BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TỐI ƯU HÓA MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY BACILLUS sp. SV1 SINH PROTEASE KIỀM TÍNH CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Ts. DƯƠNG THỊ HƯƠNG GIANG NGUYỄN HOÀNG VŨ MSSV: 3092561 LỚP: CNSHTT K35 Cần Thơ, Tháng 12/2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) (ký tên) Dương Thị Hương Giang Nguyễn Hoàng Vũ DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 TRƯỞNG BỘ MÔN (ký tên) LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành đề tài luận văn tốt nghiệp, nổ lực, cố gắng không ngừng thân. Tôi nhận quan tâm chân thành từ gia đình, thầy cô, bạn bè. Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc đến TS. Dương Thị Hương Giang tận tình giúp đỡ góp ý trình thực luận văn. Xin cảm ơn tới thầy, cô, anh chị quản lý phòng thí nghiệm tạo điều kiện thuận lợi sở vật chất. Cảm ơn anh chị phòng Công nghệ Enzyme tận tình giúp đỡ hướng dẫn kiến thức phòng thí nghiệm Cảm ơn tập thể lớp Công nghệ Sinh học Tiên tiến khóa 35 nhiệt tình giúp đỡ động viên trình thực đề tài. Cảm ơn gia đình quan tâm, động viên tạo điều kiện tốt để hoàn thành luận văn tốt nhất. Một lần xin chân thành cảm ơn trân trọng. Cần Thơ, ngày tháng 12 năm 2013 Nguyễn Hoàng Vũ Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Protease kiềm tính từ vi khuẩn nguồn enzyme có giá trị cao công nghệ enzyme. Quá trình phân lập khảo sát sơ số chủng sinh protease kiềm tính phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ xác định dòng vi khuẩn Bacillus sp. SV1 dòng có tiềm sinh tổng hợp protease kiềm tính. Kết tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy nhằm mục đích tăng sản lượng protease kiềm tính ngoại bào dòng vi khuẩn cho thấy với lượng vi khuẩn chủng vào môi trường 1ml vi khuẩn (109 CFU/ml) 30ml môi trường nuôi cấy, nguồn nitơ yeast extract với nồng độ 1,0%, nguồn carbon glucose nồng độ 1,0%. pH 8,3, nhiệt độ 35oC 48 dòng Bacillus sp. SV1 sinh hoạt tính protease cao 1,596 U/ml. Từ khóa: Bacillus sp. SV1, nguồn carbon, nguồn nitơ, protease kiềm tính. Chuyên ngành công nghệ sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang TÓM LƯỢC i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG . v DANH SÁCH HÌNH . vi CÁC TỪ VIẾT TẮT vii CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU . 1.1. Đặt vấn đề 1.2. Mục tiêu đề tài . CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan enzyme protease 2.1.1. Giới thiệu chung protease 2.1.2. Protease kiềm tính .4 2.2. Tổng quan vi khuẩn Bacillus. 2.2.1. Vi khuẩn Bacillus. 2.2.2. Đặc điểm protease kiềm tính Bacillus sp. 2.3. Ứng dụng protease kiềm tính 2.3.1. Công nghiệp thực phẩm 2.3.2. Công nghiệp thuộc da .8 2.3.3. Công nghiệp dược .8 2.3.4. Công nghiệp chất tẩy rửa 2.4 Các phương pháp định lượng xác định hoạt tính protease 2.4.1. Phương pháp xác định hàm lượng protein (Bradford, 1976). 2.4.2. Phương pháp xác định hoạt tính protease (Kunitz cải tiến, 1947) 2.5. Tình hình nghiên cứu nước 2.5.1. Tình hình nghiên cứu nước .9 2.5.2. Tình hình nghiên cứu nước .10 Chuyên ngành công nghệ sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 3.1. Phương tiện nghiên cứu 11 3.1.1. Dụng cụ thiết bị 11 3.1.2. Nguyên vật liệu .11 3.1.3. Hóa chất 11 3.2. Phương pháp nghiên cứu 11 3.2.1 Quy trình chung nuôi cấy thu nhận protease kiềm tính từ vi khuẩn Bacillus sp. SV1. .11 3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ nồng độ đến khả sinh protease kiềm tính Bacillus sp. SV1. 12 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon nồng độ đến khả sinh protease kiềm tính Bacillus sp. SV1. .13 3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng tương tác nhiệt độ pH lên khả sinh protease kiềm tính Bacillus sp. SV1. .13 3.3.5. Phương pháp phân tích thống kê 15 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 16 4.1. Ảnh hưởng nguồn nitơ nồng độ đến khả sản sinh protease kiềm tính Bacillus sp. SV1. . 16 4.2. Ảnh hưởng nguồn carbon nồng độ đến khả sinh protease kiềm tính Bacillus sp. SV1 . 17 4.3. Ảnh hưởng tương tác nhiệt độ pH lên khả sinh protease kiềm tính Bacillus sp. SV1 . 18 4.3.1. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả sinh protease kiềm tính Bacillus sp. SV1. .18 4.3.2. Ảnh hưởng pH đến khả sinh protease kiềm tính Bacillus sp. SV1 19 4.3.3. Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh protease kiềm tính Bacillus sp. SV1. .20 4.3.4. Ảnh hưởng tương tác nhân tố nhiệt độ pH lên khả sinh protease kiềm tính Bacillus sp. SV1. .21 Chuyên ngành công nghệ sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 24 5.1. Kết luận 24 5.2. Đề nghị 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 25 PHỤ LỤC: SỐ LIỆU VÀ KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ . Phụ lục Chuyên ngành công nghệ sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Bảng 1. Một số protease kiềm tính sản xuất theo qui mô công nghiệp Bacillus sp Bảng 2. Trọng lượng phân tử protease kiềm tính tổng hợp dòng Bacillus sp Bảng 3. Điểm đẳng điện pI protease chịu kiềm sản xuất dòng Bacillus sp Bảng 4. Thành phần môi trường Horikoshi-I (pH 9.0) .12 Bảng 5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ nồng độ. .12 Bảng 8. Kết OD đường chuẩn Tyrosine Phụ lục Bảng 9. Ảnh hưởng chất nguồn nitơ nồng độ lên khả sinh protease kiềm tính Bacillus sp. SV1 . Phụ lục Bảng 10. Ảnh hưởng chất nguồn carbon nồng độ lên khả sinh protease kiềm tính Bacillus sp. SV1 . Phụ lục Bảng 11. Ảnh hưởng thời gian lên khả sinh protease kiềm tính Bacillus sp. SV1 Phụ lục Bảng 12. Ảnh hưởng pH đến khả sinh protease kiềm tính Bacillus sp. SV1 . Phụ lục Bảng 13. Ảnh hưởng nhiệt độ lên khả sinh protease kiềm tính Bacillus sp. SV1 Phụ lục Bảng 14. Ảnh hưởng tương tác pH nhiệt độ lên khả sinh protease kiềm tính Bacillus sp. SV1 Phụ lục Bảng 15. Hoạt tính protease môi trường Horikoshi-I . Phụ lục Bảng 16. Hoạt tính protease theo nguồn nitơ nồng độ Phụ lục Bảng 17. Hoạt tính protease kiềm tính theo nguồn carbon nồng độ. Phụ lục Bảng 18. Hoạt tính protease kiềm tính theo thời gian nuôi cấy. Phụ lục Bảng 19. Hoạt tính protease kiềm tính theo pH . Phụ lục Bảng 20. Hoạt tính protease kiềm tính theo nhiệt độ . Phụ lục Bảng 21. Hoạt tính protease kiềm tính theo tương tác pH nhiệt độ Phụ lục Chuyên ngành công nghệ sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Hình 1. Cơ chế phản ứng serine proteases Hình 2. Cơ chế phản ứng cystein proteases Hình 3. Cơ chế phản ứng aspartic proteases .4 Hình 4. Cơ chế phản ứng zinc proteases .4 Hình 5. Biểu đồ hoạt tính protease chủng Bacillus sp. SV1 theo nồng độ nguồn Nitơ. .16 Hình 6. Biểu đồ hoạt tính protease với nguồn carbon nồng độ khác dòng Bacillus sp. SV1. .17 Hình 7. Biểu đồ khảo sát ảnh hưởng thời gian lên khả sinh protease kiềm tính Bacillus sp. SV1 19 Hình 8. Biểu đồ khảo sát ảnh hưởng pH lên khả sinh protease kiềm tính Bacillus sp. SV1 20 Hình 9. Biểu đồ khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên khả sinh protease kiềm tính Bacillus sp. SV1. .21 Hình 10. Hoạt tính protease kiềm tính Bacillus sp. SV1 theo nhiệt độ pH môi trường. .22 Hình 11. Biểu đồ đường chuẩn BSA. . Phụ lục Hình 12. Biểu đồ đường chuẩn Tyrosine. Phụ lục Chuyên ngành công nghệ sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT CÁC TỪ VIẾT TẮT CFU Colony-forming unit EDTA Ethylendiaminetetraacetic acid pI Isoelectric point SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Chuyên ngành công nghệ sinh học vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT PHỤ LỤC: SỐ LIỆU VÀ KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ Phụ lục 1: Các phương pháp phân tích 1. Xác định hàm lượng protein phương pháp Bradford. Dung dịch protease xác định hàm lượng phương pháp Bradford (1976). Tiến hành theo bước sau: Chuẩn bị dung dịch Bradford mẹ Hòa tan 100mg Coomassie Brilliant Blue G250 50 ml ethanol 95%. Sau cho thêm 100ml acid phosphoric 85% khuấy đều. Bổ sung thêm nước cất 1lít. Sau lọc giấy lọc Whatman no. trữ chai tối nhiệt độ phòng. Có thể giữ để sử dụng vài tuần thời gian chất màu bị tủa nên sử dụng cần phải lọc lại. Chuẩn bị dung dịch BSA chuẩn Cân 3mg BSA, hòa tan ml nước cất. Giữ -20oC. Thu dung dịch mẹ có nồng độ 3mg/ml. Dựng đường chuẩn BSA Pha loãng dung dịch protein chuẩn để có dãy ống nghiệm với hàm lượng protein tăng dần từ 0-300µg/ml theo bảng sau: Nồng độ BSA (µg/ml) 30 60 120 180 240 300 Dung dịch BSA chuẩn (µl) 10 20 40 60 80 100 Đệm (µl) 1000 990 980 960 940 920 900 Tổng thể tích (µl) 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 Phản ứng với thuốc thử Bradford - Chuẩn bị dãy ống nghiệm, đánh số từ 0-7 (thí nghiệm lập lại lần 7x3= 21 ống nghiệm) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 - Trường ĐHCT Lấy 100 µl dung dịch protein từ dãy pha loãng cho vào ống theo độ pha loãng tăng dần. - Thêm vào 2ml thuốc thử bradford. - Trộn nhẹ ống máy vortex. Tránh tạo bọt. Ủ 10 phút. - Đo quang phổ bước sóng 595nm. Điều chỉnh OD ống giá trị 0. - Ghi nhận lại kết quả. - Tính giá trị trung bình lần lập lại. - Vẽ biểu đồ đường chuẩn (đường tuyến tính nồng độ protein (ml/l) với độ hấp thụ bước sóng 595 nm (A595nm)). Định lượng protein - 100µl mẫu cho phản ứng với thuốc thử Bradford mô tả trên. - Mẫu đối chứng: 100µl nước + thuốc thử Bradford - Đo độ hấp thụ bước sóng 595 nm (A595nm) Thí nghiệm lập lại lần, ghi nhận kết tính giá trị trung bình. Dựa vào biểu đồ đường chuẩn xác định hàm lượng protein mẫu. Kết đường chuẩn BSA Nồng độ BSA (µg/ml) 350 300 y = 459,782x - 44,009 R² = 0,987 250 200 150 100 50 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 OD 595nm Hình 11. Biểu đồ đường chuẩn BSA. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT 2. Xác định hoạt tính protease phương pháp Kunitz cải tiến. Phương pháp đo hoạt tính dựa vào phản ứng thủy phân chất casein protease acid amin peptide. Phản ứng dừng lại acid tricloroacetic. Sau đó, sản phẩm sinh đựợc xác định dựa vào độ hấp thụ ánh sáng bước sóng 280 nm. Đơn vị đo hoạt tínhs protease: Đơn vị hoạt protease biểu qua đơn vị tyrosin TU (Tyrosin Unit), lượng enzyme cần thiết để thủy phân casein cho 1µmol tyrosine (~ 0.181 mg) phút 37oC, and pH 9. Các bước tiến hành Chuẩn bị hóa chất - Dung dịch đệm Glycine-NaOH pH=9 - Dung dịch TCA nồng độ 15% (w/v) - Casein 0,6% (w/v) dung dịch đệm Glycine-NaOH chuẩn bị trên. Casein hòa tan đệm cách đun cách thủy 95oC khoảng 60 phút. Bảo quản lạnh 4oC. Dựng đường chuẩn Tyrosin - Chuẩn bị ống nghiệm theo bảng sau Ống nghiệm 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Vtyrosin(µl) 300 600 900 1200 1500 VHCl 0.1N(µl) 1500 1200 900 600 300 Tyrosin (µmol/ml) - Các dung dịch đo độ hấp thụ bước sóng 280nm - Thí nghiệm lập lại lần, tính giá trị trung bình Vẽ đường tuyến tính nồng độ tyrosin (µmol/ml) độ hấp thụ. Đo hoạt tính protease Thí nghiệm lập lại ba lần tiến hành eppendorf. Tiến hành cho chất vào ống eppendorf theo sơ đồ bảng bên dưới. Đo độ hấp thụ dung dịch sau thủy phân bước sóng tia UV (280nm) để xác định hàm lượng tyrosine sinh ra. Số đơn vị hoạt tính enzyme có 20µl enzyme tính theo công thức dựa Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT vào giá trị độ hấp thụ đo được, từ suy số đơn vị hoạt tính enzyme tổng thể tích enzyme thu nhận xác định số đơn vị enzyme 1g mẫu. - Hoạt tính ml enzyme tính theo công thức: Tu=(a*Vt*k)/(T*Ve), đó: Tu: hoạt tính protease (TU/ml) a : nồng độ Tyrosine Vt: tổng thể tích phản ứng (1380µl) T: thời gian phản ứng (10 phút) Ve: thể tích (40µl) k : hệ số pha loãng Sơ đồ thí nghiệm kiểm tra hoạt tính protease: 140μl đệm glycine-NaOH pH 40μl enzyme Ủ 37oC, 10 phút Bổ sung 600μl Casein 0.6% Lắc ủ 10 phút, 37oC Bổ sung 600μl TCA 15% Ổn định 4oC, 10 phút Ly tâm 13.000 v/p, 10 phút, 4oC Đo độ hấp thụ 280nm * Đối với mẫu đối chứng, quy trình tương tự thêm TCA 15% vào trước sau thêm vào casein 0,6%. Bảng 8. Kết OD đường chuẩn Tyrosine OD lần OD lần OD lần OD Trung bình 0,089 0,089 0,088 Nồng độ Tyrosine (µmol/ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 0,348 0,612 0,865 1,125 0,336 0,612 0,864 1,140 0,348 0,613 0,856 1,146 1,382 1,401 1,391 0,089 0,344 1,391 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 0,612 0,862 1,137 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT Nồng độ Tyrosin (µmol/ml) 1,2 y = 0,766x - 0,066 R² = 1,000 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 OD 280nm Hình 12. Biểu đồ đường chuẩn Tyrosine. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT Phụ lục 2: Kết phân tích thống kê thí nghiệm Bảng 9. Ảnh hưởng chất nguồn nitơ nồng độ lên khả sinh protease kiềm tính Bacillus sp. SV1. Analysis of Variance for Protease Activity - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio MAIN EFFECTS A:Concentration 0,482511 0,160837 4,86 B:N source 3,18768 1,59384 48,18 RESIDUAL 0,992432 30 0,0330811 TOTAL (CORRECTED) 4,66262 35 All F-ratios are based on the residual mean square error. P-Value 0,0071 0,0000 Multiple Range Tests for Protease Activity by Concentration Method: 95.0 percent LSD Concentration Count 0,005 0,02 0,015 0,01 LS Mean 0,297784 0,328905 0,377544 0,593923 LS Sigma 0,0606273 0,0606273 0,0606273 0,0606273 Homogeneous Groups X X X X Contrast Sig. Difference +/- Limits 0,005 - 0,01 * -0,296139 0,175105 0,005 - 0,015 -0,07976 0,175105 0,005 - 0,02 -0,0311211 0,175105 0,01 - 0,015 * 0,21638 0,175105 0,01 - 0,02 * 0,265018 0,175105 0,015 - 0,02 0,0486389 0,175105 * denotes a statistically significant difference. Summary Statistics for Protease Activity N Source Count Average Casein_05 0,186805 Casein_10 0,224972 Casein_15 0,254332 Casein_20 0,29338 Pepton_20 0,118104 Peptone_05 0,139242 Peptone_10 0,147463 Peptone_15 0,163904 Yeast Extract_05 0,567304 Yeast Extract_10 1,40933 Yeast Extract_15 0,714395 Yeast Extract_20 0,575231 Total 36 0,399539 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Standard deviation 0,00577569 0,0105081 0,00799204 0,0055005 0,00317572 0,00466068 0,00618643 0,00752543 0,00880785 0,0514261 0,015281 0,00849398 0,36499 Coeff. of variation 3,09183% 4,67084% 3,14237% 1,87487% 2,68893% 3,34717% 4,19524% 4,59136% 1,55258% 3,64896% 2,13902% 1,47662% 91,3528% Minimum 0,18152 0,217632 0,24846 0,288976 0,115461 0,135719 0,141004 0,155977 0,558496 1,35208 0,69766 0,565542 0,115461 Maximum 0,19297 0,237009 0,263433 0,299545 0,121627 0,144527 0,153335 0,170951 0,576112 1,45161 0,727607 0,581396 1,45161 Range 0,0114502 0,0193773 0,0149733 0,0105694 0,0061655 0,00880785 0,012331 0,0149733 0,0176157 0,0995287 0,0299467 0,0158541 1,33615 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 10. Ảnh hưởng chất nguồn carbon nồng độ lên khả sinh protease kiềm tính Bacillus sp. SV1. Analysis of Variance for Protease Activity - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio MAIN EFFECTS A:Concentration 0,690818 0,230273 18,35 B:N source 1,69775 0,848874 67,63 RESIDUAL 0,376543 30 0,0125514 TOTAL (CORRECTED) 2,76511 35 All F-ratios are based on the residual mean square error. P-Value 0,0000 0,0000 Multiple Range Tests for Protease Activity by Concentration Method: 95.0 percent LSD Concentration Count 0,02 0,015 0,005 0,01 LS Mean 0,396432 0,558007 0,641388 0,778888 LS Sigma 0,0373444 0,0373444 0,0373444 0,0373444 Homogeneous Groups X X X X Contrast Sig. Difference +/- Limits 0,005 - 0,01 * -0,1375 0,107859 0,005 - 0,015 0,083381 0,107859 0,005 - 0,02 * 0,244956 0,107859 0,01 - 0,015 * 0,220881 0,107859 0,01 - 0,02 * 0,382456 0,107859 0,015 - 0,02 * 0,161575 0,107859 * denotes a statistically significant difference. Summary Statistics for Protease Activity C Source Count Average Standard deviation Fructose_05 0,623087 0,0214365 Fructose_10 0,727607 0,0236831 Fructose_15 0,471885 0,0240461 Fructose_20 0,34652 0,0212912 Glucose_05 0,744635 0,0128345 Glucose_10 1,23259 0,0288426 Glucose_15 0,90758 0,0153149 Glucose_20 0,641583 0,0154158 Succrose_05 0,556441 0,0191828 Succrose_10 0,376467 0,0102085 Succrose_15 0,294554 0,0205684 Succrose_20 0,201191 0,0135404 Total 36 0,593678 0,281075 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Coeff. of variation 3,44036% 3,25494% 5,09576% 6,14429% 1,7236% 2,34% 1,68744% 2,40278% 3,44741% 2,71166% 6,9829% 6,73014% 47,3446% Minimum 0,599893 0,700302 0,455444 0,32685 0,735534 1,2094 0,895837 0,626316 0,54088 0,365604 0,272241 0,192089 0,192089 Maximum 0,642171 0,74258 0,499483 0,369127 0,759315 1,26489 0,924903 0,657144 0,577873 0,385862 0,312757 0,216751 1,26489 Range 0,0422777 0,0422777 0,0440393 0,0422777 0,0237812 0,0554895 0,0290659 0,0308275 0,036993 0,0202581 0,0405161 0,024662 1,0728 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 11. Ảnh hưởng thời gian lên khả sinh protease kiềm tính Bacillus sp. SV1. ANOVA Table for Protease Activity by Time Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 2,45353 0,817844 Within groups 0,0224853 0,00281066 Total (Corr.) 2,47602 11 F-Ratio 290,98 P-Value 0,0000 Summary Statistics for Protease Activity Time Count Average Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum Range 24 0,386156 0,0899839 23,3025% 0,314519 0,487152 0,172634 48 1,23494 0,0467812 3,78814% 1,18297 1,27369 0,0907209 72 0,214403 0,0214365 9,99822% 0,191209 0,233486 0,0422777 96 0,0693667 0,0223055 32,1559% 0,0441176 0,0863952 0,0422777 Total 12 0,476216 99,6269% 0,0441176 1,27369 0,474439 1,22958 Multiple Range Tests for Protease Activity by Time Method: 95.0 percent LSD Time Count Mean 96 0,0693667 72 0,214403 24 0,386156 48 1,23494 Homogeneous Groups X X X X Contrast Sig. Difference +/- Limits 24 - 48 * -0,848783 0,0998205 24 - 72 * 0,171753 0,0998205 24 - 96 * 0,316789 0,0998205 48 - 72 * 1,02054 0,0998205 48 - 96 * 1,16557 0,0998205 72 - 96 * 0,145036 0,0998205 * denotes a statistically significant difference. Bảng 12. Ảnh hưởng pH đến khả sinh protease kiềm tính Bacillus sp. SV1 ANOVA Table for Protease Activity by pH Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 0,960623 0,320208 Within groups 0,0313695 0,00392119 Total (Corr.) 0,991993 11 Summary Statistics for Protease activity pH Count Average Standard deviation 0,817447 0,0560113 1,30129 0,0162488 1,1357 0,0729369 10 0,569359 0,0834487 Total 12 0,95595 0,300302 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học F-Ratio 81,66 Coeff. of variation 6,85198% 1,24867% 6,42218% 14,6566% 31,414% P-Value 0,0000 Minimum 0,757553 1,28338 1,06935 0,477464 0,477464 Maximum 0,868532 1,31509 1,2138 0,640409 1,31509 Range 0,110979 0,0317083 0,144449 0,162945 0,837627 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT Multiple Range Tests for Protease Activity by pH Method: 95.0 percent LSD pH Count Mean 10 0,569359 0,817447 1,1357 1,30129 Homogeneous Groups X X X X Contrast Sig. Difference +/- Limits 7-8 * -0,483845 0,117903 7-9 * -0,318257 0,117903 - 10 * 0,248088 0,117903 8-9 * 0,165588 0,117903 - 10 * 0,731932 0,117903 - 10 * 0,566345 0,117903 * denotes a statistically significant difference. Bảng 13. Ảnh hưởng nhiệt độ lên khả sinh protease kiềm tính Bacillus sp. SV1. ANOVA Table for Protease Activity by Temperature Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 4,17212 1,39071 Within groups 0,0252667 0,00315834 Total (Corr.) 4,19738 11 F-Ratio 440,33 P-Value 0,0000 Summary Statistics for Protease activity Temperature Count Average Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum Range 32 1,12778 0,0799204 7,08655% 1,05438 1,21292 0,158541 37 1,37117 0,0675186 4,92417% 1,30628 1,44104 0,13476 42 47 3 0,124269 0,0441176 0,0198323 0,0359723 15,9592% 81,5373% 0,104892 0,0159324 0,144527 0,0846337 0,0396353 0,0687012 Total 12 0,666833 0,617722 92,6352% 0,0159324 1,44104 1,42511 Multiple Range Tests for Protease Activity by Temperature Method: 95.0 percent LSD Temperature Count Mean 47 0,0441176 42 0,124269 32 1,12778 37 1,37117 Homogeneous Groups X X X X Contrast Sig. Difference +/- Limits 32 - 37 * -0,24339 0,105814 32 - 42 * 1,00351 0,105814 32 - 47 * 1,08366 0,105814 37 - 42 * 1,2469 0,105814 37 - 47 * 1,32705 0,105814 42 - 47 0,0801514 0,105814 * denotes a statistically significant difference. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 14. Ảnh hưởng tương tác pH nhiệt độ lên khả sinh protease kiềm tính Bacillus sp. SV1. Analysis of Variance for Protease Activity Source Sum of Squares Df A:pH 0,153628 B:Temperature 4,2987 AA 0,328523 AB 0,142565 BB 2,99019 blocks 0,00421405 Total error 0,342374 19 Total (corr.) 8,26019 26 Mean Square 0,153628 4,2987 0,328523 0,142565 2,99019 0,00210702 0,0180197 F-Ratio 8,53 238,56 18,23 7,91 165,94 0,12 P-Value 0,0088 0,0000 0,0004 0,0111 0,0000 0,8903 R-squared = 95,8551 percent R-squared (adjusted for d.f.) = 94,8683 percent Standard Error of Est. = 0,134237 Mean absolute error = 0,0947333 Durbin-Watson statistic = 1,56488 (P=0,0522) Lag residual autocorrelation = 0,199247 Phương trình hoạt tính tương tác: Protease Activity = 1,4935 + 0,0923846*pH - 0,488689*Temperature - 0,233995*pH^2 - 0,108997*pH*Temperature 0,705949*Temperature^2 Optimize Response Goal: maximize Protease Activity Optimum value = 1,59649 Factor pH Temperature Low -1,0 -1,0 High 1,0 1,0 Optimum 0,283145 -0,368038 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT Phụ lục 3: Số liệu thô thí nghiệm Bảng 15. Hoạt tính protease môi trường Horikoshi-I. Lặp lặp lặp Trung bình Đối Hoạt tính Hàm lượng protein chứng (U/ml) sản sinh (mg/ml) Lần 0,902 0,910 0,888 0,900 0,532 0,744 0,372 Lần 0,931 0,928 0,913 0,924 0,563 0,726 0,382 Lần 0,924 0,938 0,901 0,921 0,548 0,758 0,399 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Trung bình hoạt tính (U/ml) 0,743 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 16. Hoạt tính protease theo nguồn nitơ nồng độ Nguồn Nitơ Nồng độ 0,5% 1,0% Casein 1,5% 2,0% 0,5% 1,0% Pepton 1,5% 2,0% 0,5% 1,0% Yeast Extract 1,5% 2,0% OD hoạt tính protease Lặp Lặp Lặp Trung bình Đối chứng Hoạt tính (U/ml) 0,672 0,673 0,658 0,764 0,723 0,738 0,878 0,819 0,828 0,928 0,888 0,903 0,590 0,632 0,674 0,718 0,670 0,632 0,789 0,711 0,727 0,838 0,842 0,679 0,891 0,913 0,977 1,323 1,204 1,255 1,314 1,308 1,397 1,571 1,582 1,587 0,687 0,676 0,669 0,758 0,748 0,740 0,855 0,854 0,839 0,941 0,903 0,923 0,581 0,611 0,608 0,716 0,671 0,626 0,764 0,714 0,755 0,805 0,807 0,702 0,880 0,930 0,977 1,275 1,240 1,284 1,343 1,357 1,366 1,566 1,582 1,564 0,530 0,521 0,510 0,582 0,579 0,570 0,669 0,673 0,659 0,741 0,706 0,727 0,443 0,473 0,467 0,572 0,529 0,486 0,613 0,565 0,610 0,675 0,675 0,571 0,582 0,629 0,673 0,639 0,642 0,659 0,993 0,999 1,004 1,266 1,277 1,258 0,186 0,182 0,193 0,237 0,218 0,220 0,263 0,251 0,248 0,300 0,292 0,289 0,136 0,137 0,145 0,153 0,148 0,141 0,171 0,165 0,156 0,115 0,122 0,117 0,558 0,567 0,576 1,452 1,352 1,424 0,698 0,718 0,728 0,566 0,579 0,581 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 0,687 0,658 0,640 0,724 0,754 0,759 0,854 0,889 0,817 0,937 0,922 0,943 0,567 0,621 0,572 0,737 0,666 0,663 0,773 0,721 0,786 0,782 0,785 0,659 0,882 0,922 0,959 1,209 1,235 1,285 1,393 1,374 1,322 1,534 1,586 1,543 0,701 0,697 0,710 0,786 0,766 0,722 0,833 0,855 0,873 0,957 0,898 0,922 0,585 0,581 0,578 0,694 0,678 0,582 0,730 0,709 0,753 0,795 0,795 0,767 0,866 0,955 0,996 1,292 1,281 1,313 1,323 1,389 1,378 1,594 1,579 1,563 Hàm lượng protein sản sinh (mg/ml) 0,103 0,094 0,086 0,129 0,139 0,110 0,152 0,136 0,124 0,160 0,136 0,144 0,078 0,073 0,072 0,087 0,081 0,091 0,085 0,072 0,080 0,058 0,051 0,060 0,299 0,274 0,286 0,716 0,696 0,722 0,369 0,379 0,354 0,303 0,279 0,296 Trung bình hoạt tính (U/ml) 0,187 0,225 0,254 0,293 0,139 0,147 0,164 0,118 0,567 1,409 0,714 0,575 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 17. Hoạt tính protease kiềm tính theo nguồn carbon nồng độ. Nguồn Carbon Nồng độ 0,5% 1,0% Glucose 1,5% 2,0% 0,5% 1,0% Succrose 1,5% 2,0% 0,5% 1,0% Fructose 1,5% 2,0% OD hoạt tính protease Lặp Lặp Lặp 1,046 1,025 1,085 1,223 1,185 1,243 1,085 1,117 1,055 1,013 0,992 1,013 0,958 0,926 0,953 0,922 0,868 0,912 0,859 0,802 0,890 0,842 0,879 0,888 0,934 0,988 0,967 1,053 1,044 0,983 0,922 0,938 0,996 0,907 0,856 0,898 1,037 1,045 1,095 1,178 1,251 1,223 1,113 1,106 1,191 0,978 1,056 0,986 0,921 0,979 0,969 0,906 0,925 0,859 0,908 0,853 0,841 0,886 0,835 0,843 0,987 1,025 0,996 1,007 1,069 1,001 0,943 0,965 0,922 0,930 0,829 0,928 1,015 0,993 1,077 1,223 1,203 1,243 1,127 1,082 1,109 0,985 1,034 1,043 0,943 0,939 0,976 0,874 0,914 0,927 0,898 0,785 0,851 0,859 0,803 0,810 0,975 1,033 1,021 1,037 1,026 1,017 0,942 0,915 0,958 0,893 0,899 0,949 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Hoạt tính Trung Đối (U/ml) bình chứng 1,033 1,021 1,086 1,208 1,213 1,236 1,108 1,102 1,118 0,992 1,027 1,014 0,941 0,948 0,966 0,901 0,902 0,899 0,888 0,813 0,861 0,862 0,839 0,847 0,965 1,015 0,995 1,032 1,046 1,000 0,936 0,939 0,959 0,910 0,861 0,925 0,659 0,655 0,721 0,643 0,669 0,687 0,672 0,674 0,693 0,663 0,704 0,679 0,646 0,643 0,675 0,676 0,673 0,667 0,689 0,624 0,656 0,694 0,679 0,688 0,652 0,686 0,671 0,666 0,695 0,633 0,677 0,664 0,698 0,684 0,645 0,715 0,759 0,739 0,736 1,265 1,209 1,223 0,925 0,902 0,896 0,641 0,626 0,657 0,551 0,578 0,541 0,366 0,378 0,386 0,299 0,272 0,313 0,217 0,195 0,192 0,600 0,642 0,627 0,740 0,700 0,743 0,455 0,499 0,461 0,369 0,344 0,327 Hàm lượng protein sản sinh (mg/ml) 0,380 0,340 0,368 0,672 0,555 0,622 0,422 0,491 0,468 0,261 0,253 0,329 0,305 0,259 0,240 0,203 0,179 0,194 0,179 0,146 0,156 0,118 0,077 0,106 0,280 0,331 0,324 0,400 0,320 0,321 0,218 0,270 0,220 0,165 0,182 0,193 Trung bình hoạt tính (U/ml) 0,745 1,233 0,908 0,642 0,556 0,376 0,295 0,201 0,623 0,728 0,472 0,347 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 18. Hoạt tính protease kiềm tính theo thời gian nuôi cấy. Thời gian (giờ) (h) 24h 48h 72h 96h OD hoạt tính protease Lặp Lặp Lặp Trung bình Đối chứng 0,827 0,883 0,790 1,289 1,299 1,209 0,989 1,007 1,055 1,193 1,223 1,203 0,863 0,821 0,853 1,244 1,234 1,287 0,937 0,984 0,973 1,244 1,203 1,258 0,795 0,890 0,833 1,203 1,303 1,203 0,977 1,029 1,029 1,178 1,158 1,238 0,828 0,865 0,825 1,245 1,279 1,233 0,968 1,007 1,019 1,205 1,195 1,233 0,623 0,594 0,604 0,677 0,720 0,699 0,809 0,832 0,850 1,102 1,079 1,114 Hoạt tính (U/ml) Hàm lượng protein sản sinh (mg/ml) 0,315 0,487 0,357 1,274 1,248 1,183 0,191 0,233 0,219 0,044 0,078 0,086 0,187 0,214 0,198 0,677 0,634 0,651 0,106 0,097 0,119 0,032 0,049 0,040 Trung bình hoạt tính (U/ml) 0,386 1,235 0,214 0,069 Bảng 19. Hoạt tính protease kiềm tính theo pH OD hoạt tính protease pH 10 Lặp Lặp Lặp Trung bình Đối chứng 1,039 0,959 1,059 1,285 1,198 1,209 1,190 1,219 1,162 0,937 0,984 0,981 1,082 1,022 1,082 1,238 1,224 1,237 1,107 1,234 1,181 0,912 0,943 0,923 1,122 0,998 1,093 1,209 1,232 1,194 1,197 1,108 1,223 0,983 0,994 0,888 1,081 0,993 1,078 1,244 1,218 1,213 1,165 1,187 1,189 0,944 0,974 0,931 0,666 0,620 0,679 0,672 0,634 0,633 0,653 0,696 0,643 0,677 0,645 0,621 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Hoạt tính (U/ml) Hàm lượng protein sản sinh (mg/ml) 0,869 0,758 0,826 1,283 1,315 1,305 1,124 1,069 1,214 0,477 0,640 0,590 0,404 0,389 0,423 0,672 0,668 0,663 0,572 0,555 0,597 0,279 0,310 0,291 Trung bình hoạt tính (U/ml) 0,817 1,301 1,136 0,569 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 20. Hoạt tính protease kiềm tính theo nhiệt độ. Nhiệt độ oC 32 37 42 47 OD hoạt tính protease Lặp Lặp Lặp Trung bình Đối chứng 1,122 1,152 1,167 1,283 1,198 1,210 0,836 0,954 0,868 0,872 0,855 0,909 1,109 1,109 1,231 1,309 1,239 1,299 0,792 0,801 0,872 0,845 0,809 0,875 1,158 1,208 1,221 1,250 1,201 1,248 0,889 0,837 0,804 0,921 0,836 0,881 1,130 1,156 1,206 1,281 1,213 1,252 0,839 0,864 0,848 0,879 0,833 0,888 0,621 0,671 0,661 0,649 0,632 0,649 0,706 0,723 0,722 0,787 0,715 0,790 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Hoạt tính (U/ml) Hàm lượng protein sản sinh (mg/ml) 1,116 1,054 1,213 1,441 1,306 1,366 0,123 0,145 0,105 0,016 0,085 0,032 0,578 0,557 0,586 0,681 0,693 0,693 0,066 0,062 0,058 0,028 0,042 0,036 Trung bình hoạt tính (U/ml) 1,128 1,371 0,124 0,044 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 21. Hoạt tính protease kiềm tính theo tương tác pH nhiệt độ. pH Nhiệt độ o C 32 pH 37 42 32 pH 37 42 32 pH 37 42 OD hoạt tính protease Lặp Lặp Lặp Trung Đối bình chứng 1,093 0,930 1,089 1,182 1,152 1,347 0,888 0,842 0,875 1,266 1,304 1,266 1,304 1,276 1,422 0,881 0,855 0,893 1,184 1,250 1,108 1,212 1,264 1,122 0,899 0,865 0,824 1,046 0,976 1,132 1,108 1,161 1,110 0,933 0,815 0,889 1,296 1,286 1,393 1,315 1,352 1,383 0,892 0,887 0,829 1,182 1,264 1,177 1,202 1,223 1,165 0,815 0,829 0,842 1,040 0,945 1,104 1,137 1,206 1,188 0,856 0,870 0,827 1,281 1,269 1,359 1,345 1,292 1,372 0,849 0,822 0,927 1,199 1,187 1,082 1,202 1,293 1,215 0,881 0,902 0,902 1,060 0,950 1,108 1,142 1,173 1,215 0,892 0,842 0,864 1,281 1,286 1,339 1,321 1,307 1,392 0,874 0,855 0,883 1,188 1,234 1,122 1,205 1,260 1,167 0,865 0,865 0,856 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 0,663 0,630 0,677 0,663 0,653 0,661 0,737 0,693 0,721 0,683 0,653 0,733 0,653 0,659 0,691 0,735 0,709 0,762 0,647 0,640 0,651 0,637 0,647 0,587 0,742 0,725 0,709 Hoạt tính (U/ml) 0,820 0,618 0,912 1,039 1,146 1,236 0,182 0,167 0,149 1,352 1,445 1,374 1,538 1,483 1,625 0,139 0,157 0,092 1,202 1,341 1,017 1,274 1,392 1,305 0,097 0,143 0,160 Hàm lượng protein sản sinh (mg/ml) 0,373 0,281 0,414 0,472 0,521 0,562 0,083 0,657 0,098 0,615 0,657 0,625 0,699 0,674 0,739 0,063 0,071 0,042 0,547 0,609 0,593 0,579 0,633 0,593 0,094 0,065 0,073 Trung bình hoạt tính (U/ml) 0,783 1,140 0,166 1,391 1,549 0,129 1,187 1,324 0,133 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học [...]... sinh protease kiềm tính của Bacillus sp SV1 4.3.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh protease kiềm tính Bacillus sp SV1 Dựa vào biểu đồ ở hình 7 cho thấy sau 24 giờ nuôi cấy, Bacillus sp SV1 bắt đầu sản sinh protease (0,386 U/ml), lượng protease tăng nhanh và đạt cao nhất ở thời điểm 48 giờ nuôi cấy (1,235 U/ml), sau đó giảm mạnh ở các thời điểm 72 giờ (0,214 U/ml) và hoạt tính còn rất... đánh giá: Hoạt tính protease (U/ml) 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng tương tác giữa nhiệt độ và pH lên khả năng sinh protease kiềm tính của Bacillus sp SV1 3.2.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh protease kiềm tính của Bacillus sp SV1 - Chủng Bacillus sp SV1 được nuôi cấy theo môi trường dinh dưỡng nhận từ thí nghiệm 3.2.2 và 3.2.3 - Thí nghiệm được khảo sát với một nhân tố là thời... khả năng sinh protease kiềm tính của Bacillus sp SV1 Kết quả thí nghiệm này cũng tương tự với các nghiên cứu về thời gian sinh ra enzyme của các dòng Bacillus Theo đề tài tối ưu hóa điều kiện sinh protease của vi khuẩn Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus megaterium và Bacillus licheniformis (Udandi et al., 2009) cho thấy các dòng vi khuẩn này sinh ra lượng enzyme có hoạt tính cao... mặt Hình 10 Hoạt tính protease kiềm tính của Bacillus sp SV1 theo nhiệt độ và pH môi trường Dựa vào kết quả nhận được ở hình 10, phương trình hồi quy và bảng 14 cho thấy có sự tương tác giữa pH và nhiệt độ trong quá trình sản sinh protease Bacillus sp SV1 Vùng pH tối ưu cho sự phát triển và sản sinh protease kiềm tính của dòng Bacillus sp SV1 là khoảng từ pH 8,2 tới pH 8,6 Nhiệt độ tối ưu cho vi khuẩn... 2011) Một dòng vi khuẩn Bacillus sp SV1 sinh protease đã được phân lập, định danh và khảo sát hoạt tính protease trong phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme, thuộc Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ, tuy nghiên dòng này cần phải được tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để có thể nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp enzyme 1.2 Mục tiêu đề tài Đề tài nhằm mục đích nâng cao khả năng sinh tổng hợp protease kiềm. .. của pH lên khả năng sinh protease kiềm tính của Bacillus sp SV1 Giá trị pH 8 là tối ưu để dòng Bacillus sp SV1 sinh tổng hợp enzyme có hoạt tính cao nhất, và pH 7 và pH 9 là hai mốc biên trong khoảng hoạt tính enzyme khá cao Do vậy vùng pH từ 7-9 được chọn cho thí nghiệm ảnh hưởng tương tác giữa pH và nhiệt độ lên khả năng sinh protease kiềm tính của chủng vi khuẩn Bacillus sp SV1 4.3.3 Ảnh hưởng của... Nhóm protease trung tính: pH 7 – 8 + Nhóm protease kiềm tính: pH 9 – 11 2.1.2 Protease kiềm tính Protease kiềm tính (EC.3.4.21-24, 99) hoạt động trong phổ pH từ trung tính tới kiềm Những enzyme này thường thuộc 2 nhóm là metalloprotase và serine protease Hiện nay, vi khuẩn là một nguồn cung cấp protease chính vì sự vượt trội trong sản sinh và tốc độ xúc tác so với các protease từ nấm và các loại vi sinh. .. năng sinh protease kiềm tính của Bacillus sp SV1 Các kết quả phân tích thống kê cho thấy chủng Bacillus sp SV1 sinh protease khá cao ở nhiệt độ 32oC, đạt cao nhất ở 37oC, giảm mạnh ở 42oC, và hoạt tính protease hầu như không còn nữa ở nhiệt độ 47oC và cao hơn Nhiệt độ là nhân tố ảnh hưởng tới sự điều hòa và tiết các protease ngoại bào của vi sinh vật Khi ở nhiệt độ cao, protease của Bacillus sp SV1. .. có độ pH tối ưu hẹp hơn 9 – 11 Chuyên ngành công nghệ sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT Tuy nhiên cũng có một vài protease có pH tối ưu cao khoảng 12 – 13 như enzyme được sản xuất bởi Bacillus sp No AH-101 (Takami et al., 1989) hay từ Bacillus sp B18’ (Fujiwara et al., 1991) - Nhiệt độ tối ưu Nhiệt độ tối ưu của các protease kiềm tính dao... filtration Trọng lượng phân tử protease kiềm tính dao động từ 15 – 30 kDa Một số nghiên cứu chỉ ra trọng lượng phân tử của các protease kiềm tính có trọng lượng phân tử lớn hơn như protease kiềm tính của Bacillus lichenformis MIR 29 (Ferrero el al., 1996) và Bacillus stearothemophilus F1 (Rahman el al., 1994) Bảng 2 Trọng lượng của các phân tử protease kiềm tính tổng hợp bởi các dòng Bacillus sp Trọng lượng . sinh protease kiềm tính của Bacillus sp. SV1 18 4.3.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh protease kiềm tính Bacillus sp. SV1. 18 4.3.2. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh. Phụ lục Bảng 17. Hoạt tính của protease kiềm tính theo nguồn carbon và nồng độ. Phụ lục Bảng 18. Hoạt tính của protease kiềm tính theo thời gian nuôi cấy. Phụ lục Bảng 19. Hoạt tính của protease. như enzyme được sản xuất bởi Bacillus sp. No. AH-101 (Takami et al., 1989) hay từ Bacillus sp. B18’ (Fujiwara et al., 1991). - Nhiệt độ tối ưu. Nhiệt độ tối ưu của các protease kiềm tính dao