Tuyển chọn vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ trà phú thọ

57 671 1
Tuyển chọn vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ trà phú thọ

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

... lên men kombucha từ trà Phú Thọ 29 3.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả lên men kombucha từ trà Phú Thọ 30 3.2.1 Tuyển chọn chủng nấm men có khả lên men kombucha từ trà. .. 3.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả lên men kombucha từ trà Phú Thọ 3.2.1 Tuyển chọn chủng nấm men có khả lên men kombucha từ trà Phú Thọ Bƣớc 1: Quan sát hình thái tế bào chủng nấm men kính... chủng vi sinh vật có khả lên men kombucha từ trà Phú Thọ 27 3.1.1 Phân lập chủng nấm men có khả lên men kombucha từ trà Phú Thọ 27 3.1.2 Phân lập chủng vi khuẩn có khả lên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 ---------- NGUYỄN THỊ NHINH TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN KOMBUCHA TỪ TRÀ PHÚ THỌ CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. ĐinhThị Kim Nhung HÀ NỘI, 2015 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới cô giáo, PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung, Giảng viên chính, tổ Thực vật – Vi sinh, Trƣờng Đại hoc Sƣ phạm Hà Nội 2, ngƣời đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong thời gian học tập và nghiên cứu đề tài này. Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ môn Thực vật – Vi sinh, Khoa Sinh – KTNN, trƣờng Đại học sƣ phạm Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kinh nghiệm trong suốt thời gian em thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trƣờng, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, Trung tâm thông tin thƣ viện, Phòng thí nghiệm Vi sinh vật trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận này. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và ngƣời thân, những ngƣời luôn quan tâm, động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, tiến hành và hoàn thiện đề tài. Hà Nội, Ngày…. Tháng…. Năm 2015 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Nhinh LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của riêng cá nhân tôi, tất cả những số liệu đều đƣợc thu thập từ thực nghiệm và qua xử lý thống kê, hoàn toàn không có số liệu sao chép, bịa đặt. Đề tài nghiên cứu này không trùng với công trình nghiên cứu của các tác giả khác. Trong đề tài, em có sử dụng một số dữ liệu của một số tác giả khác, em xin phép các tác giả đƣợc trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình. Nếu sai em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Sinh viên Nguyễn Thị Nhinh MỤC LỤC MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1 1. Lý do chọn đề tài.........................................................................................1 2. Mục đích nghiên cứu ...................................................................................2 3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................2 3.1. Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ ................................................................................................... 2 3.2. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ .............................................................................................. 2 3.3. Nghiên cứu động thái sinh trƣởng của chủng vi khuẩn, nấm men tuyển chọn; ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng tới quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ ........................................................... 2 3.4. Lên men tạo sản phẩm kombucha từ trà Phú Thọ ....................................... 2 4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài .........................................2 4.1. Ý nghĩa khoa học ....................................................................................... 2 4.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................ 3 5. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................3 5.1. Phƣơng pháp vi sinh ................................................................................... 3 5.2. Phƣơng pháp hóa sinh ................................................................................ 3 5.3. Phƣơng pháp cảm quan .............................................................................. 3 5.4. Phƣơng pháp toán học ................................................................................ 3 6. Điểm mới của đề tài ....................................................................................3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 4 1.1. Giới thiệu về kombucha ...........................................................................4 1.1.1. Nguồn gốc .............................................................................................. 4 1.1.2. Đặc điểm cấu tạo ..................................................................................... 5 1.1.3. Hệ vi sinh vật trong kombucha ................................................................ 7 1.1.4. Thành phần hóa học và công dụng của kombucha ................................. 10 1.2. Tình hình nghiên cứu về kombucha trên thế giới và ở Việt Nam ............ 12 1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ......................................................... 12 1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ......................................................... 14 CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................... 18 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................. 18 2.1.1. Mẫu thực vật ........................................................................................ 18 2.1.2. Mẫu vi sinh vật ...................................................................................... 18 2.1.3. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................ 18 2.1.4. Hóa chất ................................................................................................ 18 2.1.5. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 18 2.1.6. Thời gian, địa điểm nghiên cứu ............................................................. 18 2.1.7. Các loại môi trƣờng ............................................................................... 18 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................ 19 2.2.1. Phƣơng pháp vi sinh .............................................................................. 19 2.2.2. Phƣơng pháp hóa sinh ........................................................................... 22 2.2.3. Phƣơng pháp cảm quan ......................................................................... 23 2.2.4. Phƣơng pháp toán học ........................................................................... 25 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................. 27 3.1. Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ ......................................................................................................... 27 3.1.1. Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ ............................................................................................ 27 3.1.2. Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ ................................................................................................. 29 3.2. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ ..................................................................................................30 3.2.1. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ ........................................................................................ 30 3.2.1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ ............................................................................................ 33 3.3. Động thái sinh trƣởng của chủng vi khuẩn, nấm men tuyển chọn; ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng tới quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ ............................................................................................. 38 3.3.1. Động thái sinh trƣởng của chủng vi khuẩn, nấm men tuyển chọn ....................................................................................................... 38 3.3.2. Ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng tới quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ ....................................................................... 40 3.4. Lên men tạo sản phẩm kombucha từ trà Phú Thọ ................................... 42 3.4.1. Lên men kombucha ............................................................................... 42 3.4.2. Thuyết minh quy trình ........................................................................... 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................ 46 1. Kết luận .................................................................................................... 46 2. Kiến nghị ..................................................................................................46 TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 47 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học trà kombucha ........................................... 10 Bảng 2.1. Các loại môi trƣờng sử dụng .................................................... 19 Bảng 2.2. Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha ........................................................................... 24 Bảng 2.3. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu ........................................... 24 Bảng 2.4. Bảng quy định đánh giá mức độ chất lƣợng sản phẩm................................................................................... 25 Bảng 3.1. Kết quả phân lập các chủng nấm men....................................... 28 Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc một số chủng vi khuẩn phân lập .................................................................................... 29 Bảng 3.3. Hàm lƣợng khí CO2 giải phóng sau 7 ngày lên men của 4 chủng nấm men ............................................................... 32 Bảng 3.4. Khả năng kết lắng của 4 chủng nấm men ................................. 32 Bảng 3.5. Hàm lƣợng acid tổng số sinh ra và chất lƣợng cảm quan sản phẩm từ 5 chủng vi khuẩn................................................... 36 Bảng 3.6. Đặc tính sinh hóa của 5 chủng vi khuẩn Acetobacter phân lập đƣợc từ trà Phú thọ ..................................................... 37 Bảng 3.7. Quá trình sinh trƣởng của chủng vi khuẩn V2 và nấm men N3 ......................................................................... 39 Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng giống đến hàm lƣợng acid tổng số sinh ra ................................................................... 41 Bảng 3.9. Đánh giá chất lƣợng sản phẩm kombucha bằng phƣơng pháp cảm quan .................................................................................. 45 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. “Con nấm” .................................................................................. 6 Hình 1.2. Kombucha bị nhiễm nấm mốc .................................................... 6 Hình 3.1. Hình thái tế bào chủng nấm men N1 (x1000 lần)....................... 31 Hình 3.2. Hình thái tế bào chủng nấm men N2 (x1000 lần) ....................... 31 Hình 3.3. Hình thái tế bào chủng nấm men N3 (x1000 lần) ....................... 31 Hình 3.4. Hình thái tế bào chủng nấm men N4 (x1000 lần) ....................... 31 Hình 3.5. Hình thái tế bào chủng vi khuẩn V1 (x1000 lần) ........................ 33 Hình 3.6. Hình thái tế bào chủng vi khuẩn V2 (x1000 lần) ....................... 33 Hình 3.7. Hình thái tế bào chủng vi khuẩn V4 (x1000 lần) ....................... 34 Hình 3.8. Hình thái tế bào chủng vi khuẩn V5 (x1000 lần) ....................... 34 Hình 3.9. Khả năng oxy hóa acetate của chủng vi khuẩn V2 ..................... 35 Hình 3.10. Thử hoạt tính catalase trên chủng vi khuẩn V2 ........................ 36 Hình 3.11. Chủng vi khuẩn V2 lắc sau 24h, 72h, 168h .............................. 38 Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn động thái sinh trƣởng chủng vi khuẩn V2.......... 39 Hình 3.13. Đồ thị biểu diễn động thái sinh trƣởng chủng nấm men N3 ........ 40 Hình 3.14. Biểu đồ biểu diễn ảnh hƣởng hàm lƣợng giống đến hàm lƣợng acid tổng số sinh ra ................................................................. 42 Hình 3.15. Lên men kombucha từ trà Phú Thọ ......................................... 45 BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN 1. TCN : Trƣớc công nguyên 2. VK : Vi khuẩn 3. NM : Nấm men 4. TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam 5. CFU : Clony Forming Unit MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Cùng với xu hƣớng tiêu dùng mới, khi vấn đề sức khỏe ngƣời tiêu dùng đƣợc đặt lên hàng đầu, thì các loại thực phẩm gần gũi thiên nhiên ngày càng đƣợc ƣa chuộng. Thị trƣờng đồ uống không ngừng gia tăng sản lƣợng và đa dạng hóa sản phẩm. Trong đó dòng sản phẩm lên men đang dần chiếm ƣu thế. Đối với ngƣời Việt Nam, trà (chè) đã trở nên khá quen thuộc và gần gũi. Uống trà không những là thói quen trong đời sống mà đã trở thành một nhã thú hƣởng thụ tinh thần. Uống trà không chỉ để giải khát mà còn có khả năng phòng trị bệnh tật, nâng cao sức khỏe, kéo dài tuổi thọ cho con ngƣời. Trên thị trƣờng đã có nhiều loại thức uống đƣợc chế biến từ trà nhƣng sản phẩm trà lên men thì hầu nhƣ còn rất mới mẻ đối với thị trƣờng tiêu dùng Việt Nam. Trà lên men kombucha là loại đồ uống thông dụng và phổ biến ở các nƣớc Đông Âu và các nƣớc khác, nó đƣợc biết đến nhƣ một loại thực phẩm có lợi cho sức khỏe. Thực ra đây chính là một loại thức uống có từ rất lâu đƣợc gọi tên là “ The Remedy for Immortality” nghĩa là “Phƣơng thuốc Trƣờng sinh”. Kombucha thực sự chỉ là một loại cái giấm phát triển dƣới dạng một váng nhầy và dai, màu trắng. Loại giấm này sinh sôi nhanh trong môi trƣờng nƣớc chè pha đƣờng. Khi các vi sinh vật đƣợc nuôi trong một môi trƣờng trà đƣợc cung cấp đủ các chất dinh dƣỡng căn bản chúng phát triển và biến đổi đƣờng thành acid lactic, acid gluconic đồng thời sản xuất ra một lƣợng nhỏ alcohol, alcohol này sau đó biến đổi thành acid acetic (tối đa khoảng 3%) tạo cho trà một vị ngọt và có mùi chua của rƣợu táo lên men, ngoài ra trong trà chứa một lƣợng vitamin B khá cao, vitamin C chứa một lƣợng nhỏ. 1 Phú Thọ là một tỉnh có truyền thống trồng cây chè lâu đời đây là cái nôi của cây chè Tân Cƣơng tỉnh Thái Nguyên của nƣớc ta, nhƣng thực tế cây chè của tỉnh chƣa thực sự có uy tín, chất lƣợng cao so với các nƣớc trên thế giới thậm chí ngay cả trong nƣớc. Trong điều kiện trà kombucha lấy nguồn dinh dƣỡng từ nƣớc trà đƣờng để lên men, ở Việt Nam các công trình nghiên cứu về kombucha vẫn chƣa đầy đủ, hoàn chỉnh. Với mục đích đa dạng chất lƣợng sản phẩm trà Phú Thọ kết hợp với nhu cầu đồ uống trên thị trƣờng. Chính vì vậy tôi quyết định lựa chọn đề tài:“Tuyển chọn vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ”. 2. Mục đích nghiên cứu Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha tạo sản phẩm kombucha thơm ngon, bổ dƣỡng từ trà Phú Thọ. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ 3.2. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ 3.3. Nghiên cứu động thái sinh trưởng của chủng vi khuẩn, nấm men tuyển chọn; ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ 3.4. Lên men tạo sản phẩm kombucha từ trà Phú Thọ 4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 4.1. Ý nghĩa khoa học Tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men kombucha tốt nhất từ đó làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo. 2 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Sử dụng nguồn nguyên liệu là trà Phú Thọ lên men kombucha tạo sản phẩm nƣớc giải khát đa dạng trên các nguồn nguyên liệu khác nhau.Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng kombucha từ đó rút ngắn thời gian tạo màng, tạo sản phẩm thơm ngon, bổ dƣỡng có tác dụng phòng ngừa một số bệnh. 5. Phƣơng pháp nghiên cứu 5.1. Phương pháp vi sinh 5.2. Phương pháp hóa sinh 5.3. Phương pháp cảm quan 5.4. Phương pháp toán học 6. Điểm mới của đề tài Là kết quả nghiên cứu đầu tiên tuyển chọn đƣợc chủng nấm men N3 và chủng vi khuẩn V2 có khả năng lên men kombucha trên đối tƣợng trà Phú Thọ. 3 NỘI DUNG CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về kombucha 1.1.1. Nguồn gốc Kombucha đã đƣợc sử dụng từ hàng ngàn năm nay, xuất xứ ở Trung Quốc vào thế kỷ thứ III TCN. Sau đó, nó đã đƣợc phổ biến rộng rãi sang Nga, Ấn Độ và Nhật Bản. Đây là loại thức uống đƣợc lên men trong dung dịch trà đƣờng bởi loại nấm – ngƣời Pháp gọi là – Champignon De Longuc Vie (nấm trƣờng sinh), Ngƣời Nhật gọi nó là kombucha. Thời xƣa, ngƣời vùng Kargasok thuộc Nga dùng trà nấm này có tác dụng giúp sống khỏe và kéo dài tuổi xuân nên nó có tên gọi là trà nấm Kargasok. Những ngƣời hƣởng thọ ở Nga bảo là sống lâu nhƣ vậy không những ở môi trƣờng, tập quán sinh hoạt và tâm hồn thƣ thả mà từ hàng trăm năm nay họ còn có thói quen dùng trà lên men này. Khi một nữ du khách quý tộc Nhật đến thăm thắng cảnh ở làng, trông thấy những ngƣời già cả ở đây khỏe mạnh lạ thƣờng, gƣơng mặt họ không có nếp nhăn và không lộ vẻ già nua. Bà lấy làm ngạc nhiên và hỏi nguồn gốc thì đƣợc biết dân chúng ở đây có thói quen uống trà kombucha hàng ngày. Bà xin một ít nấm về để làm giống, đem về Nhật và sau đó chia cho bạn bè để cùng nhau sử dụng. Sau nhiều tháng, các bạn của bà đều vô cùng khen ngợi về sự hữu hiệu của loại nấm này. Do đó, trà nấm đƣợc đồn đại và truyền đi khắp Nhật Bản và đƣợc gọi tên là trà nấm kombucha [14]. Khác với các sản phẩm lên men thông thƣờng, kombucha là sản phẩm của nhiều quá trình lên men tùy vào hệ vi sinh vật có trong nấm, bao gồm: quá trình lên men rƣợu nhờ nấm men, lên men acetic nhờ nhóm vi khuẩn sinh acid acetic và lên men lactic nhờ nhóm vi khuẩn lactic. Do đó, trong dịch lên men chứa hàng trăm sản phẩm phụ từ ba quá trình lên men trên, chúng đóng 4 vai trò quan trọng trong việc hình thành nên hƣơng vị của sản phẩm, đáng chú ý nhất là các acid butyric, acid uronic, acid folic…các vitamin nhóm B (B1, B2, B3,B6, B12) vitamin C. Sản phẩm vừa có vị chua của acid, vị ngọt của đƣờng sót, hậu vị chát và mùi thơm của trà, và vị cay nhẹ của cồn. Ngoài vai trò là một thức uống giải khát thông thƣờng, kombucha còn đem lại những lợi ích cho sức khỏe nhƣ: giảm cao huyết áp, chống lại bệnh viêm khớp, xơ cứng động mạch, hen suyễn, viêm phế quản, ngăn ngừa bệnh ung thƣ, chống lão hóa và tăng hệ miễn dịch cho cơ thể [22]. 1.1.2. Đặc điểm cấu tạo Kombucha là môi trƣờng cộng sinh của vi khuẩn và nấm men. Hệ vi sinh vật trong kombucha rất phong phú, chủ yếu là các chủng Acetobacter nhƣ: Acetobacter xylinum, Acetobacter ketogenum…và nấm men: Saccharomycodes ludwigii, Saccharomycodes apiculatus, Saccharomyces cerevisiae… Ngoài ra còn có thể có các chủng Lactobacillus, Brettanomyces, Pediococcus, Bacterium gluconicum…Chính sự có mặt của các chủng Acetobacter (đặc biệt là Acetobacter xylinum) đã hình thành nên cấu trúc của kombucha. Acetobacter xylinum có khả năng tạo màng hemicellulose khá dày và chắc, tạo màu xanh với thuốc nhuộm Iod và H2SO4. Kombucha còn đƣợc gọi là nấm trà. Chúng sinh trƣởng tốt trong môi trƣờng nƣớc trà đƣờng. Bởi vậy, thƣờng đƣợc sử dụng để lên men dung dịch trà đƣờng, nên gọi là nấm trà. Trong quá trình lên men kombucha sẽ tạo ra một lớp màng mỏng trên bề mặt dịch trà và dần dần tăng bề dày, hình thành nên một kombucha thứ hai (thƣờng gọi là kombucha con) tách biệt với kombucha ban đầu. Hình dạng và kích thƣớc của kombucha phụ thuộc vào hình dạng tiết diện của bình chứa [7]. Nồng độ acid và rƣợu trong kombucha giúp chống nhiễm các nấm mốc trong không khí và các bào tử vi khuẩn. Kết quả là kombucha có thể tƣơng 5 đối dễ dàng lên men trong điều kiện thƣờng. Các vi khuẩn và nấm men trong kombucha cũng sản xuất ra các kháng sinh. Hình 1.1. “Con nấm” Nếu quá trình lên men bị nhiễm, có thể nhận thấy bằng mắt thƣờng nhƣ: trên bề mặt con nấm có xuất hiện màu xanh lá cây, xanh dƣơng hoặc màu đen, mốc trắng hình cầu thì đó có thể là các loài nấm mốc Aspergillus parasiticus, Aspergillus flavus, Penicillium citricum… Các loại nấm mốc trên sẽ sản sinh ra mycotocin, citrinin, aflatoxin… đều là các độc tố có khả năng gây ung thƣ, khi xuất hiện sẽ làm sản phẩm mất giá trị dinh dƣỡng và gây mùi khó chịu. Hình 1.2. Kombucha bị nhiễm nấm mốc 6 1.1.3. Hệ vi sinh vật trong kombucha 1.1.3.1. Acetobacter Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Pseudomonadaceae, phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể phân lập đƣợc các vi khuẩn này từ không khí, đất, nƣớc, lƣơng thực thực phẩm, giấm, rƣợu, bia, hoa quả… Có khoảng 20 loài thuộc giống Acetobacter đã đƣợc phân lập và mô tả, trong đó có nhiều loài có ý nghĩa kinh tế. * Đặc điểm chung của chủng Acetobacter Chủng Acetobacter có dạng hình que, tùy điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, thành phần môi trƣờng nuôi cấy) mà các vi khuẩn Acetobacter có thể sinh ra các tế bào có hình thái khác biệt dạng kéo dài hoặc phình to ra. Kích thƣớc thay đổi tùy loài (0.3-0.6 x 1.0-8.0μm). Có thể di động (có tiên mao đơn hoặc chu mao) hoặc không di động (không có tiên mao). Hiếu khí bắt buộc, chịu đƣợc độ acid cao. Vi khuẩn Acetobacter có khả năng đồng hoá nhiều nguồn thức ăn cacbon khác nhau nhƣng không sử dụng đƣợc tinh bột. Tế bào đứng riêng lẻ hoặc kết thành từng chuỗi. Có khả năng tạo thành váng trên môi trƣờng lỏng, khả năng tạo thành váng thay đổi tùy loại: Acetobacter xylinum: tạo thành váng cellulose khá dày và chắc. Acetobacter orleanoe: tạo thành váng mỏng nhƣng chắc. Acetobacter pasteurianum: tạo thành váng khô và nhăn nheo. Acetobacter suboxydans: tạo thành váng mỏng dễ tan rã. Acetobacter có khả năng đồng hoá muối (NH4)+ và phân giải pepton. Một số loài đòi hỏi một số acid amin nhất định nhƣ acid pantothenic và các chất khoáng K, Mg, Ca, Fe, P, S … Ở dạng muối vô cơ, hữu cơ hoặc hợp chất hữu cơ. Do đó bia, nƣớc mạch nha, nƣớc trái cây… Là nguồn dinh dƣỡng rất tốt cho sự phát triển của vi khuẩn Acetobacter. Ngoài khả năng oxy hoá ethanol thành acid acetic, một số loài Acetobacter còn tổng hợp đƣợc vitamin 7 B1, vitamin B2, oxy hoá sorbit thành đƣờng sorbose (dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin C) . 1.1.3.2. Nấm men * Hình thái và cấu tạo tế bào Tế bào nấm men thƣờng có dạng hình cầu, ovan, elip, hình trụ… kích thƣớc rất lớn gấp từ 5 – 10 lần tế bào vi khuẩn. Kích thƣớc trung bình: Chiều dài: 9 – 10μm, chiều rộng: 2 – 7μm. Hình dạng và kích thƣớc tế bào thay đổi, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau. Nấm men là sinh vật đơn bào, tế bào nấm men cũng nhƣ nhiều loại tế bào khác đƣợc cấu tạo chủ yếu từ các phần cơ bản nhƣ: glucan, protein, lipid và một số thành phần nhỏ khác nhƣ kitin…. Màng nguyên sinh chất: gồm các hợp chất phức tạp nhƣ protein, phospholipit, enzyme permeaza…Chất nguyên sinh: thành phần cấu tạo chủ yếu là nƣớc, protit, gluxit, lipit và các muối khoáng, enzyme và có các cơ quan trong đó. Nhân tế bào và những thành phần cơ quan con khác: không bào, ty lạp thể, riboxom,… * Sự sinh sản của nấm men Nấm men có một số hình thức sinh sản: nảy chồi, phân đôi,sinh sản bằng bào tử và hình thành bào tử (tiếp hợp đẳng giao, tiếp hợp dị giao, sinh sản đơn tính). * Phân loại nấm men Chủ yếu có hai lớp: nấm men thật (Ascomyces) và nấm men giả (Fungi Imporfecti). Lớp nấm men thật (Ascomyces): phần lớn nấm men dùng trong công nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces; Giống Endomyces; Giống Schizosaccharomyces 8 Lớp nấm men giả (Fungi imporfecti): Crytococus (toscula, tornlopsis); Mycoderma; Candida; Geotrichum (đã đƣợc xếp vào lớp nấm mốc); Rhodotorula [8]. 1.1.3.3. Vi khuẩn lactic Vi khuẩn lên men lactic thuộc họ Lactobacterium. Đây là những trực khuẩn, cầu khuẩn không tạo bào tử và hầu hết không di động, hô hấp tùy tiện. Chúng có khả năng lên men nhiều loại đƣờng đơn và đƣờng đôi nhƣng không có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột. Sự phát triển của nó cần sự có mặt của pepton, acid amin hay muối amon. Nhóm vi khuẩn lactic bao gồm nhiều giống khác nhau: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc. Ngày nay ngƣời ta bổ sung vào nhóm vi khuẩn lactic những chủng vi khuẩn thuộc giống Bifidobacterium.. Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà ngƣời ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu và hình que. Kích thƣớc của chúng thay đổi tùy từng loài. Giống Streptococcus có dạng hình tròn hoặc hình ovan, đƣờng kính tế bào 0.5-1µm. Sau khi phân chia theo một phƣơng chúng thƣờng xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc chuỗi ngắn. Giống Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đƣờng kính từ 0.5-0.8µm và chiều dài khoảng 1.6µm. Trong một số điều kiện chúng cũng có dạng hơi tròn, chiều dài khoảng 1-3 µm. Sau khi phân chia chúng hƣờng sắp xếp thành chuỗi, không tạo thành đám tập trung. Giống Lactobacillus có dạng hình que. Tùy vào điều kiện của môi trƣờng sống mà hình dạng của chúng thay đổi từ hình que ngắn đến dài. Sắp xếp thành chuỗi hay đứng riêng lẻ. Giống Pedicoccus là những tứ cầu khuẩn hoặc song cầu khuẩn. Có hoạt tính thủy phân protein rất yếu. 9 Giống Bifidobacterium là những trực khuẩn, khi mới phân lập có thể phân nhánh dạng chữ Y, V và tập hợp thành khối. Sau nhiều lần cấy truyền chúng trở thành dạng trực khuẩn dạng thẳng hoặc hơi uốn cong. Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dƣỡng khác nhau. Chúng không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cơ bản nhƣ cacbon, nitơ, photphat và lƣu huỳnh mà còn có nhu cầu về một số chất cần thiết khác nhƣ vitamin, muối vô cơ…Mỗi loài có khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 80oC vi khuẩn lactic bị tiêu diệt hoàn toàn [13]. 1.1.4. Thành phần hóa học và công dụng của kombucha 1.1.4.1. Thành phần hóa học Theo nghiên cứu của tổ chức The American FAD and CDC tỷ lệ các chất hóa học có trong trà là nhƣ sau: Bảng 1.1. Thành phần hóa học trà kombucha Thành phần Giá trị Đơn vị Acetic acid 2.36 g/l Glyconic acid 0.129 g/l Formic acid 0.109 g/l Oxalic acid 0.01 g/l Caffeine 0.065 g/l Vitamin B1 0.74 g/l Vitamin B6 0.52 g/l Vitamin B12 0.84 g/l Vitamin C 1.51 g/l pH 3.2 10 1.1.4.2. Công dụng của kombucha Kombucha là thành phần có chứa men tiêu hóa, sinh tố và nhiều hợp chất hữu cơ, ngoài ra trà chứa một lƣợng nhỏ cafein vì đƣợc lên men từ các loại trà ( trà xanh, trà ô long, trà đen…). Trà kombucha nếu dùng đúng liều lƣợng và chỉ định sẽ có lợi ích rất tốt đối với sức khỏe: Tăng sức chịu đựng dẻo dai, bền bỉ đƣợc xem nhƣ một loại thuốc bổ, giảm đau cơ và triệu chứng mệt mỏi; tăng số lƣợng vi khuẩn bifida có lợi trong ruột nhờ sản sinh acid lactic, vi khuẩn này tác động giống nhƣ vi khuẩn acidophilus thƣờng có trong các loại sữa chua lên men; trà kombucha sản sinh hai loại acid lactic và acid axetic giúp tăng nhanh quá trình lên men trong ruột, giúp ngừa táo bón, nhiễm trùng đƣờng ruột, kiết lỵ, rối loạn tiêu hóa chữa viêm loét, dạ dày; cải thiện làn da, tăng tính đàn hồi của da, làm da tƣơi sáng hơn, chữa vảy nến, chàm, mụn nƣớc, mụn cóc, viêm da, sừng da và giúp mọc tóc nhiều hơn; giải độc cơ thể nhờ acid glycuronic kết hợp với các độc tố trong gan và làm chúng dễ tan trong nƣớc, sau đó bài tiết qua đƣờng tiểu; chữa đau khớp, sản phẩm chuyển hóa của acid glycuronic là glucosamin rất tốt cho hệ keo giúp bôi trơn các khớp xƣơng và sụn nhất là ở những ngƣời lớn tuổi hay bị đau khớp; tác dụng kháng sinh, trà còn sản sinh acid usnic, có thể chống lại các vi trùng gây bệnh nhƣ treptococci, diplococci, flexner và shigella, giúp cân bằng hệ acid bazo cho cơ thể khi chúng ta ăn uống không đúng cách; chống trầm cảm chữa chứng thiếu ngủ; giúp tăng thị lực, chữa quáng gà, chảy nƣớc mắt và chứng đục thủy tinh thể ở ngƣời cao tuổi. Trà còn giải cơn nghiền rƣợu cho ngƣời có thói quen uống rƣợu [15]. Những lưu ý Với những bệnh nhân trong giai đoạn điều trị ung thƣ do xạ trị hoặc hóa trị, nếu dùng trà cần sự giám sát của thầy thuốc; do trà chứa quá nhiều acid lactic, uống trong một thời gian dài có thể dẫn đến đau khớp, chóng mặt 11 và viêm xoang; trẻ em có thể dùng nhƣng liều lƣợng thay đổi theo tuổi, cân nặng và quan trọng cần phải đƣợc pha loãng với nhiều nƣớc; phụ nữ có thai không nên dùng vì có đến 1% lƣợng cồn trong nƣớc trà. Không nên uống trong thời gian cho con bú vì gây đau bụng cho trẻ sơ sinh; ngƣời tiểu đƣờng chỉ nên dùng trà đang lên men vì hầu hết lƣợng đƣờng bị biến đổi, tuy nhiên nếu ủ men trà với quá ít đƣờng (dƣới 50 gam/lít) thì khó xuất hiện các đặc tính hữu ích của trà kombucha, vì vậy ngƣời tiểu đƣờng cũng không nên uống nhiều; trà kombucha gây loãng máu, cần giảm liều và chú ý ngƣng một tuần trƣớc khi phẫu thuật, phụ nữ bị rong kinh cũng cần thận trọng và nên ngƣng sử dụng trƣớc kinh kỳ tối thiểu một tuần [16]. Những ngƣời bị bệnh lý về dạ dày nên thận trọng khi sử dụng vì có thể làm bệnh tăng lên; không nên dùng nhiều vào buổi sáng đặc biệt khi đói dễ gây viêm loét dạ dày, đã có khá nhiều trƣờng hợp sau khi sử dụng có bệnh lý viêm loét dạ dày nên ngƣời sử dụng cần lƣu ý độ đạm, độ chua khi sử dụng để tránh gây phản tác dụng; do tính chất của nuôi thủy sâm là dùng đƣờng nên những ngƣời có vấn đề về đƣờng huyết cần lƣu ý, một số tài liệu có nói tác dụng của thủy sâm điều hòa đƣờng huyết nhƣng trên thực tế sau khi sử dụng đã có nhiều trƣờng hợp bị tăng đƣờng huyết do trong nƣớc có nhiều đƣờng. Thủy sâm không phải là thuốc, đó chỉ là một loại đồ uống thông thƣờng, tùy theo thể trạng sức khỏe mỗi ngƣời sử dụng với liều lƣợng khác nhau để đạt kết quả tốt nhất [17]. 1.2. Tình hình nghiên cứu về kombucha trên thế giới và ở Việt Nam 1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Trên thế giới kombucha đã đƣợc sản xuất trên quy mô công nghiệp và đã có khá nhiều các công trình nghiên cứu liên quan. Đầu tiên phải kể đến các bài báo, các nghiên cứu về tác dụng của kombucha và các nghiên cứu sinh hóa: Bacinskaja (1914) và cộng sự cho rằng kombucha tốt cho hệ tiêu hóa, điều chỉnh các hoạt động đƣờng ruột, đặc biệt 12 là chống táo bón. Đến năm 1927, Madaus đã có những nghiên cứu và đƣa ra kết luận nấm kombucha và các sản phẩm chuyển hóa của nó có tác động tích cực trong việc tái sinh vách tế bào, một phƣơng thuốc tuyệt vời cho bệnh xơ vữa động mạch. Vào năm 1987, Veronika Carstens trong nghiên cứu của mình đã chỉ ra: kombucha có tác dụng giải độc cơ thể, cải thiện chức năng hệ miễn dịch. Reiss, J. (1994) đã tìm hiểu ảnh hƣởng của các loại đƣờng khác nhau lên quá trình trao đổi chất của nấm trà. Năm 2006, K.H. Steinkraus và cộng sự đã có những nghiên cứu về hoạt động kháng sinh của trà nấm kombucha. Năm 2007, Velicanski và cộng sự đã cho biết hoạt động kháng khuẩn và chống oxy hóa của kombucha. Jayabalan R. và cộng sự (2010) đã nghiên cứu về đặc điểm sinh hóa của nấm trà. Cavusoglu K., Gluer P. (2010) đã phát hiện tác dụng bảo vệ của nấm trà kombucha trên nhiễm sắc thể gây ra bởi bức xạ gamma trong tế bào bạch huyết ngoại vi của con ngƣời trong ống nghiệm. Yapar K và cộng sự (2010) đã có những nghiên cứu về tác dụng bảo vệ của nấm trà kombucha đối với chuột bạch tạng bị nhiễm độc do phenol. Các nghiên cứu về định danh các chủng vi sinh vật trong kombucha và ứng dụng của các chủng đƣợc phân lập từ kombucha cũng đã có từ rất lâu: Từ năm 1928, Hermann đã định danh hai chủng Bacterium xylinum và B. xylinoides và B. gluconicum. Các nhà nghiên cứu còn xác định đƣợc kombucha là một sự hợp tác cộng sinh giữa Bacterium xylinum cùng các vi khuẩn khác, với những tế bào nấm men thuộc chủng Saccharomyces, tạo thành một khối nhƣ tổ chim. Vào năm 1973, List và cộng sự đã phân lập đƣợc Acetobacter ketogenum; Pichia fermentans; Saccharomyces apiculatus; S.ludwigli; B.xylinoides; Schizosaccharomyces pombe từ dịch nuôi cấy kombucha. Năm 2001, Kurtzman CP. và cộng sự đã phân lập đƣợc một chủng nấm men mới từ kombucha và đặt tên là Zygosaccharomyces kobuchaensis. Vào năm 2006, Dutta D. và cộng sự đã có công trình nghiên cứu về khả năng 13 cố định đạm của chủng Acetobacter nitrogen nifigens sp.nov đƣợc phân lập từ trà kombucha. Đến năm 2007, Dutta D. và cộng sự đã có công trình nghiên cứu về khả năng cố định đạm và sản xuất cellulose của Gluconacetobacter kombucha sp.nov đƣợc phân lập từ kombucha .Nguyen Vu Tuan, Flanagan và cộng sự vào năm 2008 đã có những nghiên cứu về đặc tính của màng BC bởi chủng Gluconacetobacter xylinus phân lập từ kombucha [7]. Nghiên cứu về kombucha trên thế giới rất phong phú, đa dạng. Mặc dù vậy, những nghiên cứu về các chủng vi sinh vật lên men kombucha hầu nhƣ là rất ít, không đầy đủ. 1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Kombucha chƣa đƣợc phổ biến trong cuộc sống của ngƣời dân, kombucha mới chỉ đƣợc lên men tại các hộ gia đình từ các nguồn nguyên liệu khác nhau nhƣ trà xanh, trà lipton…còn rất thủ công và đơn giản. Theo Vũ Văn Chuyên thì từ năm 1969 ở Hà Nội đã phổ biến dùng nƣớc thủy hoài sâm để bồi dƣỡng và phục hồi sức khỏe, chống lại bệnh tật. Từ năm 1994 đến nay, ở tỉnh Bình Định và một số nơi khác ở miền Nam đang lƣu hành một loại nƣớc uống có tính chất giải khát đặt tên là “Trà giấm” có tác dụng bồi bổ, tăng cƣờng sức khỏe, làm cho ăn ngon miệng, ngủ yên giấc và chữa đƣợc nhiều bệnh, nhất là bệnh huyết áp cao, chứng mất ngủ. Theo Nguyễn Lân Dũng: kombucha là một dạng cộng sinh giữa nấm men và vi khuẩn sinh acid gluconic. Sản phẩm này có thể tự nhân giống bằng nƣớc chè đƣờng, có lợi cho sức khỏe tƣơng đƣơng nhƣ sữa chua. Nhiều công bố đã nói về tác dụng chữa bệnh hiểm nghèo nhƣng không có cơ sở khoa học. Uống chỉ có lợi cho sức khỏe, nhất là cho đƣờng tiêu hóa, không có tác hại gì.Tác giả Dƣơng Trọng Hiếu: “ Thủy sâm thực ra là con dấm lên men từ bã chè, muốn làm thì chỉ cần bã chè và nƣớc chè lên men khoảng 1 tuần. Nhờ quá trình lên men nên nƣớc chè ban đầu có vị chát sẽ trở thành chua chua. 14 Đây là đồ uống đã có từ lâu. Có thể vì ngƣời dân muốn thể hiện là cái gì quý nên gán cho có chữ sâm, thống kê có 54 cây có tên là sâm, nhƣng không phải là loại sâm nào cũng tốt. Muốn khẳng định tác dụng một loại đồ ăn, thức uống nào tốt hay không tốt cho sức khỏe cần phải thông qua nghiên cứu, đánh giá khoa học. Nếu có kinh nghiệm chỉ là kinh nghiệm cá nhân. Chƣa có nghiên cứu thì không thể đƣa ra chỉ định hay chống chỉ định. Không thể có một thức uống hay đồ ăn tốt cho tất cả mọi ngƣời. Ở Việt Nam chƣa có đánh giá nào về vấn đề này, nên ngƣời uống cũng phải cảnh giác, vì nó là nấm. Không nên uống quá nhiều và thƣờng xuyên để có thời gian đào thải” [18]. Phan Đức Bình, phó chủ tịch Hội Bảo vệ ngƣời tiêu dùng TP HCM cho biết, những quảng cáo kiểu trà kombucha có khả năng “cải lão hoàn đồng, tái tạo tóc, ngừa ung thƣ, trị bá bệnh...” đều không có những bằng chứng xác thực. Thực tế, trà dƣỡng sinh kombucha xuất phát từ một loại nƣớc uống chế tạo từ rong biển tại Nhật Bản sau đó lan truyền sang Ấn Độ, Nga và các nƣớc Đông Âu… ngƣời ta lấy trà để thay thế rong biển. Nghiên cứu cho thấy, nó hoàn toàn không có khả năng trị bệnh, thậm chí có thể nguy hại nếu chế biến không đảm bảo hoặc sử dụng nhiều. Dƣợc sĩ Bình khuyến cáo, không nên uống nhiều kombucha bởi độ chua của kombucha cao, có thể làm ảnh hƣởng đến đƣờng tiêu hóa, nhất là ngƣời viêm loét dạ dày, nhạy cảm với chất chua. Hơn nữa, việc ăn, uống quá nhiều acid lactic cũng có hại cho sức khỏe, thậm chí còn gây ung thƣ [19]. Vũ Quốc Trung - hội viên hội Đông Y Việt Nam: “Thủy sâm thực chất chỉ là một loại nƣớc uống đơn giản, nó đƣợc lên men từ trà và nƣớc đƣờng, tạo ra con giống gần nhƣ con giấm. Nó có vị chua nhƣ giấm. Vì có vị chua nên ngƣời ta thƣờng sử dụng trong việc giảm cân là chủ yếu”. Nguyễn Xuân Hƣớng, nguyên Chủ tịch Hội đông y Việt Nam cho biết: Khoảng những năm 1968 -1970, ở Bắc Kinh, Trung Quốc đã rộ lên phong trào nuôi thủy sâm, còn có tên là tiểu cầu tảo, hay thủy cầm sâm. Nó nhƣ một 15 loại con dấm. Tuy nhiên, điều đáng chú ý là sau một thời gian nuôi và uống thủy sâm thì có hiện tƣợng nhiều ngƣời bị men gan cao không rõ nguyên nhân, khám 20 bệnh nhân thì 15 ngƣời bị men gan cao. Sau đó, ngƣời ta bắt đầu bỏ, kết thúc một thời kỳ nuôi thủy sâm ở Bắc Kinh. Năm 2001, khi sang Quảng Tây, cũng thấy đang rộ lên phong trào này, lúc đó ngƣời ta gọi là hải sâm, thầy giáo ở trƣờng ĐH Trung y, trung dƣợc Bắc Kinh - Thầy Vũ Trạch Dân, cho hay: Chỉ là đồn đại ngoài dân gian, còn sách vở Trung y chính thống không thấy nói, trong các bệnh viện cũng không ai dùng”. Theo tác giả Nguyễn Xuân Hƣớng, hiện nay khi trong đời sống hàng ngày rộ lên những phong trào nuôi và uống thủy sâm rộng rãi nhƣ vậy, Bộ Y tế cần tiến hành nghiên cứu và cung cấp tới ngƣời dân những thông tin chính thống về thành phần và mức độ tác dụng của loại nƣớc uống này, nhằm tránh những lạm dụng. Lê Kim Phụng, Trƣờng Đại học Y dƣợc TP HCM, ngƣời đã có một số bài viết về thủy sâm, cho biết: "Hiện nay ở nƣớc ta đang xuất hiện một loại thuốc bổ ở dạng lỏng nhƣ trà mà mọi ngƣời gọi là trà "thủy sâm", thực ra đây chính là một loại thức uống có từ rất lâu đƣợc gọi tên là "The Remedy for Immortality", nghĩa là "Phƣơng thuốc Trƣờng sinh". Theo tác giả Lê Kim Phụng, lợi ích từ trà thủy sâm rất nhiều". Hầu hết những ngƣời uống trà kombucha sẽ thấy khỏe hơn sau một tháng hoặc sớm hơn, rõ rệt nhất là sự gia tăng năng lƣợng, giúp nam nữ cải thiện chức năng sinh dục và cải thiện làn da, làm tăng tính đàn hồi cho da, giúp tóc mọc dày hơn, gia tăng thị lực, cải thiện vị giác, giải độc cơ thể, nhiều ngƣời cho biết những bệnh mạn tính khó chữa nhƣ viêm khớp, thấp khớp, chàm, tổ đỉa, vẩy nến, dị ứng, mệt mỏi kinh niên, rối loạn tiêu hóa, huyết áp cao, thiểu năng tuần hoàn não, trầm cảm, thiếu ngủ, cholesterol cao và ngay cả bệnh ung thƣ cũng thấy thuyên giảm rõ rệt khi họ sử dụng trà kombucha". Đây là một dạng cộng sinh giữa nấm men 16 và vi khuẩn sinh acid gluconic. Có thể tự nhân giống bằng nƣớc chè đƣờng. Có lợi cho sức khỏe tƣơng đƣơng nhƣ sữa chua, nhất là cho đƣờng tiêu hóa, không có tác hại gì [20]. Phạm Công Thành, Viện Công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm, ĐH Bách khoa Hà Nội: Tất cả các loại thực phẩm đều có tác dụng nhất định (kể cả uống nƣớc lọc, ăn rau xanh…). Nếu để lên men thì sinh ra men lactic, tạo ra axit axetic có lợi cho tiêu hóa. Cần phải biết trà giấm tạo ra chất gì, chất này vào trong cơ thể con ngƣời với lƣợng bao nhiêu là vừa phải. Để khẳng định công dụng của nó, cần có công trình nghiên cứu khoa học chứng minh đƣợc điều đó [21]. Lê Thị Huệ (2013), Nghiên cứu một số chủng vi khuẩn lên men kombucha từ trà Thái Nguyên. Trong đề tài này đã nghiên cứu ảnh hƣởng của yếu tố môi trƣờng và dinh dƣỡng đến khả năng lên men kombucha. Công dụng của kombucha vẫn chỉ là những thông tin đƣợc truyền miệng, chƣa có công trình nghiên cứu chính thống nào nói về tác dụng thật sự của kombucha, tuy nhiên qua nhiều thế kỷ số lƣợng ngƣời sử dụng loại trà này trên thế giới ngày càng tăng là một minh chứng cho thấy trà kombucha đã mang lại các lợi ích rõ ràng. Nhƣ vậy, có thể thấy các nghiên cứu về kombucha ở Việt Nam còn rất mới mẻ. Chủ yếu là các nghiên cứu về tác dụng của kombucha. Các nghiên cứu chuyên sâu về lĩnh vực này rất ít, đặc biệt tài liệu nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men trà kombucha còn rất hạn chế. 17 CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1. Mẫu thực vật Cây trà xanh Bộ phận sử dụng: lá trà Địa điểm thu mẫu: tỉnh Phú Thọ 2.1.2. Mẫu vi sinh vật Các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc từ trà Phú Thọ. 2.1.3. Dụng cụ và thiết bị Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức) Nồi hấp Tommy (Nhật) Box vô trùng (Haraeus) Cân (Precisa XT 320M- Thụy Sĩ) Kính hiển vi quang học Tủ lạnh Daewoo, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, lamen, đèn cồn…và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác. 2.1.4. Hóa chất Hóa chất là các chất đƣợc sử dụng nhƣ : KH2PO4, MgSO4.7H2O, CaCO3, (NH4)2SO4, H2SO4, Glucose, Sacarose, Lactose, thạch agar… 2.1.5. Phạm vi nghiên cứu Các chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ. 2.1.6. Thời gian, địa điểm nghiên cứu Thời gian: tháng 6 năm 2014 đến tháng 3 năm 2015 Địa điểm: phòng thí nghiệm vi sinh trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2. 2.1.7. Các loại môi trường 18 Bảng 2.1. Các loại môi trƣờng sử dụng STT Thành phần Môi trƣờng phân lập (g/l) VK NM Môi trƣờng nhân Môi trƣờng lên giống (g/l) VK men (g/l) NM 1 Trà Phú Thọ 20 2 Glucose 20 50 20 50 3 KH2PO4 2 3 2 3 4 MgSO4.7H2O 2 2 2 2 5 (NH4)2SO4 3 2 3 2 6 Pepton 4 10 4 10 7 Agar 20 15-20 8 CaCO3 5 9 saccarozo 100 Các thành phần của môi trƣờng đƣợc hòa tan trong 1000ml nƣớc cất. Môi trƣờng phân lập và nhân giống của vi khuẩn đƣợc bổ sung acid acetic 2%, rƣợu etylic 2% sau khi thanh trùng. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp vi sinh 2.2.1.1. Phương pháp phân lập Tiến hành phân lập trên các hộp petri để chọn một tập hợp vi sinh vật lên men trà kombucha. Sử dụng môi trƣờng nhƣ bảng trên. Cách làm: môi trƣờng phân lập đƣợc khử trùng và đƣợc phân bố vào các hộp vô trùng petri để nguội theo phƣơng pháp Pasteru. Dịch trà kombucha đƣợc pha loãng từ 10-1 -10-9 bằng nƣớc cất.Lấy dịch lên men kombucha lắc 19 đều bằng máy vontex trong 10 phút thu đƣợc huyền phù vi sinh vật. Dùng đĩa petri đã vô trùng nhỏ 1,2 giọt huyền phù với độ pha loãng từ 10-5-10-7 lên bề mặt thạch rồi dùng bàn trang vô trùng dàn đều. Gói kín lại và nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 28-30oC trong 2-3 ngày. Sau 2-3 ngày, dựa vào sự khác nhau của hình thái khuẩn lạc tiến hành tách một số khuẩn lạc đặc trƣng ra khỏi môi trƣờng phân lập, cấy thuần sau đó chuyển sang thạch nghiêng bảo quản trong tủ 4oC [10]. 2.2.1.2. Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram Nhuộm Gram: Là phƣơng pháp nhuộm sử dụng hai hay nhiều loại thuốc nhuộm trên một tiêu bản nhằm quan sát và định loại tế bào dựa trên khả năng hình thành trong tế bào hợp chất bền vững của protit đặc biệt với thuốc nhuộm kiềm và iot. Để tiến hành phƣơng pháp nhuộm Gram cần lấy mẫu từ các chủng đã qua sơ tuyển làm tiêu bản. Khi đó tùy vào màu của tiêu bản thu đƣợc giúp ta phân biệt đƣợc vi khuẩn Gr- hay Gr+. Cơ sở khoa học của các bƣớc nhuộm Gram nhƣ sau: Bƣớc nhuộm màu cơ bản bằng thuốc nhuộm tím Gential violet tất cả các vi khuẩn đều bắt màu tím. Nhuộm tăng cƣờng bằng dung dịch Lugol thuốc nhuộm này kết hợp với thuốc nhuộm Gential violet thành phức hợp bền màu hơn ở các vi khuẩn G+. Tẩy màu dùng chất tẩy màu (thƣờng là cồn 90%) tổ hợp Gential violet và dung dịch Lugol. Ở thành tế bào G- thì liên kết giữa tổ hợp thuốc nhuộm này lỏng lẻo hơn ở vi khuẩn Gram+ nên dễ bị rửa trôi.Nhuộm phân biệt bằng thuốc nhuộm khác (Fuchsin) nhằm nhuộm các tế bào đã tẩy màu thành một màu tƣơng phản với màu tím để dễ phân biệt. Sau khi nhuộm kép tế bào bắt màu hồng thì đó là vi khuẩn Gr- , bắt màu tím là vi khuẩn Gr+ . Vi khuẩn Gr- không có khả năng giữ màu này nên dễ bị rửa trôi bởi cồn. Chỉ khi nhỏ Fucshin vi khuẩn Gr- mới bắt màu hồng của Fucshin 20 Nhuộm đơn: Là nhuộm tế bào bằng một loại thuốc nhuộm. Toàn bộ tế bào bị bắt màu đậm của thuốc nhuộm đó. Bởi vậy, cách nhuộm này thƣờng dùng để quan sát hình dạng tế bào vi sinh vật. Tiến hành làm vết bôi vi sinh vật, sau đó nhỏ một, hai giọt fuchsin để hai phút, hong khô tiêu bản, lên kính. Soi tiêu bản dƣới vật kính dầu và kính hiển vi quang học Olympus CH-2 (độ phóng đại 1000 lần) [10]. 2.2.1.3. Phương pháp đếm số lượng tế bào trên thạch đĩa Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa vi sinh vật, pha loãng theo phƣơng pháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1 ml pha loãng rồi trang đều trên môi trƣờng thạch đĩa. Nuôi ở 30oC sau 3 ngày đếm số khuẩn lạc (CFU) trong môi trƣờng đĩa petri, từ đó xác định số lƣợng tế bào vi sinh vật trong 1ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức: N= A. 1 1000 . n 100 10 Trong đó: N- tổng số CFU trong 1ml dịch nuôi cấy ban đầu A- Số CFU trung bình đếm đƣợc trên mỗi đĩa petri 10-n - độ pha loãng dịch nuôi cấy 2.2.1.4. Bảo quản chủng giống Các khuẩn lạc sau khi phân lập và cấy chuyển sang môi trƣờng giữ giống trong ống thạch nghiêng, nuôi 2 ngày trong tủ ấm 30oC. Sau đó giữ trong tủ lạnh 4oC dùng cho nghiên cứu tiếp theo. Cấy chuyền giữ giống trên thạch nghiêng định kỳ mỗi tháng một lần. 2.2.1.5. Phương pháp hoạt hóa Giống từ ống nghiệm đƣợc bảo quản trong tủ lạnh, trƣớc khi đem sử dụng phải hoạt hóa giống, nhân giống đảm bảo đủ số lƣợng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men. Phƣơng pháp hoạt hóa giống sử dụng môi trƣờng tiêu chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 121oC trong 20 phút. Sau 21 đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy chuyền giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ. 2.2.1.6. Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men Xác định hoạt lực lên men của mẫu nấm men đã đƣợc phân lập và tuyển chọn thông qua xác định hàm lƣợng CO2 thoát ra (g/l dịch lên men) bằng phƣơng pháp cân bình trọng lƣợng. Hàm lƣợng CO2 thoát ra càng nhiều thì chứng tỏ hoạt lực lên men càng tốt. Phƣơng pháp cân bình trọng lƣợng: Dịch đƣợc lên men trong các bình có cùng thể tích 250 ml môi trƣờng, có cùng một lƣợng tế bào nấm men của các giống khác nhau. Sau 24h lên men đem cân trọng lƣợng chênh lệch giữa 2 lần cân là 0,1 thì dừng lại [9]. 2.2.1.7. Xác định khả năng kết lắng của nấm men Hòa sinh khối nấm men vào dung dịch đệm axetat (có pH: 4,5) đƣợc đựng trong các ống nghiệm có hình dạng và kích thƣớc nhƣ nhau với thể tích của dung dịch đệm và số lƣợng nấm men hoàn toàn bằng nhau. Lắc kỹ trên máy với tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 5 phút, để lắng 12h. Lúc này toàn bộ khối dịch phân thành hai lớp (phía dƣới đáy của ống nghiệm là nấm men đã kết lắng). Tiến hành đo chiều cao lớp kết lắng của chủng nấm men trong từng ống nghiệm để xác định khả năng kết lắng của chủng nấm men. Ống nghiệm nào có chiều cao kết lắng cao nhất là chủng nấm men có độ kết lắng tốt nhất. 2.2.2. Phương pháp hóa sinh 2.2.2.1. Phát hiện khả năng oxy hóa acid acetic Sử dụng môi trƣờng sau để thử khả năng oxy hoá acid acetic của vi khuẩn tuyển chọn [4]. Thành phần (g/l): Cao nấm men : 10g Thạch : 20g 22 Canxi acetat: 10g Nƣớc máy: 1000ml pH : 7,0-7,2 Quan sát hiện tƣợng nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải canxi là phản ứng dƣơng tính, ngƣợc lại là âm tính. 2.2.2.2. Phát hiện hoạt tính catalase Nhỏ một giọt H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc, nếu thấy hiện tƣợng sủi bọt khí thì chủng vi khuẩn đó đƣợc coi là có hoạt tính catalase, ngƣợc lại chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính catalase. 2.2.2.3. Phát hiện khả năng tổng hợp xenlulose Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng dịch thể ở nhiệt độ 28-30oC trong vòng 3-4 ngày, quan sát sự hình thành màng. Kiểm tra khả năng bắt màu của màng bằng cách nhỏ lên đó dung dịch lugol và H2SO4 60% nó chuyển hóa thành màu xanh lam. 2.2.2.4. Phương pháp xác định khả năng tổng hợp acid bằng chuẩn độ với NaOH 0,1N có phenolphtalain 0.1% làm chỉ thị Cho vào cốc thủy tinh (loại 100ml hoặc 200ml) dịch lên men, thêm vào đó 1-2 giọt phenolphtalein 0,1% chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N. Chú ý chuẩn độ cần phải lắc nhẹ đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt. Sau đó tính số gam acid tổng số trong 100ml dung dịch lên men theo công thức; X= (V.K.100)/10 (g/ml) Trong đó X: Số gam acid tổng số trong 100ml dung dịch lên men V: Số ml NaOH 0,1n dùng để chuẩn độ 10ml dung dịch lên men K: Lƣợng acid tổng số tƣơng ứng với 1ml NaOH 0,1N (K=0,06) 10: Số ml dịch lên men đem chuẩn độ. 2.2.3. Phương pháp cảm quan Sử dụng cơ quan cảm giác của con ngƣời để tìm hiểu mô tả và định lƣợng các chất cảm quan vốn có của thực phẩm.Cảm quan kombucha đƣợc đánh giá trên một số chỉ tiêu ở bảng 2.2. 23 Bảng 2.2. Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của Kombucha Tên chỉ tiêu Điểm chƣa có trọng lƣợng Yêu cầu 1 2 3 5 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục và vật thể lạ nhỏ, mầu hoàn toàn đặc trƣng cho sản phẩm 4 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục, có ít vật thể lạ nhỏ, mầu đặc trƣng cho sản phẩm. 3 Chất lỏng trong, có tƣơng đối nhiều vật thể lạ nhỏ, màu hơi khác một ít so với màu đặc trƣng của sản phẩm. 2 Chất lỏng hơi đục, có khá nhiều vật thể lạ nhỏ thô trầm trọng, màu khác nhiều so với màu đặc trƣng của sản phẩm. 1 Chất lỏng đục nhiều lắng cặn, có nhiều vật thể lạ nhỏ trầm trọng, thô, màu không đặc trƣng cho sản phẩm. 0 Vẩn đục, màu bẩn, sản phẩm bị hỏng 5 Hòa hợp, thơm dịu, hoàn toàn đặc trƣng cho sản phẩm. 4 Chƣa hoàn toàn hòa hợp, thơm đặc trƣng cho sản phẩm nhƣng hơi khó nhận thấy. 3 Hơi nồng, thoảng mùi phụ, ít đặc trƣng cho sản phẩm 2 Nồng, thoảng mùi lạ, rất ít đặc trƣng cho sản phẩm 1 Nồng, hăng, mùi lạ rõ, không đặc trƣng cho sản phẩm 0 Có mùi lạ khó chịu của sản phẩm hỏng. 5 Hòa hợp, êm dịu, hoàn toàn đặc trƣng cho sản phẩm 4 Chƣa hoàn toàn hòa hợp, đặc trƣng cho sản phẩm bình thƣờng. 3 Chƣa hòa hợp, hơi gắt và xốc, ít đặc trƣng cho sản phẩm. 2 Đắng, xốc, thoảng vị lạ, rất ít đặc trƣng cho sản phẩm 0 Có vị lạ khó chịu của sản phẩm bị hỏng Độ trong và màu sắc Mùi Vị Bảng 2.3. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu Số thứ tự 1 2 3 Chỉ tiêu Hệ số quan trọng Độ trong và màu sắc Mùi Vị 0,8 1,2 2,0 Tổng cộng 4,0 24 Bảng 2.4. Bảng quy định đánh giá mức độ chất lƣợng sản phẩm Yêu cầu tối thiểu về điểm trung bình chƣa có trọng lƣợng của hội đồng cảm quan STT Mức chất lƣợng Số điểm chung 1 Loại tốt 18,6 – 20,0 2 Loại khá 15,2 – 18,5 3 Loại trung bình 11,2 – 15,1 Mỗi chỉ tiêu : 2,8 4 Loại kém 7,2 – 11,1 Mỗi chỉ tiêu : 1,8 5 Loại rất kém 4,0 – 7,1 Mỗi chỉ tiêu : 1,0 6 Loại hỏng 0 – 3,9 Mỗi chỉ tiêu nhỏ hơn 1,0 Mùi : 4,8 Vị : 4,8 Mùi : 3,8 Vị : 3,8 2.2.4. Phương pháp toán học Xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phƣơng pháp trong sách “Thống kê và ứng dụng” nhƣ: Số trung bình cộng: dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm: 1 n X   Xi n i 1 Trong đó: X: trung bình tổng thể Xi : giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ lần 1 đến lần thứ n n: số lần thí nghiệm n Trung bình bình phƣơng các sai lệch:   25 (X i 1 i  X )2 n 1 Trong đó: δ: độ lệch chuẩn Xi : giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ lần 1 đến lần thứ n X: trung bình tổng thể Sai số đại diện của trung bình cộng:  m  Hệ số biến thiên (Cv%): Cv%=  n  .100% X Trong đó: Cv: hệ số biến thiên của trung bình tổng thể δ: độ lệch chuẩn X: trung bình tổng thể [2]. 26 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ Nguyên liệu sử dụng là trà Phú Thọ và đƣờng để sản xuất kombucha. Trƣớc hết cần đun sôi 1000ml nƣớc, bổ sung 20g trà để trong thời gian 5 phút. Sau đó lọc lấy dịch trà đổ vào bình thủy tinh sạch, thêm 100g đƣờng khuấy đều, để nguội, bổ sung dung dịch giống hoặc con nấm kombucha. Sau 7 ngày ở 28oC ta thu đƣợc kombucha, bao gồm dịch trà đƣờng lên men và miếng thạch nổi lên trên bề mặt. Dùng vải sạch lọc lấy dịch, tiến hành phân lập. Môi trƣờng phân lập nấm men và môi trƣờng phân lập vi khuẩn đƣợc thanh trùng theo phƣơng pháp Pasteur sau đó đƣợc phân vào các đĩa petri đã vô trùng. Dịch kombucha đƣợc pha loãng từ 10-1 – 10-9, dùng pipet lấy 1 ml dịch huyền phù ở các nồng độ pha loãng khác nhau, mở hé đĩa petri nhỏ vào đó từ 1 – 2 giọt, dùng bàn trang vô trùng nhẹ nhàng dàn đều thể tích đó khắp bề mặt môi trƣờng. Nuôi trong tủ ấm 30oC trong thời gian khoảng 2 - 3 ngày. 3.1.1. Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ Sau 2-3 ngày kiểm tra đĩa petri. Kết quả phân lập cho thấy tỉ lệ nấm men có trong kombucha khá phong phú: Ở nồng độ pha loãng 10-3 phân lập đƣợc 5 chủng nấm men; nồng độ pha loãng 10-4 phân lập đƣợc 6 chủng nấm men; Ở nồng độ pha loãng 10-5 phân lập đƣợc 3 chủng nấm men; Ở nồng độ pha loãng 10-6 phân lập đƣợc 2 chủng nấm men. Ở nồng độ 10-7, 10-8, 10-9 số lƣợng khuẩn lạc ít nên lựa chọn không đảm bảo tính khách quan. Ở nồng độ 10-1, 10-2 số lƣợng khuẩn lạc quá lớn không chọn đƣợc chủng. Dựa vào đặc điểm hình thái, màu sắc và kích thƣớc khuẩn lạc trên đĩa petri và hình thái tế bào các chủng nấm men trên kính hiển vi quang học, thu đƣợc 4 chủng nấm men, đƣờng kính khuẩn lạc từ 1-3,5mm. Kết quả phân lập thể hiện ở bảng 3.1. 27 Bảng 3.1. Kết quả phân lập các chủng nấm men STT Tên chủng Kích thƣớc khuẩn lạc (mm) Đặc điểm khuẩn lạc Khuẩn lạc dạng tròn, màu trắng ngà. 1 2 3 4 N1 N2 N3 N4 1-1,5 1,5-2,5 Khuẩn lạc dạng tròn, màu trắng ngà, bề mặt khuẩn lạc trơn bóng. 2-3,5 Khuẩn lạc dạng tròn, màu trắng đục, bề mặt khuẩn lạc lồi, kích thƣớc đồng nhất. 1,5-2,5 Khuẩn lạc dạng tròn, màu trắng đục, bề mặt khuẩn lạc ƣớt. 28 Hình ảnh 3.1.2. Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ Môi trƣờng phân lập vi khuẩn đƣợc acid hóa bằng acid acetic góp phần ức chế sự phát triển của các chủng vi sinh vật khác. Tuy nhiên có nhiều chủng vi khuẩn có thể sống trong môi trƣờng có độ pH thấp. Sau 2-3 ngày kiểm tra các đĩa petri, kết quả thu đƣợc 5 chủng vi khuẩn có hình dạng, màu sắc khác nhau. Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc một số chủng vi khuẩn phân lập STT 1 2 3 Tên Kích thƣớc chủng khuẩn lạc (mm) V1 V2 V3 1-1,5 2-3,5 1-1,5 Đặc điểm khuẩn lạc Khuẩn lạc màu vàng, khô, rìa ngoài bằng phẳng. Khuẩn lạc màu trắng đục, bóng, nhầy, bề mặt khuẩn lạc nhô cao hình chóp nón. Khuẩn lạc màu cam, nhầy nhớt, bề mặt khuẩn lạc không nhô cao. 29 Hình ảnh 4 V4 5 V5 2-3,5 2-4 Khuẩn lạc màu trắng trong, bóng và nhầy nhớt, bề mặt khuẩn lạc nhô cao. Khuẩn lạc màu trắng đục, có nhân tròn ở giữa, bề mặt khô, rìa ngoài có răng cƣa. Như vậy, từ nguồn nguyên liệu là trà Phú Thọ phân lập được4 chủng nấm men N1, N2, N3, N4,, 5 chủng vi khuẩn V1, V2, V3, V4, V5 chọn làm đối tượng cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.2. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ 3.2.1. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ Bƣớc 1: Quan sát hình thái tế bào chủng nấm men trên kính hiển vi quang học Từ các mẫu trên, tiến hành nhuộm đơn 4 chủng nấm men phân lập đƣợc. Kết quả quan sát thấy tế bào nấm men có hình ovan, hình thuôn nhọn 2 đầu, sinh trƣởng theo kiểu nảy chồi và phân cắt. 30 Hình 3.1. Hình thái tế bào chủng Hình 3.2. Hình thái tế bào chủng nấm men N1 (x1000 lần) nấm men N2 (x1000 lần) Hình 3.3. Hình thái tế bào chủng Hình 3.4. Hình thái tế bào chủng nấm men N4 (x1000 lần) nấm men N3 (x1000 lần) Nấm men có vai trò quan trọng trong quá trình lên men kombucha và chất lƣợng của kombucha. Vì vậy, khi tuyển chọn cần lấy đƣợc chủng tốt nhất dựa vào một số chỉ tiêu nhƣ: Có hoạt lực lên men cao Có khả năng kết lắng tốt và làm trong sản phẩm Bƣớc 2: Đánh giá khả năng lên men của các chủng nấm men Trong quá trình lên men thì hoạt lực lên men đƣợc đánh giá bằng hàm lƣợng CO2 sinh ra. Lƣợng CO2 sinh ra càng nhiều, thoát ra ngoài môi trƣờng 31 thì trọng lƣợng bình lên men càng giảm. Điều đó chứng tỏ hoạt lực lên men càng mạnh. Căn cứ vào kết quả nghiên cứu của một số tác giả chỉ ra thời gian lên men cho sản phẩm thƣờng là 7 ngày. Tiến hành thí nghiệm lên men sau 7 ngày và xác định hàm lƣợng CO2 của 4 chủng, kết quả thí nghiệm đƣợc dẫn ra ở bảng 3.3. Bảng 3.3. Hàm lƣợng khí CO2 giải phóng sau 7 ngày lên men của 4 chủng nấm men Chủng nấm men N1 N2 N3 N4 Lƣợng CO2 1,75 ± 0,02 2,3 ± 0,035 2,75 ± 0,02 1,5 ± 0,03 Kết quả nghiên cứu cho thấy trong 4 chủng thì chủng N2, N3 có hoạt lực lên men mạnh nhất, lƣợng CO2 thoát ra nhiều. Sự phát triển nhanh của tế bào nấm men làm cho vi khuẩn, nấm men dại khó xâm nhập. Ngoài khả năng sinh CO2 chất lƣợng sản phẩm còn phụ thuộc vào độ trong, màu sắc, mùi vị, vì vậy chúng tôi khảo sát tiếp khả năng kết lắng làm trong sản phẩm cuả 4 chủng nghiên cứu. Bƣớc 3: Khả năng kết lắng Tiến hành hòa sinh khối nấm men vào dung dịch đệm axetat rồi lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 5 phút., kết quả thí nghiệm đƣợc dẫn ra trên bảng 3.4. Bảng 3.4. Khả năng kết lắng của 4 chủng nấm men Tên chủng N1 N2 N3 N4 Chiều cao cột sinh khối (mm) 14 17,5 18,5 16 32 Từ kết quả ở bảng 3.4, thấy rằng chủng nấm men N3 có khả năng kết lắng tốt nhất. Qua kết quả nghiên cứu trình bày trên bảng 3.3 và bảng 3.4 quyết định giữ chủng N3 làm đối tƣợng nghiên cứu tiếp theo. 3.2.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ Bƣớc 1: Tiến hành nhuộm Gram các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc, kết quả 5 chủng vi khuẩn này đều bắt màu hồng của thuốc nhuộm ( Gram âm) có dạng hình que ngắn, tế bào xếp dạng đơn, đôi, hoặc chuỗi ngắn. Các chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha bao gồm vi khuẩn Gram dƣơng (vi khuẩn lactic) và vi khuẩn Gram âm (vi khuẩn Acetobacter). Vì các mẫu vi khuẩn phân lập đƣợc đều là vi khuẩn Gram âm, chính vì vậy chúng tôi tiến hành sơ tuyển bằng cách lựa chọn các mẫu vi khuẩn Acetobacter có khả năng tạo màng kombucha. Hình 3.5. Hình thái tế bào chủng Hình 3.6. Hình thái tế bào chủng vi khuẩn V1 (x1000 lần) vi khuẩn V2 (x1000 lần) 33 Hình 3.7. Hình thái tế bào chủng Hình 3.8. Hình thái tế bào chủng vi khuẩn V4 (x1000 lần) vi khuẩn V5 (x1000 lần) Bƣớc 2: Tuyển chọn các chủng có khả năng sinh acid. Theo Bergey [1] các chủng Acetobacter có khả năng oxy hóa acetate, trong môi trƣờng có chứa calcium acetate, các chủng vi khuẩn thuộc chi Acetobacter có khả năng sử dụng muối acetate làm nguồn cacbon. Các mẫu vi khuẩn có khả năng sinh acid, acid này phân giải CaCO3 trong môi trƣờng do đó xung quanh khuẩn lạc xuất hiện vòng sáng nhỏ trong suốt. Kết quả thu đƣợc 2 chủng V2, V5 sinh acid. Hình 3.9. Khả năng oxy hóa acetate của chủng vi khuẩn V2 Bƣớc 3. Khả năng tổng hợp cellulose Quan sát sự tạo thành màng ta thấy: 34 Vi khuẩn V1 tạo thành màng nhầy nhẵn, xuất hiện váng trên bề mặt Vi khuẩn V2 tạo thành màng nhẵn dai Vi khuẩn V3 tạo thành màng mỏng dễ tan rã Vi khuẩn V4, V5 tạo thành màng nhăn nheo Nhỏ dung dịch Lugol và H2SO4 60% lên mặt lớp màng của 5 mẫu vi khuẩn thấy chủng vi khuẩn V1,V2, V5 xuất hiện màu lam. Do màng của vi khuẩn tạo thành có bản chất là cellulose nên màng này sẽ bắt màu xanh với iốt, các chủng còn lại không xuất hiện màu. Bƣớc 4. Kiểm tra hoạt tính catalase Kiểm tra hoạt tính catalase thu đƣợc kết quả là cả 5 mẫu vi khuẩn đều có phản ứng catalase dƣơng tính. Khi nhỏ H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc thấy có hiện tƣợng sủi bọt khí (hình 3.10) Chứng tỏ oxy đƣợc giải phóng ra, hay nói cách khác dƣới tác dụng của enzyme catalase phân giải H2O2 theo phƣơng trình: Catalase H 2O2    H 2O  1 O2 2 Hình 3.10. Thử hoạt tính catalase trên chủng vi khuẩn V2 Bƣớc 5. Khả năng sinh sắc tố nâu Khi nuôi cấy 5 mẫu vi khuẩn đã tuyển chọn trên môi trƣờng thạch và dịch thể, không thấy hình thành sắc tố nâu, điều đó chứng tỏ rằng những 35 chủng vi khuẩn Acetobacter không hình thành sản phẩm 2,5-dixeto gluconic acid và  - propyonic cho nên dịch nuôi cấy không màu. Kết quả: 5 mẫu vi khuẩn đều không thấy hình thành sắc tố nâu. Bảng 3.5. Đặc tính sinh hóa của 5 chủng vi khuẩn Acetobacter phân lập đƣợc từ trà Phú Thọ Tên chủng STT V1 V2 V3 V4 V5 + + + + + - + - - + + + + + + - - - - - + - - Đặc điểm 1 2 3 4 5 Bắt màu hồng khi nhuộm Gram Tạo acid acetic Hoạt tính catalase Kiểm tra khả năng sinh sắc tố nâu Khả năng tổng hợp cellulose + + Chú thích: +: Kết quả dƣơng tính - : Kết quả âm tính Bƣớc 6: Tiến hành thí nghiệm lên men từng chủng vi khuẩn Tiến hành thí nghiệm lên men từng chủng vi khuẩn thu đƣợc theo tỉ lệ 20g trà, 100g đƣờng /1000ml nƣớc. Sau 7 ngày lên men tiến hành xác định hàm lƣợng acid tổng số đƣợc tạo ra bằng chuẩn độ với NaOH có 36 phenolphtalain 0,1% làm chỉ thị và đánh giá cảm quan màng của 5 chủng vi khuẩn. Chuẩn độ xác định hàm lƣợng acid tổng số tạo thành, lặp lại 3 lần một mẫu, kết quả thu đƣợc ở bảng 3.6. Bảng 3.6. Hàm lƣợng acid tổng số sinh ra và chất lƣợng cảm quan sản phẩm từ 5 chủng vi khuẩn STT Chủng Hàm lƣợng acid tổng số Chất lƣợng cảm quan M±m M 1 V1 22 ± 0,05 17 2 V2 30 ± 0,04 17,4 3 V3 18 ± 0,027 15,5 4 V4 21 ± 0,035 16 5 V5 17,5 ± 0,06 15 6 V6 18 ± 0,038 15,5 Căn cứ vào khả năng sinh acid và chất lƣợng cảm quan sản phẩm đƣợc lên men từ 5 mẫu vi khuẩn Acetobacter, chúng tôi thấy chủng vi khuẩn V2 có khả năng sinh acid cao và cho sản phẩm có chất lƣợng cảm quan tốt. Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn chủng V2 làm đối tƣợng cho các nghiên cứu tiếp theo. Như vậy, tuyển chọn được chủng nấm men N3 và chủng vi khuẩn V2 có khả năng lên men kombucha tốt nhất từ trà Phú Thọ, đã xác định được một số đặc tính sinh hóa của 5 chủng vi khuẩn tuyển chọn. 37 3.3. Động thái sinh trƣởng của chủng vi khuẩn, nấm men tuyển chọn; ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng tới quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ 3.3.1. Động thái sinh trưởng của chủng vi khuẩn, nấm men tuyển chọn Trong qúa trình lên men kombucha giai đoạn nhân giống chiếm một thời gian ngắn khoảng 24 – 48 h, nhƣng nó lại đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình tăng nhanh số lƣợng của tế bào vi sinh vật. Tiến hành nuôi cấy trên môi trƣờng số 2 (môi trƣờng nhân giống ) ở điều kiện môi trƣờng 350C,nuôi trên máy lắc 135 vòng/phút với số lƣợng tế bào chủng nấm men N3 ban đầu là 3,5.106/ml ,chủng vi khuẩn V2 là 2x106 tế bào/ml, sau những khoảng thời gian định sẵn, dịch nuôi cấy đƣợc lấy ra để xác định số lƣợng tế bào. Sử dụng phƣơng pháp đếm số lƣợng tế bào trong dịch nuôi cấy ở các thời điểm: 0,12, 24,36, 48, 60,72, 84,96 giờ. Mục đích là xác định động thái phát triển của chủng nấm men N3 và chủng vi khuẩn V2. Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày ở bảng 3.7 và hình 3.12. Hình 3.11. Chủng vi khuẩn V2 lắc sau 24h, 72h, 168h 38 Bảng 3.5. Quá trình sinh trƣởng của chủng vi khuẩn V2 và nấm men N3 Thời gian (h) Chủng vi khuẩn V2 Chủng nấm men N3 Số lƣợng tế bào (x106) δ(%) Số lƣợng tế bào (x106) δ(%) 0 2 ± 0,0057 0,0001 3,5 ± 0,0057 0,0001 12 15 ± 1,57 0,0273 53 ± 1,17 0,0203 24 35 ± 0,77 0,0134 85 ± 1,76 0,0305 36 80 ± 1,41 0,0245 130 ± 1,258 0,0218 48 125 ± 1,61 0,028 125 ± 0,77 0,0134 60 134 ± 2,182 0,0378 87 ± 1,991 0,0345 72 145 ± 1,88 0,0326 65 ± 1,847 0,032 84 129 ± 1,54 0,0267 34 ± 1,55 0,027 96 83 ± 1,327 0,023 23 ± 1,17 0,0203 Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn động thái sinh trƣởng chủng vi khuẩn V2 39 Hình 3.13. Đồ thị biểu diễn động thái sinh trƣởng chủng nấm men N3 Nhƣ vậy, chủng nấm men N3 và chủng vi khuẩn V2 có khả năng phát triển tốt và theo đúng động thái phát triển: Pha tiềm phát, pha logarit, pha cân bằng, pha suy vong. Chủng nấm men N3 ở 36h số lƣợng tế bào đạt cực đại và sau đó giảm dần, chủng vi khuẩn V2 số lƣợng tế bào đạt cực đại ở 72h và sau đó giảm dần. Do đó, để thu được lượng sinh khối chủng nấm men N3 nhiều nhất và khoẻ nhất ta sẽ nuôi cấy và tiến hành thu hoạch sinh khối sau 36 giờ. Để thu được lượng sinh khối chủng vi khuẩn V2 nhiều nhất và khoẻ nhất ta sẽ nuôi cấy và tiến hành thu hoạch sinh khối sau 72 giờ. 3.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ Ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng tới quá trình lên men kombucha bao gồm các yếu tố: ảnh hƣởng của thời gian lên men; ảnh hƣởng của hàm lƣợng giống bổ sung ban đầu; ảnh hƣởng của độ pH ban đầu; ảnh hƣởng của nhiệt độ. Trong đó, ảnh hƣởng của hàm lƣợng giống đối với quá trình lên men kombucha đóng vai trò hết sức quan trọng, hàm lƣợng giống bổ sung chƣa đủ hoặc không tốt sẽ ảnh hƣởng đến chất lƣợng của kombucha, làm kombucha dễ bị nhiễm tạp, hàm lƣợng giống bổ sung quá cao sẽ làm quá trình lên men diễn ra nhanh, thời gian sử dụng sản phẩm ngắn, trong sản xuất ngoài yếu tố 40 chất lƣợng sản phẩm ngƣời ta còn chú trọng đến giá trị kinh tế vì vậy cần phải tìm đƣợc hàm lƣợng giống bổ sung thích hợp nhất, vừa tạo đƣợc sản phẩm kombucha có chất lƣợng tốt vừa hạ đƣợc giá thành. 3.3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng giống đối với quá trình lên men kombucha Hàm lƣợng men giống đƣa vào là tác nhân chính của quá trình lên men kombucha. Hàm lƣợng men giống nhiều quá trình lên men đƣợc thúc đẩy nhƣng nếu nhiều quá sẽ xảy ra cạnh tranh nguồn dinh dƣỡng đến lên men. Để xác định đƣợc hàm lƣợng men giống thích hợp, tiến hành thí nghiệm với hàm lƣợng men giống: 6%, 8%,10%,12% [3] trên chủng N3V2 đã tuyển chọn với tỷ lệ vi khuẩn: nấm men: 50:50 (thừa hƣởng kết quả nghiên cứu về hàm lƣợng giống bổ sung vào dịch trà của tác giả Lê Thị Huệ, Nghiên cứu một số chủng vi khuẩn lên men kombucha từ trà Thái Nguyên, tác giả Lâm Thị Hồng Liên, Nghiên cứu một số chủng nấm men lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang). Sau 7 ngày lên men tiến hành đo hàm lƣợng acid sinh ra [6]. Kết quả thu đƣợc trên bảng 3.8. Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng giống đến hàm lƣợng acid tổng số sinh ra Tỷ lệ giống(%) M±m δ(%) Cv 6 25,5 ± 0,202 0,003 0,01 8 27,6 ± 0,173 0,003 0,01 10 29,5 ± 0,288 0,005 0,016 12 31,6 ± 0,196 0,004 0,012 41 Hình 3.14. Biểu đồ biểu diễn ảnh hƣởng hàm lƣợng giống đến hàm lƣợng acid tổng số sinh ra Từ kết quả trên bảng 3.8 nhận thấy tỷ lệ giống bổ sung 6% là không phù hợp, thời gian lên men diễn ra dài hơn, tốc độ lên men diễn ra chậm. Tỷ lệ giống bổ sung là 8% quá trình lên men tƣơng đối tốt, tuy nhiên chƣa thực sự tạo ra đƣợc hƣơng vị đặc trƣng của kombucha. Ở tỷ lệ giống bổ sung là 10% và 12% nhận thấy quá trình lên men diễn ra nhanh, sản phẩm tạo ra có mùi vị thơm ngon đặc trƣng. Khi tăng tỷ lệ giống thì thời gian lên men đƣợc rút ngắn (tùy thuộc hàm lƣợng dinh dƣỡng có trong dịch lên men). Tuy nhiên, tỷ lệ giống càng nhiều dẫn đến quá trình lên men diễn ra càng nhanh, lƣợng acid tạo ra càng nhiều làm cho sản phẩm nhanh chua sẽ ảnh hƣởng chất lƣợng sản phẩm. Như vậy, để quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ được tốt, quyết định chọn tỷ lệ giống bổ sung ban đầu là 10%. 3.4. Lên men tạo sản phẩm kombucha từ trà Phú Thọ 3.4.1. Lên men kombucha Lên men tạo sản phẩm kombucha là công việc khá đơn giản, tuy nhiên để tạo sản phẩm kombucha với chất lƣợng tốt, an toàn...cần phải sử dụng các loại nguyên liệu, hàm lƣợng giống bổ sung (vi khuẩn, nấm men) đúng loại và 42 tỷ lệ, đảm bảo yêu cầu vệ sinh. Về nguyên liệu trà, có thể tự lên men ở gia đình với nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau (lá chè xanh, trà đen, trà lipton...) [6]. Chú ý: Dịch trà đƣờng để nguội sau đó mới bổ sung giống nếu không sẽ làm chết con nấm. Không dùng các loại dụng cụ bằng sắt để lên men nên dùng bình thủy tinh, sứ hoặc plastic. 3.4.2. Thuyết minh quy trình Nguyên liệu: 1 con nấm kombucha hoặc 10% dịch giống 20g trà Phú Thọ 100g đƣờng saccharose 1000 ml nƣớc Bình thủy tinh, khăn vải. * Giai đoạn 1: Chế biến dịch trà đường và lên men Bước 1: Chế biến dịch trà Đun sôi 1000ml nƣớc, ngâm 20g trà để khoảng 10 phút cho trà ngấm hoàn toàn. Bước 2: Lọc Mục đích: nhằm tách bã chè ra khỏi dịch trà, làm cho dịch trà trong không bị vẩn đục do đó làm tăng giá trị cảm quan của sản phẩm và tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình lên men. Bước 3: Bổ sung đường và làm nguội Mục đích: là hạ thấp nhiệt độ của dịch trà, hạn chế sự xâm nhập của vi sinh vật và thuận tiện cho quá trình phối trộn, tránh làm mất hƣơng vị đặc trƣng của sản phẩm đồng thời bổ sung 100g đƣờng vào dịch trà. Bước 4: Lên men 43 Đây là quá trình lên men hiếu khí nên rất dễ nhiễm vi sinh vật lạ và đặc biệt là nấm mốc. Do đó cần đổ dịch lên men vào bình thủy tinh rửa thật sạch, lau khô và đậy kín bằng khăn vải đã tiệt trùng. Đổ trà đƣờng đã để nguội vào, thả nhẹ con nấm Kombucha hoặc bổ sung dịch giống tỷ lệ 10% (10% VK: 10% NM) vào dịch lên men, để nơi thoáng mát trong vòng 7 ngày là đƣợc. * Giai đoạn 2: Hoàn thiện và thu sản phẩm Bước 1: Thu dịch và lọc dịch lên men Sau khi quá trình lên men kết thúc, vớt nấm kombucha, thu lấy dịch lên men đem lọc. Thao tác vớt nấm kombucha phải đảm bảo điều kiện vệ sinh nghiêm ngặt, hạn chế nhiễm vi sinh vật từ môi trƣờng vào. Lọc dịch lên men: mục đích loại bỏ cặn, xác vi sinh vật sau quá trình lên men, làm trong dịch lên men, tăng chất lƣợng cảm quan. Bước 2: Thanh trùng, thu sản phẩm Mục đích: Đình chỉ quá trình lên men, tiêu diệt vi sinh vật gây hại, tăng thời gian bảo quản sản phẩm. Sau khi thanh trùng kombucha sẽ đƣợc đóng chai, bảo quản trong tủ lạnh thời gian 1 tháng. * Khi uống có thể nhúng miệng ly với chút nƣớc rồi úp lên đĩa đƣờng ngửa ly lên để rót trà vào cho trà đẹp và ngon hơn. Trà nấm Kombucha có vị chua dịu và thơm nhẹ, rất dễ uống. Nếu không thích mùi trà xanh có thể thay bằng 3 gói trà lipton tiến hành lên men nhƣ trà xanh. 44 Hình 3.15. Lên men kombucha từ trà Phú Thọ Đánh giá chất lƣợng sản phẩm, tiến hành lên men kombucha từ nguồn nguyên liệu trà Phú Thọ có bổ sung dịch giống là chủng vi khuẩn Acetobacter V2 và chủng nấm men N3 tuyển chọn đƣợc. Sau 7 ngày lên men bề mặt bình chứa xuất hiện lớp màng mỏng, trong suốt không bị nhiễm tạp, có màu vàng sẫm, mùi vị đặc trƣng của kombucha, tiến hành đánh giá chất lƣợng sản phẩm bằng phƣơng pháp cảm quan cho điểm trà với mẫu đối chứng là kết quả của tác giả Lê Thị Huệ, Nghiên cứu một số chủng vi khuẩn lên men kombucha từ trà Thái Nguyên, luận văn thạc sĩ sinh học. Hội đồng gồm 5 ngƣời (A, B, C, D, E và 1, 2, 3, 4, 5). Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày ở bảng 3.9. Bảng 3.7. Đánh giá chất lƣợng sản phẩm kombucha bằng phƣơng pháp cảm quan Chỉ tiêu chất lƣợng Điểm chƣa có trọng lƣợng trung bình của A, B, C, D, Điểm chƣa có trọng lƣợng trung bình của 1, 2, 3, 4, 5 E (trà Thái Nguyên) (trà Phú Thọ) Độ trong và màu sắc 4,7 4 Mùi 4,7 4,5 Vị 4,6 4,7 Tổng điểm chung 18,6 18 Nhìn chung, đánh giá cảm quan sản phẩm kombucha từ trà Thái Nguyên và trà Phú Thọ đều đạt chất lƣợng tốt, có thể ứng dụng vào lên men trên quy mô hộ gia đình. 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận 1.1. Phân lập đƣợc 4 chủng nấm men N1, N2, N3, N4 và 5 chủng vi khuẩn Acetobacter V1, V2, V3, V4, V5 từ nguồn nguyên liệu trà Phú Thọ. 1.2. Tuyển chọn đƣợc chủng nấm men N3 và chủng vi khuẩn Acetobacter V2 lên men tạo sản phẩm kombucha thơm, ngon, đặc trƣng phù hợp với mục đích nghiên cứu. 1.3. Đã nghiên cứu động thái sinh trƣởng của chủng nấm men N3 và chủng vi khuẩn V2 tuyển chọn, chủng nấm men N3 sinh trƣởng mạnh nhất ở 36h, chủng vi khuẩn V2 sinh trƣởng mạnh nhất ở 72h; ảnh hƣởng của hàm lƣợng giống đối với quá trình lên men kombucha bổ sung vào dịch lên men là 10% cho hàm lƣợng acid cao nhất, tạo sản phẩm kombucha có chất lƣợng tốt nhất. 1.4. Đã lên men tạo sản phẩm kombucha từ trà Phú Thọ trên quy mô phòng thí nghiệm. 2. Kiến nghị Vì điều kiện thời gian và khả năng có hạn nên còn nhiều vấn đề chƣa thực hiện đƣợc, do đó chúng tôi đề nghị: 1. Tiếp tục tuyển chọn các chủng vi khuẩn, nấm men thuần khiết từ nguồn nguyên liệu là trà Phú Thọ. 2. Trong quá trình nghiên cứu có nhiều chủng vi sinh vật phân lập đƣợc nhƣng khi cấy truyền sinh trƣởng không rõ, khá mờ nên tác giả gặp khó khăn trong quá trình chuyển giống lên men, nguồn vi sinh vật lên men kombucha từ trà Phú Thọ còn rất phong phú cần đƣợc nghiên cứu sâu hơn. 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Bergey. H, John. G. Holt.( 1992) Bergey’s manual of dererminativa bacteriology. Wolters kluwer health, p.71- 84. [2]. Đặng Hùng Thắng (1999), Thống kê và ứng dụng, Nxb Giáo dục. [3]. Đinh Thị Kim Nhung (2007), “Ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình lên men vang táo mèo (Docynia indica)”, tạp chí khoa học và công nghệ [4]. Đinh Thị Kim Nhung (1996), Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Acetobacter và ứng dụng chúng trong lên men acid acetic theo phương pháp chìm, Luận án Tiến sỹ Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ Phạm Hà Nội. [5]. Goh, W.N., RosmaA., Kaur, B., et al (2012). Fermentation of black tea broth (Kombucha): I. Effects of sucrose concentration and fermentation time on the yield of microbial cellulose. International Food Research Journal 19(1), 109-117. [6]. Hoàng Ánh Sáng (2014), “ Nghiên cứu ảnh hưởng của vi khuẩn tới quá trình lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang”, luận văn thạc sĩ sinh học, Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2. [7]. Lâm Thị Hồng Liên (2013), “ Nghiên cứu một số chủng nấm men lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang”, Luận văn thạc sĩ sinh học, Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2. [8]. Lê Thị Huệ (2013), “ Nghiên cứu một số chủng vi khuẩn lên men kombucha từ trà Thái Nguyên”, Luận văn thạc sĩ sinh học [9]. Nguyễn Thế Trang, Nguyễn Phƣơng Nhuệ, Lƣơng Đức Phẩm (1999), “Kết quả nghiên cứu lên men rƣợu vang từ mận hậu huyện Xín Mần (Hà Giang) từ các chủng nấm men phân lập ở Việt Nam”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 37(2), tr: 25-28. 47 [10]. Thực hành vi sinh vật học của tác giả Đinh Thị Kim Nhung, Mai Thị Hằng, Vƣơng Trọng Hào, Nxb Đại học Sƣ phạm Hà Nội. [11]. http://123doc.vn/document/208029-cnsx-kombucha-tra-giam.htm [12]. http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/72/122/21/79734/Thuy-sam.aspx [13]. http://text.123doc.org/document/322797-vi-khuan-lactic.htm [14]. http://www.hoangtra.net/tin-tuc/Nghe-thuat-tra/Tra-Duong-SinhKombucha-3161.aspx [15]. http://huongmy.org/diendan/threads/250-KOMBUCHA-loai-thuc-uongtot-cho-suc-khoe-.html [16]. https://sites.google.com/site/kombukefir/announcements [17]. http://bacsytructuyen.com/diendan/baiviet/352-thuc-hu-ve-tac-dungthan-ky-cua-thuy-sam/ [18]. http://www.webtretho.com/forum/f119/tra-nam-kombucha90014/index9.html [19]. http://baodatviet.vn/doi-song/tra-giam-kombacha-khong-co-tac-dung-tribenh-2271622 [20]. http://muare.vn/threads/18/nam-thuy-sam-kombucha-than-duoc-cuathien-nhien-gia-tu-140-000-den-160-000-con-nam-truong-thanh.391105/ [21]. http://vnn.vietnamnet.vn/bvkh/201005/Tra-giam-chua-bach-benh-Thantrong-khi-su-dung-912346/ [22] http://data.lib.hutech.edu.vn/mucluc/44479.pdf 48 [...]... phẩm trà Phú Thọ kết hợp với nhu cầu đồ uống trên thị trƣờng Chính vì vậy tôi quyết định lựa chọn đề tài: Tuyển chọn vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ 2 Mục đích nghiên cứu Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha tạo sản phẩm kombucha thơm ngon, bổ dƣỡng từ trà Phú Thọ 3 Nội dung nghiên cứu 3.1 Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ. .. 3.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ 3.3 Nghiên cứu động thái sinh trưởng của chủng vi khuẩn, nấm men tuyển chọn; ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ 3.4 Lên men tạo sản phẩm kombucha từ trà Phú Thọ 4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 4.1 Ý nghĩa khoa học Tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng. .. vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ Nguyên liệu sử dụng là trà Phú Thọ và đƣờng để sản xuất kombucha Trƣớc hết cần đun sôi 1000ml nƣớc, bổ sung 20g trà để trong thời gian 5 phút Sau đó lọc lấy dịch trà đổ vào bình thủy tinh sạch, thêm 100g đƣờng khuấy đều, để nguội, bổ sung dung dịch giống hoặc con nấm kombucha Sau 7 ngày ở 28oC ta thu đƣợc kombucha, bao gồm dịch trà đƣờng lên men. .. này Do đó, trà nấm đƣợc đồn đại và truyền đi khắp Nhật Bản và đƣợc gọi tên là trà nấm kombucha [14] Khác với các sản phẩm lên men thông thƣờng, kombucha là sản phẩm của nhiều quá trình lên men tùy vào hệ vi sinh vật có trong nấm, bao gồm: quá trình lên men rƣợu nhờ nấm men, lên men acetic nhờ nhóm vi khuẩn sinh acid acetic và lên men lactic nhờ nhóm vi khuẩn lactic Do đó, trong dịch lên men chứa hàng... này rất ít, đặc biệt tài liệu nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men trà kombucha còn rất hạn chế 17 CHƢƠNG 2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1 Mẫu thực vật Cây trà xanh Bộ phận sử dụng: lá trà Địa điểm thu mẫu: tỉnh Phú Thọ 2.1.2 Mẫu vi sinh vật Các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc từ trà Phú Thọ 2.1.3 Dụng cụ và thiết bị Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức) Nồi hấp Tommy... khuẩn, nấm men có khả năng lên men kombucha tốt nhất từ đó làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo 2 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Sử dụng nguồn nguyên liệu là trà Phú Thọ lên men kombucha tạo sản phẩm nƣớc giải khát đa dạng trên các nguồn nguyên liệu khác nhau .Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng kombucha từ đó rút ngắn thời gian tạo màng, tạo sản phẩm thơm ngon, bổ dƣỡng có tác dụng phòng ngừa một... nghiên cứu 5.1 Phương pháp vi sinh 5.2 Phương pháp hóa sinh 5.3 Phương pháp cảm quan 5.4 Phương pháp toán học 6 Điểm mới của đề tài Là kết quả nghiên cứu đầu tiên tuyển chọn đƣợc chủng nấm men N3 và chủng vi khuẩn V2 có khả năng lên men kombucha trên đối tƣợng trà Phú Thọ 3 NỘI DUNG CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về kombucha 1.1.1 Nguồn gốc Kombucha đã đƣợc sử dụng từ hàng ngàn năm nay, xuất... Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ Sau 2-3 ngày kiểm tra đĩa petri Kết quả phân lập cho thấy tỉ lệ nấm men có trong kombucha khá phong phú: Ở nồng độ pha loãng 10-3 phân lập đƣợc 5 chủng nấm men; nồng độ pha loãng 10-4 phân lập đƣợc 6 chủng nấm men; Ở nồng độ pha loãng 10-5 phân lập đƣợc 3 chủng nấm men; Ở nồng độ pha loãng 10-6 phân lập đƣợc 2 chủng nấm men Ở nồng độ 10-7,... lực lên men của nấm men Xác định hoạt lực lên men của mẫu nấm men đã đƣợc phân lập và tuyển chọn thông qua xác định hàm lƣợng CO2 thoát ra (g/l dịch lên men) bằng phƣơng pháp cân bình trọng lƣợng Hàm lƣợng CO2 thoát ra càng nhiều thì chứng tỏ hoạt lực lên men càng tốt Phƣơng pháp cân bình trọng lƣợng: Dịch đƣợc lên men trong các bình có cùng thể tích 250 ml môi trƣờng, có cùng một lƣợng tế bào nấm men. .. nghiệm là nấm men đã kết lắng) Tiến hành đo chiều cao lớp kết lắng của chủng nấm men trong từng ống nghiệm để xác định khả năng kết lắng của chủng nấm men Ống nghiệm nào có chiều cao kết lắng cao nhất là chủng nấm men có độ kết lắng tốt nhất 2.2.2 Phương pháp hóa sinh 2.2.2.1 Phát hiện khả năng oxy hóa acid acetic Sử dụng môi trƣờng sau để thử khả năng oxy hoá acid acetic của vi khuẩn tuyển chọn [4] Thành

Ngày đăng: 30/09/2015, 09:38

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan