời gian thực hiện : Từ 2/2006 đến 5/2007 HÀ NỘI, 05/2007 L Ò I CẨM Ơ N Trước ãêí em xin bày tỏ Còng biết ơn sâu sắc tới *zỵ. ‘ĩrẩn Việt ĩCùng, m s. Nguyễn Tường Vy, những người đã trực tiếp íiưâng dân, cíit sảo cho em trong quá trình nghiên cứu và thực diện Cuận văn này. (Em jỷn gửi ữfi cãân thành cảm ơn tới (Ban giám đốc Viện íịiổn nghiệm tíiuốc Trung ‘Uơng và toàn thể cán 6ộ %Ịư>a vật [ý đo Cường-Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ‘Ương ẩẫ tuôn giúp đờ và tạo ấiều íịịện cho em trong quá trìnã em thực hiện Cuận văn. mảnh con 161 26 Hình 2.7. Phổ khối (MS2) của 2,4-D nồng độ 10 ppm trong pha động, CE = 5%, mảnh mẹ 221-ỳ mảnh con 163 Như vậy có thể tóm tắt 1 số điều kiện phân tích đã xác định MS như sau: + MS chế độ SIM chọn ion m/z 219 hoặc 221 để định lượng + MS chế độ Full Scan 180 - 300 amu; MS2: m/z 219 -> 161; m/z 221 -> 163 để định tính. 2.233. Chương trình sắc ký khối phổ - Cột Betabesic 18 (50 mm X 2.1 mm, 5 |j.m) - Detector: MS (LCQ Avantage Max), kỹ thuật phun điện tử ion âm (ký hiệu -ESI) để ion hoá, bộ phân tích khối bẫy ion (QIT). - Tốc độ dòng: 0,2 mL/ph. - Pha động: Acetonitril - 0,15% acid acetic trong nước (1:1). - Thể tích bơm mẫu: 25 |nL. 27 - Thời gian phân tích 4 phút. - Điều kiện phân tích khối phổ: + MS chế độ SIM chọn ion m/z 219 hoặc 221 để định lượng. + MS chế độ Full Scan 180 - 300 amu; MS2: m/z 219 161; m/z 221 -> 163 để định tính. + File Tune: 2,4-D flow 0.2 mL.ph.LCQ Tune. Với chương trình sắc ký nêu trên, tiêm dung dịch chuẩn 2,4-D có nồng độ 0,5 ppm, sau thời gian phân tích 3 phút, sắc ký đồ - phổ khối được ghi ở hình 2.8. 0.0 0.5 1.5 1.0 2.0 Time (min) 2.5 3.0 r 218.0 218.5 219.0 nVz 219.5 3.5 220.0 Hình 2.8. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 2,4-D pha trong pha động nồng độ 0,5 ppm, tốc độ dòng 0,2 mL/phút 28 2.23.4. Đánh giá sự phù hợp của hệ thống LC-MS - Độ tuyến tính của hệ thống Để khảo sát độ tuyến tính của hệ thống, chúng tôi tiến hành tiêm 5 dung dịch chuẩn có các nồng độ 0,01ppm; 0,025ppm; 0,25ppm; 0,5ppm và 1 ppm như đã chuẩn bị ở phần 2.2.1, ghi lại diện tích. Kết quả được ghi trong bảng 2.2 và hình 2.8. - Độ lặp lại của hệ thống Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn có nồng độ 0,25 ppm và ghi diện tích píc. Kết quả được ghi ở bảng 2.2 Bảng 2. 2. Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ tuyến tính kiểm tra sự phù hợp của hệ thống Nồng độ Diện tích pic (Hg/mL, ppm) C1 0,01 349789,4 C2 0,025 539896,9 C3 0,25 1267807,58 (Trung bình 6 lần tiêm) C4 0,50 2213207,9 C5 1,0 4032018,6 Phương trình hồi quy Y = 3658094,3x + 374604,41 Hệ số tương quan r = 0,9996 Độ lặp lại (6 lẩn, RSD = 2,3 % dung dịch C3) 29 o 4500000 -1 4000000 3500000 =5 1500000 1000000 500000 y =3658094.3x + 374604.41 R2 = 0.9989 - 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 nổng độ Hình 2. 9. Tương quan hồi quy tuyến tính giữa diện tích píc và nồng độ của các dung dịch chuẩn 2,4-D (0,01-lppm) phân tích theo chương trình sắc ký LC-MS Kết quả khảo sát cho thấy có sự liên quan chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích pic của 2,4-D, hệ số tương quan r = 0,9996. Độ tuyến tính tốt trong khoảng nồng độ khá rộng từ 0,01- 1 ppm . Hệ thống sắc ký đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại, độ lệch chuẩn tương đối RSD của diện tích píc là 2,3 %. 2.2.4. Xây dựng phương pháp chiết và làm sạch 2.2.4.I. Chiết Soxhlet và làm sạch theo TCVN 6134:1996 (Áp dụng quy trình chiết 2,4-D từ mẫu đất) - Cách chiết Cân 5 g dược liệu vào túi đựng mẫu và đặt vào ống Soxhlet, chiết vói 40 mL hỗn hợp aceton-hexan (1:1) trong 3 giờ. Chuyển dịch chiết vào bình cầu, tráng bình Soxhlet bằng 5 mL X 2 lần hỗn hợp dung môi. Cất quay ở áp suất giảm và ở nhiệt độ không quá 40°c tói khi dung môi hầu như bay hơi hoàn toàn. Thêm 1 mL aceton vào cắn, lắc nhẹ và tiếp tục làm bay hơi cho tới khi dung môi được loại bỏ hầu như hoàn toàn, hoà tan cắn trong 5mL aceton. - Làm sạch: 30 Lót một ít bông thấm nước vào đáy cột sắc ký bằng thuỷ tinh đường kính trong 1,2 cm. Chuyển 5 g natri sunfat khan vào cột. Cho tiếp 5 g silicagel hoạt hóa (loại dùng cho sắc ký có kích thước hạt 0,250 mm). Cho tiếp 5g natri suníat khan. Gõ nhẹ cột để lèn chặt các chất nhồi. Đặt một ít bông thấm nước lên mặt cột. Tẩm ướt cột bằng 10 mL dung môi aceton. Chuyển dịch chiết thu dược vào cột, dùng 5 mL aceton để tráng bình và chuyển hết vào cột. Bỏ phần dung môi dư chảy qua cột. Rửa giải hoạt chất bị hấp phụ trong cột bằng 30 mL hỗn hợp dung môi metanol-aceton (1:9). Hứng dung dịch chảy qua cột vào bình cầu. Cất quay làm bay hơi dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ 40°c. Tiếp tục làm bay hơi bằng dòng khí khô. 2.2.4.2. Chiết lạnh và làm sạch bằng cột chiết pha rắn - Cách chiết Cân 2,5 g bột dược liệu vào một bình nón nút mài 100 mL, thêm 15 mL aceton, lắc kỹ và để yên 30 phút, sau đó lắc trên máy siêu âm trong 10 phút. Chuyển vào bình chứa của máy khuấy trộn siêu tốc, tráng bình nón bằng 5 mL X 2 lần aceton. Khuấy trộn trong 3 phút để làm đồng nhất. Lọc và tráng bình chứa bằng 5 mL X 2 lần aceton. Cất quay ở áp suất giảm và ở nhiệt độ không quá 40°c tới khi dung môi hầu như bay hơi hoàn toàn. Thêm 1 mL aceton vào cắn, lắc nhẹ và tiếp tục làm bay hoi cho tới khi dung môi được loại bỏ hoàn toàn. Hoà tan cắn trong 2,5 mL aceton. - Làm sạch Cột SPE (3mL; 0,5 g silicagel). Dung môi rửa giải là hỗn hợp acetonmethanol (9:1). Thêm 1 lớp Na2S04 khan dày khoảng 1 cm vào cột chiết, luyện cột bằng 2 mL hexan và 2 mL toluen. Chuyển 1 mL dịch chiết trên vào cột đã luyện. Để dịch chảy tự nhiên, sau đó tiến hành tráng, rửa cốc thêm với lmL x3 lần hỗn hợp dung môi rửa giải, chuyển lên cột. Thu hồi dịch rửa giải. Làm bay hơi dung môi dưới luồng khí nitơ tới cắn. Hòa tan cắn trong 1 mL pha động. 31 2.2.5. Phân tích mẫu 2.2.5.I. Phân tích các mẫu nhân sâm nhiễm đánh giá độ đúng của phương pháp, so sánh hai phương pháp chiết và làm sạch Tiến hành chiết các mẫu nhân sâm nhiễm có các nồng độ 0,01ppm, 0,lppm, lppm đã được chuẩn bị ở trên và làm sạch bằng SPE như đã mô tả. Kết quả phân tích bằng sắc ký lỏng khối phổ được ghi trong bảng 2.3 Bảng 2. 3. Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi ở các nồng độ khác nhau Tỷ lệ thu hồi Mẫu Chiết lạnh, Chiết Soxhlet, làm nhiễm làm sạch sach theo TCVN bằng SPE 6134:1996 0,01ppm 66,2 % (ìoppb) RSD=10,3% So sánh Test F TestT (n=3) 0,1 ppm 88,7 % 93,3 % P(test F) = P(test T) = (lOOppb) RSD=7,2 % RSD=10,6 % 0,59 > 0,05 0,27 > 0,05 (n=3) (n=3) 1 ppm 96,3 % 93,8 % P(test F) = P(test T) = (lOOOppb) RSD=6,5 % RSD= 9,9 % 0,62 > 0,05 0,36 > 0,05 (n=3) (n=3) Kết quả khảo sát cho thấy tỷ lệ thu hồi là chấp nhận đối với phân tích dư lượng ( theo EP, USP quy định là từ 70 - 110%). Kết quả so sánh phương pháp chiết và làm sạch theo quy trình chúng tôi xây dựng và áp dụng theo TCVN 6134:1996 cho thấy: 32 Hai phương pháp có độ lặp lại và tỷ lệ thu hồi khác nhau không có ý nghĩa thống kê ở mức p = 0,95. Như vậy có thể sử dụng cả 2 phương pháp chiết và làm sạch nêu trên để chiết 2,4-D từ mẫu dược liệu. 2.2.5.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Mẫu nhân sâm nhiễm 10 ppb sau khi chiết và phân tích vẫn cho đáp ứng có tỷ số S/N>10, chứng tỏ giói hạn định lượng (LOQ) < 10 ppb (hình 2.10). Giói hạn phát hiện LOD = 0,3 LOQ. Do đó giới hạn phát hiện LOD < 3ppb Ginseng spied 2,4-D 10 ppb RT: 1.58 MA. 207173 NL: 2.03E4 Hình 2.10. Mẫu nhân sâm nhiễm 10 ppb 2,4-D, tốc độ dòng 0,3 mL/phút 2.2.6. Kết quả áp dụng phương pháp phân tích dư lượng 2,4-D trong một số mẫu dược liệu Chúng tôi đã áp dụng quy trình phân tích trên (chiết lạnh bằng aceton, làm sạch mẫu bằng kỹ thuật chiết pha rắn sử dụng pha tĩnh Silica gel và phân tích định tính, định lượng 2,4-D bằng sắc ký lỏng khối phổ) để phân tích dư lượng 2,4-D trên 3 mẫu chè dây được sản xuất theo quy trình thực hành nông 33 nghiệp tốt (GAP) của Công ty Traphaco, mẫu trồng ở thị trấn Sa Pa tỉnh Lào Cai. Kết quả khảo sát cho các mẫu này đều không nhiễm chất diệt cỏ 2,4-D, đủ tiêu chuẩn sạch không có dư lượng 2,4-D để xuất khẩu sang CHLB Đức. 2.3. BÀN LUẬN 2.3.1. Về đối tượng phân tích Hiện nay, các chất diệt cỏ sử dụng trong nông nghiệp và trong trồng cây thuốc có rất nhiều loại, mặc dù 2,4-D là chất diệt cỏ kinh điển nhưng do có thời gian sử dụng tràn lan nên ảnh hưởng đến môi trường đất và nước, do đó có thể gây nhiễm cho nông sản và cây thuốc. Chính vì thế, dư lượng 2,4-D trong đối tượng môi trường, nông sản, thực phẩm vẫn được quan tâm trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Như đã biết, do quá trình quang hóa phân hủy và do sự phân giải của đất, 2,4-D phân hủy tương đối nhanh trong đất (vài ngày đến vài tuần) trừ một số vùng đất có đặc tính cơ, lý hóa yếu thì 2,4-D có thể tồn tại lâu hơn (vài tháng đến vài năm). Do 2,4-D không phải là hợp chất bền vững nên khả năng lây nhiễm cho dược liệu từ môi trường là không nhiều. Khả năng có thể dẫn đến lây nhiễm 2,4-D ở mức độ nguy cơ cao là việc sử dụng hóa chất này tràn lan thiếu kiểm soát đối với một số dược liệu trồng và thu hoạch nhanh hoặc việc sử dụng 2,4D để ngâm tẩm với mục đích kích thích sinh trưởng. Bên cạnh đó, trong xuất khẩu, nông sản từ Việt Nam nói chung và dược liệu nói riêng, vấn đề dư lượng 2,4-D là tương đối nhạy cảm và thường được quan tâm. Gần đây, nhiều thuốc diệt cỏ 2,4-D có nguồn gốc Trung Quốc vẫn được nhập về Việt Nam và được sử dụng trong trồng trọt. Chính vì thế, phân tích xác định dư lượng 2,4-D trong dược liệu là cần thiết. 34 Việc lựa chọn 2,4-D còn nhằm mục đích như khai thác và chứng minh thế mạnh của sắc ký lỏng khối phổ LC - MS khi phân tích dư lượng chất độc hại trong dược liệu ở mức độ vết 2.3.2. Về phương pháp phân tích Dư lượng HCBVTV trong dược liệu cũng như trong các sản phẩm khác đều ở dạng vết hoặc siêu vết, do vậy phải lựa chọn phương pháp phân tích phù hợp cho phân tích vết. Giai đoạn xử lý mẫu, tách chiết hợp chất cần quan tâm ra khỏi mẫu ở mức độ vết, làm sạch và làm giàu chúng là khâu rất quan trọng. 2.3.2.1. Xử lý mẫu Đối với phương pháp chiết mẫu, chúng tôi đã áp dụng kỹ thuật chiết Soxhlet theo TCVN 6134:1996 (phương pháp xác định 2,4 D trong đất) và cũng đã khảo sát kỹ thuật chiết lạnh bằng aceton. Qua khảo sát tỷ lệ thu hồi chúng tôi thấy cả hai phương pháp đều có tỷ lệ thu hồi nằm trong giới hạn cho phép. Như vậy vó thể áp dụng cả hai phương pháp này để chiết chất phân tích trong dược liệu. Kết quả so sánh giữa hai phương pháp chiết và làm sạch theo quy trình mà chúng tôi xây dựng và theo TCVN 6134:1996 (mục 2.2.5.1.) cho thấy hai phương pháp chiết và làm sạch khác nhau không có ý nghĩa thống kê về độ lặp lại và độ đúng. Tuy nhiên do điều kiện thời gian, chúng tôi chưa làm được nhiều thực nghiệm để có sự so sánh và đánh giá mang tính hệ thống và đầy đủ. So với phương pháp làm sạch theo TCVN 6134:2006, sử dụng cột SPE đã được chuẩn hoá để làm sạch và làm giàu chất phân tích đem lại nhiều ưu điểm hơn như: có thể giảm đáng kể lượng dung môi hữu cơ được sử dụng, chiết chọn lọc, thòi gian chiết nhanh, độ lặp lại tốt và có thể tự động hoá toàn bộ quá trình chiết. 35 23.2.2. Lựa chọn phương pháp phân tích Theo TCVN 6134:1996, tiêu chuẩn nhà nước phân tích dư lượng 2,4D trong đất, kỹ thuật phân tích đinh tính và định lượng sử dụng detector ƯV tại bước sóng 230 nm, phương pháp này mặc dù theo tiêu chuẩn có LOD = 10 ppb, tuy nhiên thiếu tính đặc hiệu và chọn lọc đặc biệt khi áp dụng phân tích 2,4-D trong dược liệu. Thành phần của dược liệu có rất nhiều hợp chất hữu cơ có khả năng hấp thụ u v ở bước sóng 230 nm, sẽ ảnh hưởng đến phân tích 2,4-D. So sánh một số điểm giữa phương pháp phân tích định tính và định lượng 2,4-D theo TCVN 6134 và bằng LC-MS được trình bày trong bảng 2.4. Bảng 2.4. So sánh 2 phương pháp phân tích pp phân tích theo TCVN 6134:1996 Phương pháp LC - MS/MS HPLC - detector ƯV 230 nm HPLC - MS/MS, SIM 219,221,161.163 Không đặc hiệu, không phân tích được Đặc hiệu, mang tính khẳng định, các mẫu có nền phức tạp. thực hiện được với các mẫu có nền phức tạp Cột C18, 25 cm Cột C18, 5 cm Thòi gian chạy 1 mẫu 10 phút Thời gian chạy 1 mẫu 3 phút Giới hạn phát hiện LOD 10 ppb LOD nhỏ hơn 3 ppb Không được chấp nhận ở Châu Âu, Được chấp nhận [28] Nhật, Mỹ Hiện nay, phân tích 2,4-D ngoài phương pháp như vừa nêu và phương pháp sử dụng trong nghiên cứu này, còn có kỹ thuật như sắc ký khí vói 36 detector ECD hoặc khối phổ. Để phân tích 2,4-D bằng sắc ký khí, cần thiết phải tạo dẫn xuất ester dễ bay hơi ví dụ như dẫn xuất methylester. Phương pháp này cho độ nhạy cao, quá trình tạo dẫn xuất bay hơi và lấy mẫu không gian hơi có thể loại bỏ tương đối có hiệu quả ảnh hưởng của nền mẫu. Tuy nhiên để thực hiện kỹ thuật cũng không đơn giản. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS có thể phân tích trực tiếp 2,4-D một cách có hiệu quả và khá nhanh chóng mặc dù sử dụng bất cứ phương pháp nào, đối với phân tích dư lượng thì xử lý mẫu vẫn là một vấn đề cần quan tâm nhất và thường mất thời gian và công sức. Hiện nay, Cơ quan bảo vệ môi trường EPA hay cơ quan quản lý chất lượng thực phẩm dược phẩm FDA (Mỹ) và các cơ sở phân tích hiện đại trên thế giới đều sử dụng LCMS/MS phân tích dư lượng 2,4-D trong môi trường và nông sản [22]. 2.3.3. Vê kết quả phân tích trên mẫu Do thời gian có hạn, chúng tôi mới chỉ áp dụng qui trình phân tích phân tích 3 mẫu Chè Dây xuất khẩu sang CHLB Đức. Các dược liệu này được trồng và sản xuất theo qui trình GAP. Kết quả phân tích cho thấy các dược liệu này đều không bị nhiễm 2,4-D từ đất và không có dư lượng 2,4-D. 37 PHẦN 3 KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 3.1. KẾT LUẬN - Sau một thời gian nghiên cứu, đã có cơ hội tiếp cận và hiểu thêm về phương pháp sắc ký lỏng khối phổ cũng như các bước cơ bản trong phân tích dư lượng các chất độc hại sử dụng sắc ký lỏng khối phổ. Đây là phương pháp mói hiện nay, được sử dụng để định tính và định lượng một cách khá chính xác. - Xây dựng được phương pháp phân tích 2,4-D trong dược liệu sử dụng sắc ký lỏng khối phổ. Phương pháp phân tích có độ nhạy cao (phân tích được dư lượng 2,4-D ở mức ppb), có tính đặc hiệu, phân tích đúng và chính xác đối tượng phân tích. Phương pháp phân tích đáp ứng yêu cầu tiên tiến, theo xu hướng trên thế giới và phù hợp với điều kiện ở Việt Nam. - Với mục tiêu chính là xây dựng phương pháp phân tích và do hạn chế về thời gian, chúng tôi mới chỉ áp dụng phương pháp phân tích để phân tích 3 mẫu Chè Dây xuất khẩu sang CHLB Đức. Kết quả cho thấy các mẫu này đều không không có dư lượng 2,4-D. 3.2. ĐỂ XUẤT - Do thời gian có hạn, chúng tôi mói thực hiện những khảo sát và tiến hành những thực nghiệm nghiên cứu cơ bản. Các số liệu thống kê thu được chưa nhiều, trong thời gian tới, khi áp dụng vào thực tế, đối với mỗi dược liệu cụ thể , cần thiết phải khảo sát thu thập thêm các số liệu nhằm thẩm định phương pháp và đánh giá khả năng áp dụng vào thực tế. - Khảo sát thêm về dư lượng 2,4 D trong một số mẫu dược liệu trên thị trường, qua đó có những nhận định và đánh giá khách quan về dư lượng chất này trong dược liệu. - Tiếp tục triển khai và áp dụng thiết bị sắc ký lỏng khối phổ trong phân tích dư lượng các chất độc hại trong dược liệu và thực phẩm. 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bộ môn Hóa phân tích (2004) - Hóa phân tích 2 - Trườngđạihọc Dược Hà Nội. Tr 107-123, Tr. 173-187, Tr. 326-333. 2. Bộ môn Hoá phân tích (2002) - Môi trường và độc chấtmôi trường— Trường đại học Dược Hà Nội. Tr. 156-168. 3. Bộ môn Hóa phân tích (2004) - Kiểm nghiệm thuốc - Trường đại học Dược Hà Nội. Tr. 81-88. 4. Bộ khoa học, công nghệ và Môi trường (1996), Chất lượng đất- xác định dư lượng 2,4-D trong đất, phương pháp sắc ký lỏng hiệu suất cao - TCVN 6134:1996. 5. Bộ Nông Nghiệp và Phát triển nông thôn(2004) - Danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép, hạn chế và cấm sử dụng ở Việt Nam - Nhà xuất bản Nông nghiệp. 6. Bộ Y tế (2002) - Dựơc điển Việt Nam xuất bản lần thứ ba - Nhà xuất bản Y học. PL 5.16, PL 4.3. 7. Bùi Thị Bằng(2002)- Bước đầu khảo sát một số chỉ tiêu an toàn dược liệu - Hội thảo dược liệu an toàn- nghiên cứu trồng và chế biến. 8. Bùi Sỹ Doanh (2001) - Nghiên cứu phân tích, đánh giá dư lượng thuốc trừ sâu Cypermethrin đối với rau quảy đất và nước - Luận án tiến sỹ dược học - Trường đại học Khoa học tự nhiên. 9. Chu Phạm Ngọc Sơn (2005) - HPLC/MS Advantage Max - Trung tâm Đào tạo và Phát triển sắc ký TPHCM. Tr. 15-26. 10. Nguyễn Duy Chí (2006) - ứng dụng phương pháp sắc ký để phân tích một số thuốc tân dược nhóm chống viêm phi steroid có thể trộn trái phép trong thuốc đông dược - Luận văn thạc sỹ dược học- Học viện Quân Y. 11. Phạm Luận (1999) - Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu suất cao - Bộ môn Hóa phân tích - Trường đại học Khoa học tự nhiên. 12. Phạm Văn Biên, Bùi Cách Tuyến, Nguyễn Mạnh Chinh (2002) - cẩm nang thuốc bảo vệ thực vật - Nhà xuất bản nông nghiệp. Tr. 343-345. 13. Phòng Quản lý thuốc BVTV (1999) - Báo cáo về thực trạng quản lý và sử dụng thuốc BVTV ở Việt Nam - Cục Bảo vệ thực vật. 14. Trần Quang Hùng (1999) - Thuốc bảo vệ thực vật - Nhà xuất bản nông nghiệp. 15. Trần Việt Hùng (2005)- Khảo sát và nghiên cứu phân tích dư lượng một sốhoá chất bảo vệ thực vật trong dược liệu - Luận án tiến sỹ dược học. 16. Trần Việt Hùng, Phạm Thanh Kỳ, Trinh Văn Quỳ (2003) - Một sô' kết quả nghiên cứu phân tích dư lượng đa thành phần hoá chất bảo vệ thực vật dư lượng cơ clo và pyrethoid trên dược liệu được trồng trọt và sử dụng ở Việt Nam - Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh, số 4, tr.275-281. 17. Trần Việt Hùng, Trịnh Văn Quỳ, Phạm Hoàng Việt, Phạm Thanh Kỳ (2004) - Khảo sát đánh giá tình hình sử dụng hoá chất bảo vệ thực vật trong việc trồng cây thuốc ở làng nghề truyền thống Nghĩa Trai, tình Hưng Yên - Tạp chí Dược liệu, số 5, tr. 133-137. 18. Trịnh Văn Quỳ, Phùng Hoà Bình (2005) - Một số vấn đề tiêu chuẩn hoá nâng cao chất lượng thuốc thảo dược vê độ an toàn, tạp chí Dược học, số 2/2005. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 19. George R. Waller & Otis C.Dermer (1981) - Bỉochemỉcal applications o/Mass Spectrometry. pp. 9-15. 20. FAO/WHO (1993). Codex Aliurentarius Commỉssỉon. 21. Scoot E. Van Bramer (1998), An ỉntroductỉon to Mass Spectrometry. 22. Stafforđ and Alex Khynitsky (2004) - Procedure for the dỉrect analysis of 2,4-D in water, new methods for food saýety Analysis, U.S.EPA. 23. The European Pharmacopoeia (1997). 24. The United States Pharmacopoeia 26 (2003). 25. WHO(1993). 2,4- Diclorophenoxyacetic acỉd (2,4-D). pp.11-25 26. Winefordner J.D. Chemical analysỉSyVolume 17 “Solid-phase Extractìon, prìncỉple and practice”, A.Willey-intemscience publication, John Willey & Son, Inc. pp. 180-186 27. Wikipedia, Hỉstorical use of 2,4-D Website found at: http://en.mkipedia.org/wiki/Herbicide. 28. Pesticide In/ormation Proỷiles Website found at: http://www.extoxnet.orst.edu/ghindex.htm. 29.2,4-D, toxỉcỉty, ecologicial toxictíy and reguỉatory ỉnformation Website found at: http://www.pesticideinfor.org/Detail-chemical.jsp. 30. PAN Pesticides Database Website found at: http://www.pesticidieinfo.org PHỤ LỤC Phụ lục 1. Một số hình ảnh minh họa quá trình lựa chọn các điều kiện khối phổ trên hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Thermo-Finnigan Avantage Max cxs---;v ¥ìew Contrd SoanMode Dí?play Setup D4agr»5tlc5 t-kslp L© B QEB 1i ẳ ® I© ụ A| u m '*°Q ỉ Ũ]BI AI ịurer 1 ĩa S ỉ 11 Value ị_3 ESi Souce Epray Vdtags (kVi 45Ê Sprạịi CuiTêíTt (à&t 11.6? Shsih Sas Fk>w Raíe 1368 Aux/Sweep c «t Row Rate: -0 2? Câpìíiaiy RTD OK. Ves CapilỉatyVcìíage M •30 74 24SA0 Capi9a^Tenfip[*Cl ĩiib e is re í^ s p t -3B00 Vacuum Vacuun DK lon Giiv»je Pressure CK: lon Gauặs: lon Gaupe (:.. Peak lound d m/ỉ:213.793980 AcMhnQCỉpbly Volaoe Píe-vcus Sellr*3" -ĩl.CŨŨCCa Nsw Setùng - 40 miw Attusting Tii» Lens 0ffse* Prẹviou?SeMng - -350)0000. New Setóng - .30 aooooo Aíttsìing £«cond Qctapole ŨỄẾsữt PrevioãSẹti™- 7oòoooo NessSe*«s - &SDD000 4-dMire rirst Qrtapoleotiỉit — r íìe!mtoan>iiic ardMtrtưiiTiinriu ỉ c»tt* ì Míitpote ì QteatM TÌ&2 Gíte* m 5ÌẽRFAmp[Vp-p, ípt ? ĩtapDC-OflịetrW iapDCO»*ei(Vj um Jỉ V,- - ịi Blnrtrunent Ccrsote I X -] 754 400-'30 mse 10.13 9/12/2006 20:£ ỉnsìj\jTìữTi . Ịị ^ C j\u ^ ^ Ịjtv fc W ị£jũĩ'?mi Hình PL3. Cửa sổ LCQ Tune, chạy chức năng Tune plus để điều chỉnh các thông số khối phổ cho mảnh 219 được nhạy nhất. BfflOBS8BSSDEEESBI^ma»4 Fte VMM centrol ScsnMo* Otíửdy Setuc Uếgrasae Hefe A jJ J « | Oc*S U e l Hình PL 4. Sau khi đã chạy tính năng Tune plus, 2 mảnh có m/z = 219 (tương ứng v ớ i clo 35,5) và mảnh m/z = 221 (tương ứng với đồng vị clo 37,5). r---. ! Sett*) Ckaqnostes f UilÉBBi n 1•**1Ị|Ịịấ 4 u A) u «1 Oc*g I J s | Hình PL5. Với nãng lượng ion hóa va chạm CE = 40 V, 2 mảnh mẹ chuyển toàn bộ thành 2 mảnh con có m/z =161 (tương ứng với clo 35,5) và mảnh m/z = 163 (tương ứng với đồng vị clo 37,5). Aiuat.■•*>...iga gặ44Mjĩagijĩg!áI£s£LJJii BpavVoirtgoíkVt S^a t&ẳal vóiiage f/i 4.55 làn 1 ilĩSs 1 HL s r.ow«iiwÒ*>g»[...]... rây 2.1.1.3 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là d lượng 2,4- D trong d c liệu Do 2,4- D là chất diệt cỏ nên chúng tôi chọn d c liệu là bộ phận d i mặt đất như rễ, thân rê Để xây d ng phương pháp, chúng tôi sử d ng mẫu Nhân Sâm Hàn Quốc sạch Mẫu này không có 2,4- D và được cung cấp bởi khoa kiểm nghiệm Đông d c Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 2.1.2.1 Xử lý mẫu... mẫu d c liệu sạch bằng phương pháp thêm chuẩn Chiết và làm sạch mẫu nhiễm theo phương pháp đã nêu trên, phân tích sắc ký và xác định hiệu suất thu hồi Tiêu chuẩn đánh giá phương pháp chiết: Áp d ng tiêu chuẩn ghi trong d c điển Mỹ hoặc d c điển Châu Âu, phương pháp chiết được chấp nhận nếu 70% < %R < 110% 2.1.2.2 Định tính và định lượng 2,4- D chiết ra từ mẫu d c liệu sử d ng sắc ký lỏng khối phổ. .. khối phổ a Khảo sát xây d ng chương trình sắc ký Sử d ng dung d ch chuẩn 2,4- D ìoppm trong pha động tiêm vào hệ thống HPLC với detector PDA, để khảo sát xây d ng chương trình sắc ký (pha động, tốc độ d ng ) b Xây d ng chương trình sắc ký khối phổ phân tích 2,4- D - Chương trình sắc ký: pha động, tốc độ d ng đã được khảo sát ở trên - Khảo sát điều kiện khối phổ: + Kỹ thuật MSI lần, phân tích toàn thang... (LC-MS) [22] Phương pháp phân tích 2,4- D trong thực phẩm theo cơ quan quản lý thực phẩm, d c phẩm (FDA) của Mỹ cũng tương tự Ngoài ra, người ta còn tạo d n xuất methyl ester của 2,4- D dễ bay hơi, phân tích bằng sắc ký khí với detector MS hoặc ECD 8 sử đụng sắc ký khí [25] 2,4- D là một acid hữu cơ, khá phân cực, ít bay hơi tuy nhiên có thể làm bay hoi nhờ d n xuất hoá Để phân tích 2,4- D bằng sắc ký khí,... độ nhạy cao 1.3 TỔNG QUAN VỂ SẮC KÝ LỎNG KHỔl PHỔ 1.3.1 Vài nét sơ lược về sắc ký lỏng khối phổ [10] Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) là sự kết nối giữa sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và detector khối phổ (MS) Trong kỹ thuật LC-MS, hỗn hợp các chất trong pha động sau khi được tách khi qua cột sắc ký sẽ được phát hiện bằng detector khối phổ Sự kết nối sắc ký khí (GC) và khối phổ (MS) đầu tiên được thực... thường d ng nhất là tạo d n xuất ester (ví d tạo methylester bằng phản ứng với BF3-methanol, diazomethal hoặc với hỗn hợp acid sulfurid-methanol) Sau đó thực hiện kỹ thuật lấy mẫu không gian hoi (head space) Để phân tích, sử d ng sắc ký khí mao quản với detector ECD (do 2,4- D có 2 nguyên tử clo trong phân tử, do đó ECD rất nhạy vói 2,4- D) hoặc khối phổ Sử d ng sắc ký lỏng [4] Theo TCVN 6134 : 2006, phương. .. XÉT 2.2.1 Chuẩn bị mẫu - Mẫu chuẩn: + Dung d ch chuẩn 2,4- D lOppm trong pha động d ng để khảo sát phổ khối của 2,4- D + D y các dung d ch chuẩn 2,4- D có nồng độ: 0,lppm, 0,5ppm, lppm, 5ppm, lOppm trong pha động để khảo sát xây d ng chương trình sắc ký sử d ng HPLC với detector PDA + D y các dung d ch chuẩn 2,4- D có nồng độ: 0,01ppm, 0,025ppm, 0,25ppm, 0,5ppm, lppm trong pha động để khảo sát độ lặp lại... TCVN 6134 : 2006, phương pháp định lượng 2,4- D trong đất, được xây d ng từ năm 1996, để định tính và định lượng 2,4- D, sử d ng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo với detector u v ở 230 nm Nhược điểm của phương pháp là có độ đặc hiệu và độ nhạy thấp Hiện nay trên thế giới, chủ yếu sử d ng LC-MS để phân tích d lượng 2,4- D trong các đối tượng môi trường, nông sản và thực phẩm Phương pháp này có tính đặc hiệu... giữa diện tích píc và nồng độ của các dung d ch chuẩn 2,4- D (0,5-10ppm) phân tích theo chương trình sắc ký sử d ng detector PDA 22 Kết quả trong bảng 2.1 và hình 2.3 cho thấy có sự tương quan chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích pic của 2,4- D với hệ số tương quan r = 0,9998 Hệ thống đảm bảo độ lặp lại với độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic, RSD = 1,7% 2.2.3 Xây d ng chương trình sắc ký lỏng khối phổ. .. Khảo sát xây d ng chương trình sắc ký Trước khi tiến hành xây d ng chương trình sắc ký khối phổ, chúng tôi tiến hành khảo sát chương trình sắc ký sử d ng detector PDA đối với mẫu chuẩn 2.2.2.1 Khảo sát điều kiệtt sắc ký Sử d ng các dung d ch chuẩn, qua các quá trình thực nghiệm, chúng tôi xác định được điều kiện sắc ký như sau: + Cột sắc ký sử d ng: Cột BetaBasic C18 (5 cm X 2,1 mm ; 5 um) 20 + Detector: ... (head space) phõn tớch, s dng sc ký khớ mao qun vi detector ECD (do 2,4- D cú nguyờn t clo phõn t, ú ECD rt nhy vúi 2,4- D) hoc ph S dng sc ký lng [4] Theo TCVN 6134 : 2006, phng phỏp nh lng 2,4- D. .. dng dung dch chun 2,4- D ỡoppm pha ng tiờm vo h thng HPLC vi detector PDA, kho sỏt xõy dng chng trỡnh sc ký (pha ng, tc d ng ) b Xõy dng chng trỡnh sc ký ph phõn tớch 2,4- D - Chng trỡnh sc ký: ... nghiờn cu l d lng 2,4- D dc liu Do 2,4- D l cht dit c nờn chỳng tụi chn dc liu l b phn di mt t nh r, thõn rờ xõy dng phng phỏp, chỳng tụi s dng mu Nhõn Sõm Hn Quc sch Mu ny khụng cú 2,4- D v c cung