i •■:■■;- : '■' :■■■ ■■ ;.■■: ■ ®MlMMSẩềÉẼ-ằỆMềếỂỂỆẾÊếế. 'ÂMMỆẩỀìÊlễêẩềềÊềiãấẵễĩỂẵMâ1- & M '1 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI % J>A # Ị%rỊ%*Ị% rj%rỊ* rỊ% LÊ XUÂN HOÀN n PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MEN SINH TỔNG HỢP p - CAROTENE (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 1998-2003) Giáo viên hướng dẫn Nơi thực hiện Thời gian : TS. Vũ Nguyên Thành GVC. Nguyễn Lệ Phi I : Viện Công nghiệp thực phẩm 24/2 - 24/5/03 OA /7; / o / 3 .M ^ ỵ y s ỵ iỈỊđ ìc i Hà Nội - 6/2003 — illmmMÊtgmmmm■— tỉ2(d iw * m x (m«Bsssar ' 16 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với: TS. Vũ Nguyên Thành GVC. Nguyễn Lệ Phi Là những thầy cô đã tận tình chỉ bảo, trực tiếp hướng dẫn tôi làm khoá luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ kỹ thuật viên bộ môn Vi sinh - Viện Công nghiệp Thực phẩm, bộ môn Vi sinh - Trường Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi cũng xin cảm ơn PGS.TS. Trần Tử An, DS. Lê Hồng Dũng người đã có những đóng góp quý báu cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài này. Tôi xin cảm ơn tất cả người thân, bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, tháng 5 năm 2003 Sinh viên Lê Xuân Hoành MỤC LỤC Đặt vấn đ ề..........................................................................................................1 Phần I: Tổng quan........................................................................................... 2 1. Khái quát về Carotenoid............................................................................... 2 1.1. Khái niệm................................................:................................................ 2 1.2. Cấu trúc....................................................................................................... 2 1.3. Trạng thái tự nhiên, tính chất lý hoá........................................................... 5 1.4. Tác dụng sinh học....................................................................................... 5 1.5. Tầm quan trọng........................................................................................... 8 2. Đại cương vê nấm men................................................................................. 9 2.1. Khái niệm....................................................................................................9 2.2. Dinh dưỡng và các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng của nấm men..... 9 2.3. Sinh sản của nấm men............................................................................... 10 2.4. Úng dụng của nấm men............................................................................. 10 3. Sinh tổng hợp ị3- carotene.............................................................................11 Phần II: Thực nghiệm và kết quả................................................................. 14 2.1. Nguyên vật liệu, thiết b ị......................... ................................................. 14 2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 15 2.2.1. Phân lập nấm men từ lá cây.................................................................... 15 2.2.2. Tuyển chọn sơ bộ nấm men cho màu đậm nhất..................................... 16 2.2.3. Tuyển chọn nấm men tổng hợp tốt Carotenoid trên các môi trường có nguồn Nitơ, Cacbon khác nhau........................................................................ 16 2.2.4. Xác định thành phần Carotenoid............................................................17 2.3. Tiến hành và kết quả................................................................................ 18 2.3.1. Phân lập và thuần khiết.......................................................................... 18 2.3.2. Sơ bộ tuyển chọn nấm men tổng hợp nhiều Carotenoid........................ 19 2.3.3. Xác định sự ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng Nitơ.............................. 19 2.3.4. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng Cacbon............................................22 2.3.5. Tách chiết Carotenoid từ nấm m en...... i................................................ 24 2.3.6. Định lượng Carotenoid toàn phần bằng đo độ hấp thụ UV-VIS........ 25 2.3.7. Xác định thành phần Carotenoid và p - Carotene bằng HPLC..............26 Phần n i: Kết luận và đề xuất.......................................................................33 3.1. Kết luận.................................................................................................... 33 3.2. Đề xuất......................................................................................................33 Phụ lục........................................................... ................................................. 34 Tài liệu tham khảo....................................... ................................................. 36 ĐẬT VẤN ĐỀ p - carotene, một dạng thực phẩm thuốc với vai trò là tiền vitamin A cung cấp khoảng 80% nhu cầu vitamin A của con người. Tuy nhiên quá trình chế biến của người dân đã làm mất đi một lượng lớn họfp chất này ưong thức ăn. Vi thế bệnh thiếu vitamin A vẫn còn rất phổ biến ở Việt Nam mặc dù chúng ta đã có chương trình quốc gia phòng chống thiếu Vitamin A được triển khai rộng rãi vài năm gần đây [ 12]. Mặt khác cùng với Vitamin E, Vitamin c và Selen hữu cơ, [3 - Carotene còn được chứng minh là chất chống oxy hoá (antioxidant) quan trọng và đang được sử dụng rộng rãi trong y học hiện đại để điều trị các bệnh về lão hoá, tim mạch, suy giảm miễn dịch, ung thư...Tuy nhiên, việc sản xuất các chế phẩm chứa hợp chất này thay thế thuốc nhập ngoại ở Việt Nam vẫn còn nhiều khó khăn. Đe góp phần tìm kiếm nguồn cung cấp p - Carotene mới, đáp ứng một phần nhu cầu nguyên liệu trong các lĩnh vực công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và dinh dưỡng, chúng tôi tiến hành đề tài: “Phân lập và tuyển chọn nấm men sinh tổng hợp p - Carotene” với các mục tiêu: • Phân lập nấm men sinh Carotenoid • Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng tới sinh tổng hợp Carotenoid • Thiết lập quy trình tách chiết Carotenoid từ nấm men • Xác định các thành phần Carotenoid và Ị3 - Carotene 1 PHẦN I . TỎNG QUAN 1. Khái quát về Carotenoid: 1.1. Khái niệm: Carotenoid là hợp nhất màu lớn nhất, quan trọng và phân bố rộng trong tự nhiên. Nó chứa nhiều trong rau, củ, quả và tạo màu vàng, da cam, đỏ cho các loại thực phẩm này. Độ đậm màu của thực phẩm phụ thuộc loại carotenoid chứa trong đó. Mặc dù có mặt trong lá cây nhưng màu của chất diệp lục đã che khuất phần lớn màu của carotenoid. Carotenoid được tìm thấy ở tảo (Dunaniella) , vi khuẩn (Agrobacterium), nấm mốc (Blakeslea trispora), và đặc biêt có nhiều ở một số loại nấm men (Rhodoturola, Phaffia) 1.2. Cấu trúc của Carotenoỉd Cấu trúc cơ bản của các Carotenoid là một mạch thẳng, gồm 40 cacbon được cấu thành từ 8 đon vị isoprenoid chứa 5-cacbon liên kết nhau, đối xứng qua trung tâm. Điểm nổi bật và đặc biệt trong cấu trúc là hệ thống nối đôi liên hợp, xen kẽ nối đơn, nối đôi tạo chuỗi polyen. Chính cấu trúc này đã tạo nên các đặc tính quan trọng như: dễ bị oxi hoá , đồng phân hoá, hấp thụ ánh sáng (đặc biệt là ánh sáng tử ngoại) và thể hiện màu của hợp chất ( màu càng đậm khi hệ thống dây nối đôi càng dài). [14] Khung cấu trúc cơ bản: Cấu trúc cơ bản này có thể biến đổi theo các cách: Cộng hợp H2 hoặc dehydro hóa, hydroxyl hoá, cacboxyl hoá, di chuyển nối đôi, đóng vòng, cắt thành nhiều chuỗi nhỏ...Tạo nên một lượng lớn các cấu trúc khác nhau. Kết 2 quả là có khoảng 600 hợp chất khác nhau, đã được tách chiết và xác định đặc tính. Một số cấu trúc chính được trình bày dưới đây [8,14]: Phytofluene ^-Carotene Lycopene Zeaxanthin Trong nhóm này a, Y, P-carotene và Cryptoxanthin là những tiền chất Vitamin A quan trọng, cho cơ thể người và động vật. Một phân tử Y, acarotene và Cryptoxanthin khi vào cơ thể động vật thuỷ phân cho một phân tử Vitamin A, |3-carotene thuỷ phân cho hai phân tử Vitamin A. Chính vì vậy ị3-carotene được đánh giá là chất có hoạt tính sinh học mạnh và quan trọng nhất của carotenoid. 4 1.3. Trạng thái tự nhiên, tính chất lý hóa Trang thải tư nhierv. trong thực vật, động vật P-Carotene có thể ở dạng tinh thể, chất rắn vô định hình, tan trong dung môi dầu béo thành dung dịch, phân tán keo hoặc tạo phức với Protein trong môi trường nước. Tính chất vật lý : ị3-carotene tạo tinh thể hình kim, màu nâu đỏ tan trong dầu và các dung môi hữu cơ như aceton, alcohol, ethyl-ether, tetrahydroíuran, dầu ether và hexan, không tan trong nước[14 ]. Nhờ có hệ thống dây nối đôi liên hợp dài mà p-carotene có ái lực mạnh với oxy đơn bội (' 0 2 ), dễ bị oxy hoá, đồng phân hoá trong điều kiện tiếp xúc với không khí, ánh sáng, nhiệt độ. Tính chất của Carotenoid được khái quát trong sơ đồ 1.4. Tác dụng sinh học Các Carotenoid tự nhiên trong cơ thể sinh vật do chúng tự tổng họp nhằm mục đích bảo vệ, chống lại các tác động bất lợi của nội môi, ngoại môi. Nội môi có thể là các gốc tự do, ngoại môi như là tia tử ngoại của ánh sáng mặt trời. 5 Một số Carotenoid là tiền Vitamin A ở động vật có vú, chúng giữ chức năng sinh học quan trọng trong quá trình phát triển cá thể như : phát triển thính giác, vị giác, tăng đáp ứng miễn dịch, tăng sự sinh sản và tạo tinh trùng. Tác động chủ yếu của carotenoid không chỉ là chống oxy hoá mà còn trao đổi thông tin từ tế bào đến tế bào, tác động tới cấu trúc và chức năng của màng tế bào, tăng cường sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể. Vì vậy mà carotenoid được xác định là chất điều hoà dinh dưỡng [14]. Đặc biệt P-carotene không độc với cơ thể khi sử dụng liều cao và kéo dài. Ngược lại dùng vitamin A liều cao và kéo dài sẽ gây rối loạn thị giác, rối loạn chức năng gan. Nguyên nhân là do cơ thể có khả năng chuyển hoá 1/6 lượng ị3-carotene thành vitamin A khi có nhu cầu. [7] 2 Vitamin A Theo một số tài liệu gần đây thì căn nguyên của các bệnh ung thư, tim mạch, sự thoái hoá, lão hóa là do các gốc tự do được sinh ra theo những cơ chế khác nhau trong cơ thể. Các gốc tự do này được giải phóng trong quá trình chuyển hoá, tích tụ và tấn công liên tục vào vật chất di truyền (ADN, ARN), màng tế bào, các tế bào miễn dịch làm phát sinh bệnh và lão hóa. Cơ chế chống oxy hoả : [11,8,1]. 6 Trong cơ thể, carotenoid nói chung và Ị3 -carotene nói riêng có khả năng chống lại các gốc tự do, dập tắt chuỗi phản ứng dây truyền. Nhờ có hệ thống dây nối đôi liên hợp, nó vô hiệu hóa các phân tử oxy bị kích hoạt(1Ơ2). Một phân tử ị3-carotene có thể hấp thụ năng lượng của hàng ngàn phân tử ' 0 2 rất nguy hiểm rồi giải phóng năng lượng ấy dưới dạng nhiệt vô hại. Người ta gọi đó là cơ chế giải tỏa năng lượng. !Ơ2 + p - carotene —» p - carotene* +3Ơ2 (3 - carotene* —» |3 - carotene + nhiệt vô hại Năm 1994, Mayne và cộng sự đã khảo sát trên 413 đối tượng cả nam và nữ không hút thuốc nhận thấy ăn nhiều rau quả chứa P-carotene và vitamin E đã có tác dụng phối họp làm giảm nguy cơ ung thư phổi cho cả nam và nữ. Bendich và cộng sự đã nghiên cứu trên người và động vật thử nghiệm nhận thấy p-carotene và carotenoid đều có khả năng làm tăng đáp ứng miễn dịch. Khi sử dụng liều cao P-carotene trên bệnh nhân nhiễm HIV đã làm tăng tỉ lệ tế bào CD4 : CD8, tác động kìm hãm sự phát triển của virus. [19] Tác dụng sinh học của P-carotene được tóm tắt theo sơ đồ 7 1.5. Tầm quan trọng Nhu cầu hàng ngày về vitamin A đối với người lớn khoảng 1 - 2,5 mg và ị3carotene là 2 - 5 mg. Nhu cầu với trẻ em còn cao hơn do khả năng nhạy cảm với việc thiếu vitamin A cao hon người lớn . Sự thiếu hụt Vitamin A sẽ dẫn đến những hậu quả nghiêm trọng tới sức khoẻ của con người.[ 1,8]. Đối với con người vitamin A được cung cấp từ hai nguồn chính là từ các sản phẩm động vật như: gan, cá, thịt, sữa và các sản phẩm từ sữa. Những nguồn này thường cung cấp trực tiếp vitamin A cho cơ thể. Tuy vậy những sản phẩm này có hạn chế là giá thành cao. Khoảng 60% Vitamin A trong thức ăn được cung cấp dưới dạng tiền vitamin A trong thực vật. Ở các nước đang phát triển, tỷ lệ này là 82% với lý do dễ kiếm sẵn có quanh năm và giá rẻ [14]. Áp lực công việc cùng YỚi vấn đề ô nhiễm môi trường ngày càng xuất hiện thêm nhiều bệnh nan y như ung thư, bệnh tim mạch, thoái hoá làm tăng nhu cầu sử dụng |3-carotene ở dạng dược chất tinh khiết. Tại Việt Nam mới chỉ có chế phẩm Vinaga làm từ dầu gấc chứa ị3-carotene song chưa được mọi người sử dụng rộng rãi. Chế phẩm Belaf, Cigelton của Hàn Quốc chứa 30 mg Ị3carotene và một số thành phần chống oxy hoá khác đang được ưa dùng hiện nay ừong chống lão hoá, nâng cao sức đề kháng... Điều này đòi hỏi ngành dược nước ta cần có sự quan tâm hon nữa để nghiên cứu và sản xuất được những sản phẩm đáp ứng nhu cầu của người dân ngoài chế phẩm Vinaga. [7]. Trên thị trường quốc tế hiện nay có khoảng 25 biệt dược chứa ị3-carotene [16] chuyên luận P-carotene mới chỉ có trong ƯSP24-2000, UP 97, BP98. 8 Dược điển Việt Nam III -2002 chưa đề cập tới hợp chất này ở dạng tinh khiết, mới chỉ có chuyên luận về dầu gấc có chứa p-carotene.[23,15] II -Đại cương về nấm men 2.1- khái niệm Nấm men là tên chung chỉ nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, sinh sản chủ yếu bằng cách nảy chồi, một số theo kiểu phân cắt và bào tử bắn. Chúng có dạng hình cầu, hình bầu dục, hình elip, hình quả dưa, hình chóp, kích thước tế bào khoảng 2 - 15|um [6]. Nấm men thuộc giới Eucaryota, trong đó thành tế bào có chứa mannan, glucan giúp nấm men chống chịu tốt với điều kiện ngoại cảnh. Nhìn chung nấm men thích nghi với môi trường có lượng đường cao và phân bố rộng rãi trong tự nhiên như ở lá cây, đất 2.2 - Dinh dưỡng và các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng của nấm men Nấm men thuộc nhóm vi sinh vật dị dường, rất dễ phát triển trong môi trường nuôi cấy mà không có đòi hỏi khắt khe về dinh dưỡng như vi khuẩn. Nguồn dinh dưỡng cacbon chủ yếu của nấm men là c ác loại hydratcacbon (monosaccarit, oligosaccarit, polysaccarit), các dẫn xuất hydratcacbon, các loại rượu, acid hữu cơ, acid amin, protein, lipid....[3; 4] Nguồn dinh dưỡng nitơ bao gồm cả nguồn nitơ vô cơ và nitơ hữu cơ như muối amoni, muối nitrat, urê...Vì thế thành phần môi trường nuôi cấy cần có đủ thức ăn cacbon, nitơ, các chất khoáng, vi lượng và các chất sinh trưởng. Trong quá trình sống tế bào nấm men tiến hành trao đổi chất không ngừng với môi trường xung quanh. Tuy có kích thước nhỏ nhưng vì hấp thụ các chất dinh dưỡng và thải các sản phẩm trao đổi chất qua toàn bộ bề mặt theo cơ chế khuyếch tán, thẩm thấu, hấp phụ cho nên cường độ trao đổi chất là rất lớn [2 ]. 9 Các yếu tố như nhiệt độ, độ pH nguồn oxy của môi trường cũng ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình phát triển của nấm men. Điều này sẽ gây ảnh hưởng tới quá trình tăng sinh khối cũng như các sản phẩm được tạo ra từ quá trình trao đổi chất [3,6]. 2.3. Sinh sản của nấm men Nảy chồi : là hình thức sinh sản đơn giản và phổ biến nhất của nấm men. Te bào mẹ nảy sinh ra một chồi nhỏ rồi lớn dần lên sau đó tách ra , đôi khi tế bào con có thể vẫn dính trên tế bào mẹ và lại tiếp tục nảy chồi làm cho nấm men có dạng cây xương rồng [6]. Phân c ắ t: là hình thức sinh sản của Schizosaccharrromyces. Te bào mẹ dài ra ở hai đầu, ở giữa hình thành vách ngăn chia tế bào ra làm hai phần tương đương nhau mỗi tế bào có một nhân. Bào tử bắn thường gặp ở chi Sporobolomyces, Bullera, Aessosporon. Bào tử bắn là loại bào tử sau khi được hình thành nhờ năng lượng của té bào bắn mạnh về phía đối diện. Loại bào tử này có hình thận sinh ra trên một cuống nhỏ mọc ở các tế bào dinh dưỡng hình trứng. Sinh sản hữu tính: do hai tế bào nấm men kết hợp với nhau hình thành họp tử. Hợp tử phân chia thành các tế bào nằm trong nang, nang chín được phát tán ra ngoài. Nếu hai tế bào nấm men có hình thái, kích thước giống nhau tiếp hợp với nhau được gọi là tiếp hợp đẳng giao, nếu hai tế bào có hinh thái, kích thước khác nhau được gọi là tiếp họp dị giao. [ 10] 2.4. ứng dụng của nấm men 2.4.1Những ứng dụng chung Đã từ lâu, con người đã biết sử dụng nấm men và các sản phẩm của nó trong công nghiệp thực phẩm..Điển hình là Saccharromyces cerevisiae được sử dụng trong việc sản xuất bánh mỳ, bia, rượu, chế glycerol hoặc men 10 invertaza. S.fragilis do khả năng lên men lactose nên đóng vai trò quan trọng trong công việc sản xuất sữa và các sản phẩm từ sữa [9]. Sử dụng nấm men sản xuất các acid amin (đặc biệt là các acid amin không thay thế), protein, các vitamin ngày càng có ý nghĩa. Hiện nay đã có “Nấm men thực phẩm ” được sử dụng làm chất dinh dưỡng cho con người, (đã được dùng nhiều trong các chiến dịch chống đói ở Ấn Độ, Angieri) Ngoài ra nấm men còn được sử dụng nhiều trong chăn nuôi, sử dụng các phụ phẩm của các ngành công nghiệp khác (rỉ đường, dịch thuỷ phân gỗ, parafin ....) để làm chất dinh dưỡng cho vật nuôi, tăng ữọng và nâng cao chất lượng thịt [6]. 2.4.2 Những ứng dụng trong lĩnh vực Y- Dược Rất nhiều loại nấm men có khả năng siêu tổng họp ngoại bào tức là sản sinh ra một lượng enzym ngoại bào vượt xa so với nhu cầu sử dụng trong trao đổi chất của chúng. Chính vì vậy những loài này là đối tượng của công nghiệp sản xuất các chế phẩm enzym như: Amylase, glucoamylase, lipase : dùng làm thuốc hỗ trợ tiêu hoá [3] Nhiều nước trên thế giới đã và đang sử dụng các chế phẩm đông khô của nấm men Saccharomyces boulardi như Bioflor, Ultra - Levue để điều trị một số trường hợp.[6] - ỉa chảy nhiễm trùng cấp tính do vi khuẩn, vi rút, nấm - Điều trị và dự phòng ỉa chảy do sử dụng kháng sinh - Điều trị hội chứng kích thích ruột (thường gọi là viêm đại tràng cơ năng). ^ 3. Sinh tổng hợp p-carotene |3-carotene có thể được tổng hợp từ nhiều nguồn khác nhau như: Thực vật, tảo, vi khuẩn, nấm mốc, nấm men trong đó nguồn sinh tổng họp Ị3-carotene được nghiên cứu nhiều nhất là từ nấm mốc và nấm men. Bởi những ưu việt 11 trong công nghệ vi sinh. Nấm mốc, điển hình là Blakeslea tripora hiệu quả, khả năng tổng hợp (3-carotene cao nhưng điều kiện nuôi cấy, tách chiết phức tạp nên ng ười ta chú ý tới nấm men nhiều hơn do có những ưu điểm như: cấu tạo đơn bào, ổn định và rất dễ phát triển trên các môi trường nuôi cấy. Trên thế giới nhiều nghiên cứu về nấm men sinh tổng hợp các hợp carrotcarotennoid đã được ứng dụng vào sản xuất, tạo nguồn nguyên liệu cho thực phẩm và sản xuất thuốc. Một số nấm men thuộc chi Rhodotorula Phaffia, đã được công bố như ở bảng 1 [18, 23, 22] Bảng 1. Các chủng nấm men sinh tổng hợp ị3-carotene đã được công bố Tổng lượng Carotenoid |xg/ g sinh khối khô 40 100 70 25 75 100 120 10 Chủng Rhodotorula araucariae CBS 6031 Rhodotorula aurantiaca CBS 317 Rhodotorula glutỉnỉs CBS20 Rhodotorula bacarum CBS 6526 Rhodotorula lactoza CBS 5826 Rhodotorula mucilaginosa CBS 17 Phaffia rhodozyma CBS 6938 Rhodotorular bogorỉensis CBS 4101 Lượng ị3-carotene jug/ g sinh khối khô 30 55 55 15 55 75 20 5 Cũng như các hợp chất Vitamin, kháng sinh, Carotenoid trong tế bào nấm men là các sản phẩm chuyển hoá bậc II, đựoc tổng hợp dưới tác dụng của các enzym trong cơ thể, thường lượng không lớn bằng các sản phẩm chuyển hoá bậc I và chỉ một số loài có khả năng tổng hợp để phục vụ nhu cầu của chúng. Các chủng phân lập ban đầu thường cho hiệu quả sinh tổng hợp, thành phần P-carotene thấp. Vì thế để tăng hiệu suất sinh tổng họp, hàng loạt các nghiên 12 cứu về sự ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy như: nguồn dinh dưỡng Nitơ, Cacbon, các nguyên tố khoáng, vi lượng, pH, nhiệt độ nhằm tối ưu hóa các điều kiện sinh tổng họp của nấm men trong sản xuất đã được nghiên cứu [21;22]. Việc lai ghép, chuyển gen sinh tổng họp Carotenoid cũng đã được thực hiện trên Candida utỉlis, tăng hiệu suất sinh tổng họp và thu được loại Carotenoid có tác dụng sinh học cao như lycopene, ị3-carotene, Astaxanthin. Đặc biệt sử dụng kỹ thuật gây đột biến đã tạo ra chủng đột biến có hiệu suất sinh tổng hợp ị3-carotene gấp 200 lần chủng ban đầu và chiếm 80% tổng số Carotenoid. Dưới đây là sơ đồ quá trình tổng hợp carotenoid ở nấm men Rhodotorula glutinis CBS20 [21]. Phytofluen 1: P-carotene synthase 2: Torulene synthase 3: - - -Hỗn - - - -hơp T r- các enzym oxy hoa ^ ; ^; Lycopene ỳ Ỵ-Carotene _Ậ (3-Carotene 2\ị/ Torulene * 'l' Torularhodin Hinh 1: Sơ đồ qúa trình chuyển hoá các Carotenid ở Rhodotoruỉa glutỉnỉs CBS20 13 PHẦN 2: THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị. 2.1.1. Nguyên liệu, hoá chất. - Amonium sulfat (Trung Quốc) - Ethyl acetat (Trung Quốc) - Methanol (Đức) - Kali nitrat (Việt Nam) - Acetonitril (Đức) - Glucose (Việt Nam) - n-Hexan (Trung Quốc) - Diclometan (Đức) -Các loại lá cây lấy ở vườn thực vật Đại học Dược, thị trấn Quốc Oai, thị trấn Gia Lâm 2.1.2. Máy móc- thiết bị: - Box cấy Bioblockscientific (Pháp) - Nồi hấp áp lực Himayamatoko (Nhật) - Máy lắc ống nghiệm IKA * KS 130 basic (Nhật) - Máy lắc bình tam giác Lab-Line (Mỹ) - Máy li tâm. Universal 16 (Hettich) - Lò vi sóng. LG (Hàn Quốc) - Kính hiển vi quang học. Eclipse E600-Nikon (Nhật) - Máy đo quang Jenway 6300 spectrophotometer - Máy sắc ký lỏng cao áp HPLC Alliance-Water (Mỹ). - Đĩa peptri, pipetman các loại, ống ependorf, ống falcon, đầu côn các loại. 2.1.3.MÔÍ số môi trường sử dụng trong nghiên cứu. Môi trường 1: Môi trường Malt- glucose 2 °Bx. Nước malt l°Bx Glucose lOg Nước cất vừa đủ 1000 ml Môi trường 2:Malt- glucose 2 °Bx cóbổ xung thạch 2%, acid lactic 1% 14 Môi trường 3: Malt- glucose 2 °Bx có bổ xung thạch.2 % Môi trường 4: Môi trường cơ bản (Base Medium). Glucose 10 g Vi lượng (*) Khoáng (**) (NH4)2 S0 4 5g ĨỈ2o vừa đủ 1000ml (*)Thành phần vi lượng ( ỊLig) 500 h 3b o 3 400 C11SO4.. 5H20 100 KI 200 FeCl3. 6H2O 400 MnS04. 4H20 200 Na2Mo04. 2H20 400 ZnS04. 7H20 (**)Thành phần khoáng (mg) 850 KH2PO4 150 KHPO4 MgSC>4.7H20 500 100 NaCl CaCl2.6H20 100 Bảng 2. Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu được biến đổi từ __________________ môi trường cơ bản.__________________ Môi trường Khoáng Vi lượng Nguôn nitơ Nguôn cacbon 4 5 6 7 8 9 + + + + + + + + + + + + (NĨỈ4)2 S0 4 KNO3 (NH4)2so 4 (NH4)2so 4 kno3 kno3 glucose glucose ethanol glycerin ethanol glycerin Các môi trường đều hấp ở latm, 121°c trong 20 phút. 2.2. Phương pháp nghiên cứu: 2.2.1. Phân lập nấm men sắc tố từ lá cây. Phân lập nấm men có sắc tố vàng đến đỏ từ lá cây trên môi trường (2) theo hai phương pháp là 15 Phương pháp pha loãng: Cân 5g lá mẫu rồi cắt nhỏ vào ống fancol chứa 20 ml nước cất đã thanh trùng, ngâm và lắc trong 15 phút. Tuỳ vào lượng tế bào trong dịch sau khi soi trên kính hiển vi pha loãng ở nồng độ thích hợp. Sau đó cấy lên môi trường (2). Dùng que gạt trải đều trên mặt thạch sau đó để ở 25°c trong 5 ngày. Phương pháp bào tử bắn: Dùng một lượng lá có diện tích gần bằng diện tích mặt thạch, cố định lá trên nắp hộp peptri bằng băng dính hai mặt, mặt dưới của lá hướng mặt thạch. Hàng ngày đổi đĩa thạch. Các đĩa thạch nuôi cấy ở 25°c trong 5 ngày rồi quan sát. Các mẫu nấm men sắc tố từ vàng đến đỏ sau khi phân lập được tiến hành thuần khiết trên môi trường số (3) bằng cách cấy zic zac nhiều lần cho đến khi thu được chủng thuần khiết.Sau đó được giữ giống trong ống eppendorf ở nhiệt độ 5 0c. 2.2.2. Tuyển chọn sơ bộ nấm men cho màu đậm nhất. Môi trường thử: môi trường số (3), dùng pipetman hút 100 |il nước cất vô trùng vào từng ô của bàn chấm có 21 lỗ. Sau đó một lượng tế bào tương tự nhau được hoà tan nhẹ nhàng vào nước chứa trong các ô từ 1~> 21 . Dùng bàn chấm nhúng vào khoang chứa dịch nấm men sau đó chấm lên mặt thạch. Đĩa thạch có 21 chủng được cấy chiếu sáng liên tục trong 5 ngày. Dựa vào màu sắc, kích thước của khuẩn lạc xác định độ đậm màu của các chủng và chọn lựa chủng cho màu đậm. 2.2.3. Tuyển chọn nấm men tổng hợp carotenoid tốt nhất trên các môi trường có nguồn Nitơ và nguồn Cacbon khác nhau. ■Với ỴỊguồn Nỉtơ: .Môi trường thử là môi trường số (4) và số (5) 16 Trên môi trường đặc (thêm 2 % thạch): Các chủng tuyển chọn ở 2.2.2. được cấy trên cùng một đĩa môi trường, để ở nhiệt độ phòng và chiếu sáng liên tục trong 5 ngày rồi quan sát màu sắc, hình thái và kích thước khuẩn lạc. Trên môi trường lỏng: đóng trong mỗi ống nghiệm có nắp đã tiệt trùng 5 ml dịch môi trường rồi cấy các chủng nấm men và lắc trên máy lắc ống nghiệm với tốc độ lắc 320 vòng/1 phút, nhiệt độ 25° c chiếu sáng liên tục trong năm ngày. Kết hợp cả hai môi trường đặc và lỏng chọn ra mẫu tốt nhất trên môi trường có nguồn Nitơ tưng ứng Với nguon Cacbon. Môi trường thử: môi trường số (1, 4, 5, 6 , 7, 8, 9 ), cách điều chế tương tự mục 2..1.3, số lượng môi trường là 100ml. Bốn chủng nấm men cấy một lượng tế bào tương đương nhau vào bình tam giác dung tích 500 ml có chứa 100ml dịch môi trường tương ứng. Sau đó bình tam giác được lắc và chiếu sáng liên tục trong 8 ngày, tốc độ lắc 140 vòng/1 phút, nhiệt độ 25°c. Hàng ngày quan sát sự biến đổi màu của các mẫu và hút lml dịch nuôi cấy để lưu mẫu, theo dõi sự phát triển trên các môi trường có nguồn dinh dưỡng Cacbon khác nhau. Xác định thời điểm tổng lượng carotenoid lớn nhất, thời điểm bắt đầu suy thoái và nguồn Cacbon tốt nhất trong các nguồn đã thử thể hiện qua sự biến đổi độ đậm mầu của dịch nuôi cấy. 2.2.4. Xác định thành phần carotenoid. Tách chiết cgrrotenoid: lên men sinh khối rồi phá vỡ màng tế bào và tách chiết carrotenoid bằng dung môi hữu cơ. Đinh lương_ carotenoid bằng, đo quang phổ hấp thu Nguyên tắc: . Các hợp chất carotenoid cho độ hấp thụ cực đại ở 480 nm. Định lượng carotenoid bằng phương pháp đo màu với máy đo quang phố Jenway6300 Spectrophotometer.[22] 17 < " w \ Xác định lượng carotenoid trong mâu băng công thức: Tổng carotenoid = 2 J5Q X 10 4 X k (mg) A480 là độ hấp thụ tại X = 480 2,150: là độ hấp thụ riêng X = 480 k: là hệ số pha loãng Xác đinh thành phần carotengid và định lương /?-carotene bang, sắc ký lỏng, hieu năng cao(HPLC). Nguyên tắc: Xác định các chất dựa trên sự phân bố của chất giữa 2 pha: Pha tĩnh là chất lỏng bao boc tạo thành một tấm phim mỏng trênbề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang) được nhồi vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh. Khi các chất ra khỏi cột được Detector phát hiện, máy sẽ ghi lại sắc ký đồ. Vị trí của peak trên sắc ký đồ là thể hiện định tính, chiều cao hay diện tích peak thể hiện định lượng của chất [5]. So sánh sắc ký đồ, thời gian lưu, phổ hấp thụ UV-VIS, phổ đạo hàm bậc nhất của chất chuẩn và carotenoid trong mẫu định tính các thành phần trong dịch chiết. Định lượng P-carotene bằng phương pháp đường chuẩn. 2.3.Tiến hành và kết quả. 2.3.1. Phân lập và thuần khiết Phương pháp pha loãng: Lá cây được cắt nhỏ, ngâm 15 phút trong nước cất vô trùng sau đó pha loãng đến nồng độ thích hợp và cấy trên môi trường (2) Phương pháp bào tử bắn: Lá cây được cố định trên nắp hộp petri theo chiều mặt dưới của lá hướng về mặt thạch. Sau 24 giờ đổi nắp đĩa petri đã cố định lá sang một đĩa thạch mới. Kết quả: Từ 25 mẫu lá cây, chúng tôi đã thu được 154 chủng nấm men, ký hiệu HRY từ 1—>154 trong đó phần lớn là các chủng màu hồng, đỏ, có 3 chủng màu vàng. 18 2.3.2. Sơ bộ tuyển chọn nấm men tổng hợp nhiều Carotenoid Môi trường thử: môi trường số (3), các mẫu nấm men sau khi cấy truyền ra ống thạch nghiêng tiến hành thử bằng cách cấy cùng lúc 21 chủng trên một đĩa thạch, chiếu sáng liên tục trong 5 ngày ở nhiệt độ phòng. Chọn lựa chủng nấm men cho màu đâm nhất. Kết quả được trình bày ở bảng 3. Bảng 3: Độ đậm màu của các chủng nấm men trên môi trường _________________ Malt- glucose 2 °Bx_________ _______ Chủng HRY2, HRY5, HRY 10, HRY11, HRY13, HRY18, HRY20, HRY21, HRY22, HRY23, HRY25, HRY26, YHR31, HRY35, HRY33, HRY44, HRY43, HRY45, HRY46, HRY54, HRY55, HRY58, HRY64, HRY68, HRY69, HRY77,HRY 106, HRY113, HRY115, HRY125, HRY126, HRY128, HRY132, HRY136, HRY137, HRY138, HRY141, HRY142, HRY148, HRY150 HRY1, HRY3, HRY4, HRY8, HRY9, HRY12, HRY15, HRY16, HRY19, HRY17, HRY 24, HRY26, HRY28, HRY27,HRY29, HRY30, HRY34, HRY32, HRY36, HRY37, HRY39, HRY42, HRY46, HRY47, HRY48, HRY49, HRY51, HRY52, HRY53, HRY54, HRY57, HRY56, HRY59, HRY60, HRY65, HRY68, HRY61, HRY62, HRY63, HRY70, HRY71, HRY72 HRY75, HRY74, HRY76, HRY78, HRY79, HRY80, HRY83, HRY84, HRY85, HRY86, HRY87, HRY88, HRY89, HRY90, HRY91, HRY93, HRY94, HRY95, HRY96, HRY98, HRY99, HRY100, HRY101, HRY103, HRY107, HRY109, HRY110, HRY114, HRY117, HRY118, HRY121, HRY124, HRY125, HRY127, HRY129, HRY130, HRY133, HRY138, HRY143, HRY144, HRY145, HRY146, HRY147, HRY151. HRY 7, HRY14,HRY38, HRY41, HRY50, HRY69, HRY73, HRY79,HRY 81, HRY92, HRY102, HRY104, HRY105. HRY108, HRY112 Độ đậm mâu - + ++ +++ HRY6, HRY50, HRY82 (-): nhạt màu (+): màu hông (++) màu đỏ (+++) màu đỏ đậm Sau đợt tuyển chọn thứ nhất, chúng tôi thu được 18 chủng cho màu đỏ đậm nhất trên môi trường Malt- glucose 2 0BX. 2.3.3. Xác định sự ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng Nitơ tới khả năng tổng hợp carotenoỉd. Trên môi trường đăc: Trong quá trình điều chế môi trường cần lưu ý glucose, thạch cho cùng một bình nón, các thành phần khác cho vào một bình khác. Hấp trong nồi hấp áp lực ở latm, 121°c trong 20 phút sau đó để nguội đến 50°c và trộn vào nhau trong box, đổ đĩa và cấy 18 chủng nấm men được tuyển chọn ở 2.3.2 . 19 Trên mói trườns lỏng, cấy các chủng nấm men vào ống môi trường trên rồi lắc trên máy lắc ống nghiệm với tốc độ lắc 320 vòng/1 phút, nhiệt độ 25° c chiếu sáng liên tục trong bảy ngày. Kết quả thử trên cả hai môi trường đặc và lỏng được trình bày ở bảng 4. Bảng 4: Sự ảnh hưởng của nguồn Nitơ tới sự phát triển và tổng hợp carotenoid của nấm men trên môi trường đặc và lỏng._____ Chủng KNO3 STT (NH4)2s o 4 r m /V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 HRY 6 HRY7 HRY 14 H R Y 38 HRY41 H R Y 50 H R Y 69 H RY 73 HRY79 H R Y 82 HRY102 HRY 104 HRY 105 HRY 108 HRY81 HRY92 HRY 112 HRY 149 4A Độ đậm mầu ± ± ± ± ± ± Tôc độ phát triển D D D w w D w w ± ± D G ± ++ w ± D D D G ± ± + ++ + + w D w ± Chú thích : w (weak): mọc yếu G (good): mọc tốt D (delay): mọc chậm rp A 4A Tôc độ phát triển D w G D D D w G G w G G G G D G G G Độ đậm mầu ± + ++ ± ± ± + ++ ++ + +++ +++ ++ +++ + ++ +++ +++ ± : nhạt mầu so với ban đầu + : giữ nguyên mầu ++: đậm mầu hơn +++ đậm màu nhất Kết quả ở bảng 3 cho thấy: Không có sự khác biệt nhiều về khả năng tổng hợp Carotenoid trên môi trường lỏng và đặc. Song trên môi trường có (NH4)2 SO4 các chủng phát triển tốt hon và cho màu đậm hơn trên môi trường có KNO3. Ở môi trường đặc có (NHLt^SOị, khuẩn lạc khô , sần, kích thước to 20 trong khi ở môi trường có K N O 3 khuẩn lạc ướt, bóng và kích thước nhỏ. Với hai nguồn Nitơ khác nhau chúng tôi chọn được: 3 chủng HRY104, HRY112, HRY149 phát triển tốt trên môi trường có nguồn Nitơ là NILt+ và một chủng HRY 82 phát triển tốt trên môi trường có nguồn Nitơ là N O 3 " Hình 2. Độ đậm màu của các chủng nấm men trên môi trường nuôi cấy a: môi trường 4, b: môi trường 5, c: môi trường 5 bổ sung 2% thạch, d: môi trường 2 bổ sung 2% thạch. Hình c, d hình thái, kích thước, độ đậm màu của các chủng ở vị trí tương ứng có sự khác nhau rõ rệt. 21 2.3.4 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng Cacbon, thời gian nuôi cấy tới sự phát triển và tổng hợp carotenoid. Bốn chủng nấm men được chọn từ 2.3.3 cấy một lượng tế bào tương đương nhau vào bình tam giác dung tích 500 ml có chứa 100ml dịch môi trường tương ứng. Sau đó bình tam giác được lắc và chiếu sáng liên tục trong 8 ngày, tốc độ lắc 140 vòng/1 phút, nhiệt độ 25 °c. Tiến hành so độ đục và độ đậm màu dịch nuôi cấy của các mẫu theo thời gian.Ket quả được thể hiện trong bảng 5. Bảng 5: Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng cacbon và thời gian _____ nuôi cấy tới khả năng tổng hợp Carotenoid 144h 168h 192h 72h 96h 120 Chủng Nguồn c 48h Malt HRY82 Gluco Ethanol Glycerin Malt HRY104 Gluco Ethanol Glycerin Malt HRY112 Gluco Ethanol Glycerin Malt HRY149 Gluco Ehanol Glycerin Chú thích: ++ + + 0 ++ + 0 ++ +++ +++ ++ 0 + +++ ++ + ++ ++ + 0 ++ 0 +++ 0 +++ ++ 0 ++ + 0 0 ++ ± + + + 0 + + + ++ +++ + 0 + + ± + + + ++ + + + ++ ++ ++ + + + ++ + + + 0 0 ± 0 ++ + 0 : không mọc (+) : màu hồng (-): đục trắng (±): đục, nhạt màu (++): màu đỏ (+++): màu đỏ tốt 22 + ++ Cả bốn chủng đều phát triển tốt trên môi trường Malt-glucose, độ đậm màu đạt cực đại trong khoảng 72h - 96h, bắt đầu giảm độ đậm màu sau 120h. Môi trường có Glucose cũng thích hợp cho các chủng phát triển nhưng không bằng môi trường Malt - glucose, trừ chủng HRY82, chủng này có thời gian bền màu lâu từ 96h-168h. Môi trường có Ethanol, Glycerin thường khả năng đồng hoá kém, tốc độ mọc chậm, hơn, cường độ màu thấp Hình 3. ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng tạo màu của các chủng khảo cứu (1 - Malt, 2 - Gluco-KNOs, 3 - Ethanol-KNOs, 4 - Glycerin-KN03) a: sau 48h nuôi cấy, b: sau 72h nuôi cấy, c: sau 96h nuôi cấy, d: 144h nuôi cấy. 23 2.3.5. Tách, chiết carotenoỉd từ nấm men. Sơ đô tach chief \ r Hình 4. Sơ đồ tách chiết Carotenoid từ nấm men 24 Quỵ trinh chief tach Nấm men được cấy vào ống nghiệm chứa 5 ml dịch môi trường, lắc 320 vòng/ phút, 25°c trong 18 giờ. Sau đó chuyển vào bình nón dung tích 500 ml chứa 100 ml dịch nuôi cấy. Bình tam giác được lắc với tốc độ 140 vòng/phút, chiếu sáng liên tục trong 72 giờ ở 25°c. Sau đó li tâm trong vòng 5 phút với tốc độ 4000vòng/phút. Loại bỏ lớp dịch, đem cân và tính lượng sinh khối tế bào. Dung môi phá tế bào đã được ngâm nóng ở 55°c cho vào ống fancol với tỷ lệ lg sinh khối: 10 ml dung môi. Lắc mạnh trong 2 phút. Sau đó thêm 1 ml dung dịch đệm phosphat NaH2P 04/ Na2HPƠ4 pH= 7; 10 ml dung môi chiết carotenoid vào ống, tiếp tục lắc trong 1 phút. Li tâm trong 3 phút ở tốc độ 4000 vòng/ phút. Tách lấy lớp dung môi ở trên. Quá trình tách có thể dùng bình gạn hoặc dùng pipet hút lấy lớp dịch carotenoid. 2.3.6.Định lượng carotenoid toàn phần bằng đo độ hấp thụ UV- VIS. Dịch thu được ở phần 2.3.5 được pha loãng 3 lần bằng dung môi hexan: ethyl acetat (1:1), đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 480 nm với mẫu trắng là dung môi pha loãng. Kết quả được thể hiện ở bảng 6 . Bảng 6 . Hàm lượng Carotenoid trong các mẫu được chọn từ 2.3.5 H R Y 104 Malt Glucose Độ hâp thụ H R Y 112 Malt Glucose H R Y 149 Malt Glucose H R Y 82 Malt Glucose 0,366 0,364 0,517 0,167 0,576 0,241 0,531 0,379 carotenoid mg/100ml 5,106 5,079 7,214 2,33 8,037 3,363 7,41 5,288 Lượng sinh khôi ướt (g) 2,036 1,343 1,341 2,031 1,525 1,987 1,798 2,565 mg carotenoid/g sinh khối ướt 2,51 3,781 5,379 1,147 5,27 1,69 4,12 2,061 OD Tông Nhận xét : Kết quả bảng 6 cho thấy các chủng HRY 112, HRY 149, HRY82 lượng sinh khối thu được ở môi trường Malt- glucose ít hơn môi 25 trường glucose nhưng tổng lượng carotenoid ở môi trường Malt - Glucose lại cao hon. Như vậy có thể thấy là tổng Carotenoid không phụ thuộc lượng sinh khối mà phụ thuộc vào khả năng tổng hợp Carotenoid của tế bào nấm men. Chủng HRY112 trong môi trường Malt-glucose cho hiệu suất tổng hợp Carotenoid cao nhất (5,379 mg/g sinh khối ướt) trong khi ở môi trường glucose kết quả là thấp nhất (l,147mg/g). Các mẫu ở môi trường Maltglucose đều có hiệu suất tổng họp Carotenoid cao hơn môi trường glucose. Nhìn chung môi trường Malt có đầy đủ các yếu tố dinh dưỡng hơn các môi trường khác và có lẽ do vậy đảm bảo cho quá trình sinh tổng hợp. Chúng tôi chọn các mẫu nuôi cấy trên môi trường Malt đem xác định thành phần cartenoid và định lượng p -Carotene. 2.3.7. Xác định thành phần carotenoid và Carotene. Xác định carotenoid thành phần dựa vào peak và thời gian lưu của chất trên sắc ký đồ ở bước sóng 450nm, phổ hấp thụ UV-VIS và phổ đạo hàm bậc nhất. Định lượng (3-Carotene được thực hiện thông qua việc xây dựng đường chuẩn (3 -Carotene. Tiến hành: Điều Ịáên chaỵ sac ký lỏng, hỉêu năng cao (HPLC): Côt: Symmetry Cis (Waters) 150 *4,6 mm, pha động: Acetonitril: Methanol (chứa 50 mM amoni acetat): Dicloromethan: Nước với tỷ lệ 70:15:10:5 (v/v), detector PDA 2596 (Photodiod array), tốc độ dòng: 1 ml/phút, nhiệt độ cột: 40°c, thời gian chạy: 20 phút Kết quả: Kết quả sắc kỷ được trinh bày trong hình 5 và hình 10(phần phụ lục) 26 r- 1 r-T- T "X' '-Ỉ... r’~r-'i r T ~ r j - T- r iaoo 12*00 14.00 16.00 ~1—»—r-r-20:00 18.00 Hình 5 Sắc ký đồ của a: Ị3-carotene chuẩn, b: mẫu HRY82 tại Â= 450 nm Nhìn vào sắc ký đồ (hình5,10) ta thấy, các chất tách tương đối tốt, cả 4 mẫu dịch chiết được pha loãng 5 lần đều cho sắc ký đồ tương đối giống nhau. Thành phần Carotenoid gồm các hợp chất Xanthin và nhóm Carotene trong đó nhóm Xanthin chứa tỉ lệ lớn hơn. Dựa trên sắc ký đồ, thời gian lưu, phổ hấp thụ UV-VIS, phổ đạo hàm bậc nhất của mẫu và chất chuẩn, chúng tôi xác 27 định chất có thời gian lưu 5,8 phút là Turolarhodin, chất thứ hai có thời gian lưu 6,2 phút chưa xác định cụ thể. nm Hình 6 . Phổ hấp thụ và phổ đạo hàm bậc nhất của 3 - Carotene chuẩn và p - Carotene trong mẫu HRY 82. Các mẫu HRY104, HRY102, HRY149 thành phần carotene rất thấp trong đó Ị3-Carotene chỉ có vết với peak rất nhỏ và bị nhiễu nhiều. Điều này có thể do bản thân các mẫu nấm men tổng hợp được ít p-Carotene, tuy nhiên cũng có thể trong quá trình chiết tách ảnh hưởng của các điều kiện ngoại cảnh như 28 ánh sáng, nhiệt độ, các chất oxy hoá đã làm biến đổi và giảm đáng kể lượng carotene. Mầu HRY82 cho kết quả tốt hơn cả, trên sắc ký đồ ngoài hai chất giống với các mẫu khác còn có P-Carotene với đỉnh tương đối đặc trưng. Tuy có sai lệch về thời gian lưu với các chất chuẩn 0,13 phút song khi định tính bằng phổ UV-VIS và phổ đạo hàm bậc nhất đều có đỉnh hấp thụ cực đại tại bước sóng 454nm và 480nm, hình dáng phổ giống nhau nên có thể khẳng định khá chắc chắn chất trong mẫu là ị3-Carotene. Sự lệch đỉnh hấp thụ cưc đại lnm và thời gian lưu có thể do nồng độ (3-Carotene trong mẫu nhỏ. Bảng 7. Thành phẩn Carotenoid trong dịch chiết Dịch chiết Carotenoid HRY 82 Torularhodin UNK- 450 HRY 104 p- carotene Toralarhodin UNK- 450 HRY 112 p- carotene Torularhodin UNK- 450 HRY 149 P- carotene Torularhodin UNK- 450 Diện tích Thời Tỷ lệ % gian lưu peak peak 5,875 6,269 14,719 5,856 6,241 351123 105536 57896 470400 122799 68,2 20,5 - - 5,842 6,235 179813 47455 - - 5,823 6,206 483448 124351 11,3 79,2 20,6 [...]... Kết luận: Phân lập được 154 chủng nấm men từ 25 mẫu lá Tuyển chọn được 4 chủng có khả năng tổng hợp carotenoid và một chủng có khả năng tổng hợp p - Carotene Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng và thời gian nuôi cấy tới khả năng tổng hợp carotenoid cho kết quả: với nguồn dinh dưỡng Nitơ là (NH4)2S0 4 các chủng mọc tốt hơn KN0 3 về hình thái, kích thước và độ đậm màu của khuẩn lạc Các chủng đã... được 154 chủng nấm men, ký hiệu HRY từ 1—>154 trong đó phần lớn là các chủng màu hồng, đỏ, có 3 chủng màu vàng 18 2.3.2 Sơ bộ tuyển chọn nấm men tổng hợp nhiều Carotenoid Môi trường thử: môi trường số (3), các mẫu nấm men sau khi cấy truyền ra ống thạch nghiêng tiến hành thử bằng cách cấy cùng lúc 21 chủng trên một đĩa thạch, chiếu sáng liên tục trong 5 ngày ở nhiệt độ phòng Chọn lựa chủng nấm men cho... từ nấm mốc và nấm men Bởi những ưu việt 11 trong công nghệ vi sinh Nấm mốc, điển hình là Blakeslea tripora hiệu quả, khả năng tổng hợp (3 -carotene cao nhưng điều kiện nuôi cấy, tách chiết phức tạp nên ng ười ta chú ý tới nấm men nhiều hơn do có những ưu điểm như: cấu tạo đơn bào, ổn định và rất dễ phát triển trên các môi trường nuôi cấy Trên thế giới nhiều nghiên cứu về nấm men sinh tổng hợp các hợp. .. tăng hiệu suất sinh tổng họp và thu được loại Carotenoid có tác dụng sinh học cao như lycopene, ị3 -carotene, Astaxanthin Đặc biệt sử dụng kỹ thuật gây đột biến đã tạo ra chủng đột biến có hiệu suất sinh tổng hợp ị3 -carotene gấp 200 lần chủng ban đầu và chiếm 80% tổng số Carotenoid Dưới đây là sơ đồ quá trình tổng hợp carotenoid ở nấm men Rhodotorula glutinis CBS20 [21] Phytofluen 1: P -carotene synthase... điều trị một số trường hợp. [6] - ỉa chảy nhiễm trùng cấp tính do vi khuẩn, vi rút, nấm - Điều trị và dự phòng ỉa chảy do sử dụng kháng sinh - Điều trị hội chứng kích thích ruột (thường gọi là viêm đại tràng cơ năng) ^ 3 Sinh tổng hợp p -carotene |3 -carotene có thể được tổng hợp từ nhiều nguồn khác nhau như: Thực vật, tảo, vi khuẩn, nấm mốc, nấm men trong đó nguồn sinh tổng họp Ị3 -carotene được nghiên... hoà tan nhẹ nhàng vào nước chứa trong các ô từ 1~> 21 Dùng bàn chấm nhúng vào khoang chứa dịch nấm men sau đó chấm lên mặt thạch Đĩa thạch có 21 chủng được cấy chiếu sáng liên tục trong 5 ngày Dựa vào màu sắc, kích thước của khuẩn lạc xác định độ đậm màu của các chủng và chọn lựa chủng cho màu đậm 2.2.3 Tuyển chọn nấm men tổng hợp carotenoid tốt nhất trên các môi trường có nguồn Nitơ và nguồn Cacbon... ị3 -carotene jug/ g sinh khối khô 30 55 55 15 55 75 20 5 Cũng như các hợp chất Vitamin, kháng sinh, Carotenoid trong tế bào nấm men là các sản phẩm chuyển hoá bậc II, đựoc tổng hợp dưới tác dụng của các enzym trong cơ thể, thường lượng không lớn bằng các sản phẩm chuyển hoá bậc I và chỉ một số loài có khả năng tổng hợp để phục vụ nhu cầu của chúng Các chủng phân lập ban đầu thường cho hiệu quả sinh tổng. .. 50°c và trộn vào nhau trong box, đổ đĩa và cấy 18 chủng nấm men được tuyển chọn ở 2.3.2 19 Trên mói trườns lỏng, cấy các chủng nấm men vào ống môi trường trên rồi lắc trên máy lắc ống nghiệm với tốc độ lắc 320 vòng/1 phút, nhiệt độ 25° c chiếu sáng liên tục trong bảy ngày Kết quả thử trên cả hai môi trường đặc và lỏng được trình bày ở bảng 4 Bảng 4: Sự ảnh hưởng của nguồn Nitơ tới sự phát triển và tổng. .. đầu về các chủng nấm men sinh P -carotene Trong thời gian tới đề tài cần tiếp tục được nghiên cứu thêm để sớm đưa ra chế phẩm chứa (3 -carotene phục vụ cho việc tăng cường sức khoẻ cho người dân, cụ thể cần : - Nghiên cứu các điều kiện tối ưu hoá cho khả năng tổng hợp P -carotene của chủng đã phân lập ở trên - Sử dụng kỹ thuật gây đột biến để tạo ra những chủng mói cho năng suất tổng họp ị3 -carotene cao... sinh tổng hợp các hợp carrotcarotennoid đã được ứng dụng vào sản xuất, tạo nguồn nguyên liệu cho thực phẩm và sản xuất thuốc Một số nấm men thuộc chi Rhodotorula Phaffia, đã được công bố như ở bảng 1 [18, 23, 22] Bảng 1 Các chủng nấm men sinh tổng hợp ị3 -carotene đã được công bố Tổng lượng Carotenoid |xg/ g sinh khối khô 40 100 70 25 75 100 120 10 Chủng Rhodotorula araucariae CBS 6031 Rhodotorula aurantiaca ... tài: Phân lập tuyển chọn nấm men sinh tổng hợp p - Carotene với mục tiêu: • Phân lập nấm men sinh Carotenoid • Khảo sát ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng tới sinh tổng hợp Carotenoid • Thiết lập quy... họp hai chất từ chủng nấm 32 PHẦN KÉT LUẬN VÀ ĐÊ XUẤT 3.1 Kết luận: Phân lập 154 chủng nấm men từ 25 mẫu Tuyển chọn chủng có khả tổng hợp carotenoid chủng có khả tổng hợp p - Carotene Khảo sát... năng) ^ Sinh tổng hợp p -carotene |3 -carotene tổng hợp từ nhiều nguồn khác như: Thực vật, tảo, vi khuẩn, nấm mốc, nấm men nguồn sinh tổng họp Ị3 -carotene nghiên cứu nhiều từ nấm mốc nấm men Bởi