BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LƯU THẢO LINH NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN ẢNH HƯỞNG TỚI SỰ HÌNH THÀNH VI THỂ (MICROVESICLE) TỪ TẾ BÀO HỒNG CẦU LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI, 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LƯU THẢO LINH NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN ẢNH HƯỞNG TỚI SỰ HÌNH THÀNH VI THỂ (MICROVESICLE) TỪ TẾ BÀO HỒNG CẦU CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 60 42 02 01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN ĐỨC BÁCH HÀ NỘI, NĂM 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị nào. Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 28 tháng năm 2015 Tác giả luận văn Lưu Thảo Linh Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp cố gắng thân nhận nhiều quan tâm giúp đỡ nhiệt tình thầy cô, bạn bè người thân. Trước tiên, xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS. Nguyễn Đức Bách người định hướng nghiên cứu, tận tình bảo, giúp đỡ suốt thời gian học tập thực luận văn tốt nghiệp này. Tôi xin cám ơn chân thành TS. Nguyễn Hữu Đức Th.S Phạm Thu Giang, Bộ môn Công nghệ sinh học động vật, Khoa Công nghệ Sinh học tạo điều kiện thuận lợi việc sử dụng trang thiết bị, kính hiển vi huỳnh quang, máy ly tâm trình thực luận văn Bộ môn. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy, Cô Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam người trực tiếp giảng dạy, trang bị kiến thức bổ ích suốt khoảng thời gian học tập nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Quỹ phát triển Khoa học Công nghệ (NAFOSTED) tài trợ cho đề tài nghiên cứu mã số 106-YS.06-2013.16 để có điều kiện thuận lợi thực luận văn này. Cuối cùng, với tất lòng kính trọng biết ơn vô hạn, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè, người bên cạnh động viên giúp đỡ trình học tập thực đề tài. Hà Nội, ngày 28 tháng năm 2015 Học viên Lưu Thảo Linh Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN . ii MỤC LỤC iii DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU . vii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài . Mục đích nghiên cứu CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan vi thể 1.1.1 Giới thiệu vi thể . 1.1.2 Vi thể khả truyền tín hiệu tế bào 1.1.3 Sự tương tác vi thể với tế bào . 1.1.4 Khả vận chuyển protein vi thể 1.1.5 Khả vận chuyển nucleic acid vi thể 1.1.6 Tương tác vi thể với màng tế bào đích 1.2 Nghiên cứu hình thành vi thể tế bào . 1.2.1 Sự hình thành tiết vi thể . 1.2.2 Sự hình thành vi thể tế bào hồng cầu 10 1.3 Vai trò sinh học Ca2+ . 12 1.3.1 Vai trò Ca2+ điều kiện sinh lý bình thường 12 1.3.2 Vai trò Ca2+ việc hình thành vi thể 14 Chương 2. NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.2 Phạm vi nghiên cứu 16 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii 2.3 Nội dung nghiên cứu 16 2.4 Phương pháp nghiên cứu . 16 2.4.1 Chuẩn bịcác dung dịch hóa chất 16 2.4.2 Chuẩn bị mẫu hồng cầu 20 2.4.3 Chuẩn bị tế bào hồng cầu mang Fluo-4 . 20 2.4.4 Xác định nồng độ Ca2+ nội bào huỳnh quang Fluo-4 21 2.4.5 Xác định xuất vi thể bề mặt tế bào 22 2.4.6 Xác định kích thước vi thể 23 2.4.7 Xử lý phân tích số liệu 23 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 24 3.1 Xây dựng thang chuẩn Ca2+ nội bào 24 3.2 Xác định nồng độ Ca2+ nội bào điều kiện sinh lý . 25 3.3 Ảnh hưởng A23187 đến nồng độ Ca2+ nội bào . 26 3.4 Ảnh hưởng LPA đến nồng độ Ca2+ nội bào . 28 3.5 Ảnh hưởng PMA đến nồng độ Ca2+ nội bào . 31 3.6 Xác định ảnh hưởng Ca2+ nội bào đến hình thành vi thể 33 3.6.1 Ảnh hưởng A23187 Ca2+ nội bào đến hình thành vi thể 33 3.6.2 Ảnh hưởng LPA Ca2+ nội bào đến hình thành vi thể . 34 3.6.3 Ảnh hưởng PMA Ca2+ nội bào đến hình thành vi thể 35 3.7 Nghiên cứu phương pháp thu nhận vi thể 36 3.8 Xác định kích thước vi thể 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ . 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kích thước vi thể 37 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Các dạng cấu trúc màng tiết từ tế bào . Hình 1.2 Sự tương tác MV với tế bào thông qua hai chế . Hình 1.3 Quá trình hình thành vi thể . 12 Hình 3.1 Thang chuẩn Ca2+ nội bào 24 Hình 3.2 Tế bào hồng cầu điều kiện sinh lý . 25 Hình 3.3 Nồng độ Ca2+ nội bào điều kiện sinh lý 26 Hình 3.4 Sự thay đổi cường độ huỳnh quang Fluo-4 27 Hình 3.5 Ảnh hưởng A23187 đến nồng độ Ca2+ nội bào . 28 Hình 3.6 Ảnh hưởng LPA tới nồng độ Ca2+ nội bào 29 Hình 3.7 Biến động Ca2+ nội bào LPA . 30 Hình 3.8 Nồng độ Ca2+ nội bào khoảng thời gian . 30 Hình 3.9 Ảnh hưởng LPA tới nồng độ Ca2+ nội bào 32 Hình 3.10 Biến động Ca2+ nội bào PMA 32 Hình 3.11 Ảnh hưởng PMA tới nồng độ Ca2+ nội bào . 33 Hình 3.12 Cảm ứng hình thành vi thể A23187 Ca2+ 33 Hình 3.13 Cảm ứng hình thành vi thể LPA Ca2+ . 34 Hình 3.14 Cảm ứng hình thành vi thể PMA Ca2+ 35 Hình 3.15 Phương pháp thu nhận vi thể từ tế bào hồng cầu . 36 Hình 3.16 Kích thước vi thể đo máy Zetasizer Nano 37 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU Kí hiệu tắt Nội dung AM Acetoxymethyl Cai2+ Ca2+ nội bào DMSO Dimethyl sulfoxide ESCs Tế bào gốc phôi (Embryonic stem cells) GFP Green fluorescent protein HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid LPA Lysophosphatidic acid MV Vi thể (microvesicle) PBS Đệm phosphate – Phosphate-buffered saline PKC Protein kinase C PMA Phorbol myristate acetate PS Phosphatydilserine PSGL-1 P-selectin glycoprotein ligand-1 TFs Các yếu tố mô (Tissue Factors) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết đề tài Hiện để chuyển gene vào tế bào động vật người ta sử dụng biện pháp vật lý, hóa học vi tiêm, dung hợp màng có mặt calcium phosphate, xung điện chất kích thích có chất phospholipid gọi liposome hay lipofectin thông qua hoạt động virus để chuyển gene. Trong số biện pháp này, cấu trúc liposome tích điện dương thường dùng để mang chuyển gene. Tùy thuộc vào loại tế bào điều kiện khác loại kỹ thuật áp dụng. Tuy nhiên, kỹ thuật có hạn chế chẳng hạn hiệu chuyển gene thấp, không ổn định, gây đáp ứng miễn dịch gây độc tế bào áp dụng điều kiện in vitro. Chính cần thiết phải phát triển hệ thống có khả mang DNA để chuyển gene hiệu hơn. Vi thể (microvesicle/MV) cấu trúc có nguồn gốc từ màng tế bào có kích thước từ 100 nm-1 µm, hình thành từ nhiều loại tế bào khác (Anderson et al., 2005, Barteneva et al., 2013). Nghiên cứu năm gần cho thấy điều kiện in vivo, vi thể mang phân tử protein, nucleic acid bao gồm DNA, mRNA miRNA đến tế bào đích thông qua chế dung hợp màng (EL Andaloussi et al., 2013, Lee et al., 2011, van Doormaal et al., 2009, Yuan et al., 2009). Chính vi thể có vai trò quan trọng giao tiếp tế bào chuyển gene. Vi thể hình thành hầu hết tế bào kể tế bào hồng cầu. Do tế bào hồng cầu có số lượng lớn, có khả vận chuyển khắp mô, tế bào thể dễ dàng thu nhận nuôi cấy, vi thể có nguồn gốc từ tế bào hồng cầu người dùng để mang axit nucleic chuyển gene. Để nghiên cứu khả mang DNA chuyển gene vi thể từ tế bào hồng cầu cần xác định điều kiện để tạo thành vi thể. Chính vậy, tiến Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page Hình 3.7. Biến động Ca2+ nội bào LPA Mỗi đường thể dao động nồng độ Ca2+ nội bào tế bào đơn. Thí nghiệm đo liên tục 20 phút Hình 3.8. Nồng độ Ca2+ nội bào khoảng thời gian Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30 3.5. Ảnh hưởng PMA đến nồng độ Ca2+ nội bào PMA chất kích hoạt cho họ protein kinase C (PKC). PKC họ lớn protein tham gia vào điều khiển chức nhiều protein khác thông phosphoryl hóa nhóm hydroxyl serine threonine protein này. Vì PKC đóng vai trò quan trọng chuỗi truyền tín hiệu tế bào ảnh hưởng đến nhiều trình sinh học khác. Để khảo sát ảnh hưởng PMA tới nồng độ Ca2+ nội bào, thí nghiệm tiến hành với tế bào hồng cầu có chứa Fluo-4. Huyền phù tế bào dung dịch đệm sinh lý có nồng độ Ca2+ 2mM. Tương tự thí nghiệm với LPA, sau tế bào lắng xuống đáy, PMA bổ sung vào với nồng độ khác (2-10 µ M). Cường độ huỳnh quang đo sau PMA bổ sung. Kết cho thấy PMA có tác động làm tăng nồng độ Ca2+ nội bào, nhiên tác động không rõ ràng nhanh chóng A23187 LPA. Tuy nhiên, PMA không gây tượng tan vỡ tế bào LPA nồng độ tương đối cao (10 µ M) (Hình 3.9). Thời gian cảm ứng để tăng Ca2+ nội bào diễn chậm, đồng thời cường độ huỳnh quang tế bào sử dụng PMA thấp đáng kể so với cường độ huỳnh quang đo tiến hành thí nghiệm với A23187 LPA (Hình 3.10). Sự khác chế tác động PMA. PMA không kích hoạt kênh vận chuyển Ca2+ mà kích hoạt protein kinase C. PMA không trực tiếp tham gia vào đường vận chuyển Ca2+ từ bên vào tế bào mà có tác động gián tiếp thông qua kích hoạt protein kinase C dẫn đến hoạt hóa protein khác. Hàm lượng Ca2+ nội bào xử lý tế bào PMA µ M trình bày Hình 3.11 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31 Hình 3.9.Ảnh hưởng LPA tới nồng độ Ca2+ nội bào Bên trái: Trước bổ sung PMA Bên phải: Sau bổ sung PMA µM 10 phút. Hình 3.10 Biến động Ca2+ nội bào PMA Mỗi đường thể dao động nồng độ Ca2+ nội bào tế bào đơn. Thí nghiệm đo liên tục 20 phút Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32 Hình 3.11 Ảnh hưởng PMA tới nồng độ Ca2+ nội bào 3.6. Xác định ảnh hưởng Ca2+ nội bào đến hình thành vi thể 3.6.1. Ảnh hưởng A23187 Ca2+ nội bào đến hình thành vi thể Sự hình thành vi thể kèm với phá vỡ phân bố bất đối xứng thành phần lipid màng. Phosphatidyl serine (PS) vốn phân bố lớp màng chuyển lớp màng hoạt động phospholipid scramblase. Khi cảm ứng tế bào A23187, trình hình thành vi thể quan sát huỳnh quang protein Annexin V-FITC gắn đặc hiệu với PS bề mặt tế bào vi thể. Sau đưa vào điều kiện cảm ứng khác bao gồm Ca2+ mM có mặt A23187 nồng độ µM. Ảnh hưởng thời gian cảm ứng khảo sát sau khoảng thời gian khác từ 30, 60, 90, 120 240 phút. Sau khoảng thời gian cảm ứng, tế bào ủ với Anexin V-FITC dung dịch đệm Annexin binding buffer. Kết quan sát thấy vi thể bắt đầu hình thành sau 30 phút, sau lượng vi thể xuất nhiều nhiều sau sau thời điểm bắt Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33 đầu cảm ứng. Việc phát hình thành vi thể bề mặt màng tế bào Annexin V-FITC thể Hình 3.12. Hình 3.12. Cảm ứng hình thành vi thể A23187 Ca2+ Mũi tên đỏ vi thể hình thành từ tế bào hồng cầu. Hình ảnh chụp sau 60 phút cảm ứng tế bào hồng cầu A23187 µM Ca2+ mM 3.6.2. Ảnh hưởng LPA Ca2+ nội bào đến hình thành vi thể Để xác định ảnh hưởng LPA tới hình thành vi thể từ tế bào hồng cầu, tiến hành thí nghiệm với tế bào hồng cầu nhuộm Anexin VFITC. Với tế bào hồng cầu dung dịch sinh lý với nồng độ Ca2+ 2mM, sau bổ sung LPA có nồng độ dung dịch 2,5 µM phút có hình thành vi thể từ số tế bào hồng cầu. Sau 15 phút, cường độ huỳnh quang từ tế bào cực đại, số lượng tế bào hồng cầu hình thành vi thể tăng nhiều (Hình 3.13). Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34 Hình 3.13. Cảm ứng hình thành vi thể LPA Ca2+ Mũi tên đỏ vi thể hình thành từ tế bào hồng cầu. Hình ảnh chụp sau 15 phút cảm ứng tế bào hồng cầu LPA 2,5 µM Ca2+ mM 3.6.3. Ảnh hưởng PMA Ca2+ nội bào đến hình thành vi thể Tương tự,ảnh hưởng Ca2+ nội bào đến hình thành vi thể PMA xác định. Trong thí nghiệm này, nồng độ PMA sử dụng µM. Tế bào hồng cầu sau cảm ứng PMA khoảng thời gian khác ủ với Anexin V-FITC. Kết cho thấy, cảm ứng PMA, hình thành giải phóng vi thể diễn chậm hơn. Sau 60 phút cảm ứng vi thể bắt đầu xuất bề mặt màng tế bào số lượng thấp nhiều so với cảm ứng A23187 LPA (Hình 3.14). Sự khác chế tác động PMA tới nồng độ Ca 2+ nội bào. PMA không kích hoạt kênh vận chuyển Ca2+ mà kích hoạt protein kinase C. PMA không trực tiếp tham gia vào đường vận chuyển Ca2+ từ bên vào tế bào mà có tác động gián tiếp thông qua kích hoạt protein kinase C dẫn đến hoạt hóa protein khác. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35 Hình 3.14. Cảm ứng hình thành vi thể PMA Ca2+ Mũi tên đỏ vi thể hình thành từ tế bào hồng cầu. Hình ảnh chụp sau 60 phút cảm ứng tế bào hồng cầu PMA µM Ca2+ mM. 3.7. Nghiên cứu phương pháp thu nhận vi thể Tế bào hồng cầu cảm ứng hình thành vi thể dung dịch đệm sinh lý có nồng độ Ca2+ mM có mặt chất cảm ứng A23187 µM LPA 2,5 µM PMA µM. Sau mẫu ly tâm lần tốc độ 3000 g 4ºC để loại bỏ tế bào thể apoptosis. Sau vi thể thu nhận siêu ly tâm 50.000 g 4ºC. Vi thể thu sau gửi phân tích kích thước máy Zetasizer Nano ZS. Dựa vào kết phân tích, xây dựng phương pháp thu nhận vi thể từ tế bào hồng cầu (Hình 3.15). Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36 Hình 3.15. Phương pháp thu nhận vi thể từ tế bào hồng cầu 3.8. Xác định kích thước vi thể Hiện việc xác định kích thước cấu trúc nano thiết bị thông thường khó khăn. Do vi thể nhỏ có kích thước phạm vi 0,1 đến µM nên sử dụng máy chuyên dụng kính hiển vi điện tử SEM, AFM. Trong nghiên cứu này, mẫu vi thể gửi phân tích máy Zetasizer Nano ZS (Đại học Aston, Vương quốc Anh). Kết phân tích cho thấy kích thước vi thể thu có khác nhau. Kích thước trung bình vi thể thu dao động khoảng từ 150 đến 500 nm tùy thuộc vào điều kiện cảm ứng thời gian cảm ứng (Bảng 1). Bảng 1. Kích thước vi thể Chất cảm ứng A23187 2µM LPA 2,5 µM PMA µM Phạm vi kích thước vi thể (nm) 150-500 135-350 140-450 Kích thước trung bình vi thể (nm) 190 ± 42 168 ± 34 276 ± 35 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 37 Trong số trường hợp vi thể giải phóng khỏi tế bào phân bố thành phân đoạn có kích thước khác nhau. Tuy nhiên, phần lớn kết thu vi thể có đỉnh nằm phạm vi từ 100 đến 200 nm (Hình 3.16). Hình 3.16. Kích thước vi thể đo máy Zetasizer Nano Cho đến nay, thí nghiệm chuyển gene sử dụng cấu trúc có chất phospholipid liposome dạng lipofectin, kích thước tốt cấu trúc mang axit nucleic (DNA, mRNA miRNA) cần phạm vi 100 nm. Với kích thước này, vi thể thu được sử dụng để nghiên cứu khả mang axit nucleic, đánh giá khả dung hợp màng chuyển gene vào tế bào. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Khi xử lí tế bào hồng cầu người với A23187 µ M LPA 2,5 µ M PMA µM dẫn đến gia tăng Ca2+ nội bào. Với chất cảm ứng khác thời gian làm nồng độ Ca2+ nội bào tăng khác nhau, cụ thể với LPA nồng độ Ca2+ tăng diễn tức thời (sau 45-60 giây đạt cực đại) thời gian phản ứng chậm xử lý tế bào hồng cầu với PMA (sau 20 phút đạt cực đại). Bằng cách sử dụng kỹ thuật đánh dấu huỳnh quang, kính hiển vi huỳnh quang nồng độ Ca2+ nội bào, hình thành giải phóng MV khỏi tế bào hồng cầu nghiên cứu. Các vi thể thu nhận phương pháp ly tâm. Kích thước trung bình vi thể tạo thành tương ứng với chất cảm ứng kèm theo Ca2+ mM là: 190 ± 42 nm (A23187 2µ M); 168 ± 34 nm (LPA 2,5 µ M); 276 ± 35 nm (PMA µ M) Điều kiện cảm ứng tối ưu để tạo vi thể từ tế bào hồng cầu phục vụ cho nghiên cứu xử lí tế bào hồng cầu với LPA 2,5 µM, Ca2+ 2mM. Ở điều kiện cảm ứng này, thời gian vi thể tạo thành ngắn kích thước trung bình vi thể tạo thành nhỏ (168 ± 34 nm ). Bởi nay, thí nghiệm chuyển gene sử dụng cấu trúc có chất phospholipid liposome dạng lipofectin, kích thước tốt cấu trúc mang axit nucleic (DNA, mRNA miRNA) cần phạm vi 100 nm 2. Kiến nghị Các kết thu từ đề tài hữu ích cho nghiên cứu sinh học bản, góp phần giải thích chế dẫn đến hình thành vi thể hồng cầu dạng tế bào khác trình sinh lý bệnh. Dựa kết thu được, vi thể giải phóng từ tế bào hồng cầu thu Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 39 thập cho nghiên cứu xác định đặc tính chức từ sử dụng vi thể làm công cụ vận chuyển protein, nucleic acid vận chuyển thuốc đến tế bào đích. Do hạn chế thời gian, điều kiện trang thiết bị, cần có nghiên cứu để làm rõ ảnh hưởng Ca2+ tới hình thành cấu trúc vi thể, xác định đặc điểm vi thể, khả mang protein, nucleic acid dung hợp với tế bào khác nhau. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 40 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Role of intracellular Ca2+ on the formation of microvesicle in human red blood cells. TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 67-74. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Anderson, H. C., Garımella, R. & Tague, S. E. 2005. The role of matrix vesicles in growth plate development and biomineralization. Front Biosci, 10, 822-37. Andrews, R. K. & Berndt, M. C. 2004. Platelet physiology and thrombosis. Thromb Res, 114, 447-53. Antwı-Baffour, S., Kholıa, S., Aryee, Y. K., Ansa-Addo, E. A., Stratton, D., Lange, S. & Inal, J. M. 2010. Human plasma membrane-derived vesicles inhibit the phagocytosis of apoptotic cells--possible role in SLE. Biochem Biophys Res Commun, 398, 278-83. Barry, O. P., Kazanıetz, M. G., Pratıco, D. & Fıtzgerald, G. A. 1999. Arachidonic acid in platelet microparticles up-regulates cyclooxygenase-2-dependent prostaglandin formation via a protein kinase C/mitogen-activated protein kinase-dependent pathway. J Biol Chem, 274, 7545-56. Barry, O. P., Pratıco, D., Lawson, J. A. & Fıtzgerald, G. A. 1997. Transcellular activation of platelets and endothelial cells by bioactive lipids in platelet microparticles. J Clin Invest, 99, 2118-27. Barteneva, N. S., Fasler-Kan, E., Bernımoulın, M., Stern, J. N., Ponomarev, E. D., Duckett, L. & Vorobjev, I. A. 2013. Circulating microparticles: square the circle. BMC Cell Biol, 14, 23. Bevers, E. M., Comfurıus, P., Dekkers, D. W. & Zwaal, R. F. 1999. Lipid translocation across the plasma membrane of mammalian cells. Biochim Biophys Acta, 1439, 317-30. Buckı, R., Bachelot-Loza, C., Zachowskı, A., Gıraud, F. & Sulpıce, J. C. 1998. Calcium induces phospholipid redistribution and microvesicle release in human erythrocyte membranes by independent pathways. Biochemistry, 37, 15383-91. Cocuccı, E., Racchettı, G. & Meldolesı, J. 2009. Shedding microvesicles: artefacts no more. Trends Cell Biol, 19, 43-51. D'souza-Schorey, C. & Clancy, J. W. 2012. Tumor-derived microvesicles: shedding light on novel microenvironment modulators and prospective cancer biomarkers. Genes Dev, 26, 1287-99. Dasgupta, S. K., Abdel-Monem, H., Nıravath, P., Le, A., Bellera, R. V., Langloıs, K., Nagata, S., Rumbaut, R. E. & Thıagarajan, P. 2009. Lactadherin and clearance of platelet-derived microvesicles. Blood, 113, 1332-9. De Vooght, K. M., Lau, C., De Laat, P. P., Van Wıjk, R., Van Solınge, W. W. & Schıffelers, R. M. 2013. Extracellular vesicles in the circulation: are erythrocyte microvesicles a confounder in the plasma haemoglobin assay? Biochem Soc Trans, 41, 288-92. Del Conde, I., Shrımpton, C. N., Thıagarajan, P. & Lopez, J. A. 2005. Tissue-factorbearing microvesicles arise from lipid rafts and fuse with activated platelets to initiate coagulation. Blood, 106, 1604-11. Deregıbus, M. C., Cantaluppı, V., Calogero, R., Lo Iacono, M., Tetta, C., Bıancone, L., Bruno, S., Bussolatı, B. & Camussı, G. 2007. Endothelial progenitor cell derived Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 42 microvesicles activate an angiogenic program in endothelial cells by a horizontal transfer of mRNA. Blood, 110, 2440-8. Elmore, S. 2007. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol, 35, 495516. Fackler, O. T. & Peterlın, B. M. 2000. Endocytic entry of HIV-1. Current Biology, 10, 1005-1008. Fevrıer, B., Vılette, D., Archer, F., Loew, D., Faıgle, W., Vıdal, M., Laude, H. & Raposo, G. 2004. Cells release prions in association with exosomes. Proc Natl Acad Sci U S A, 101, 9683-8. Graham, T. R. 2004. Flippases and vesicle-mediated protein transport. Trends in Cell Biology, 14, 670-677. Gyorgy, B., Szabo, T. G., Pasztoı, M., Pal, Z., Mısjak, P., Aradı, B., Laszlo, V., Pallınger, E., Pap, E., Kıttel, A., Nagy, G., Falus, A. & Buzas, E. I. 2011. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci, 68, 2667-88. Holoch, D. & Moazed, D. 2015. RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression. Nat Rev Genet, 16, 71-84. Huebner, A. R., Somparn, P., Benjachat, T., Leelahavanıchkul, A., Avıhıngsanon, Y., Fenton, R. A. & Pısıtkun, T. 2015. Exosomes in urine biomarker discovery. Adv Exp Med Biol, 845, 43-58. Hugel, B., Martınez, M. C., Kunzelmann, C. & Freyssınet, J. M. 2005. Membrane microparticles: two sides of the coin. Physiology (Bethesda), 20, 22-7. Kaestner, L., Tabellıon, W., Weıss, E., Bernhardt, I. & Lıpp, P. 2006. Calcium imaging of individual erythrocytes: problems and approaches. Cell Calcium, 39, 13-9. Knowles, D. W., Tılley, L., Mohandas, N. & Chasıs, J. A. 1997. Erythrocyte membrane vesiculation: Model for the molecular mechanism of protein sorting. Proc Natl Acad Sci U S A, 94, 12969-74. Kotowıcz, K., Dıxon, G. L., Kleın, N. J., Peters, M. J. & Callard, R. E. 2000. Biological function of CD40 on human endothelial cells: costimulation with CD40 ligand and interleukin-4 selectively induces expression of vascular cell adhesion molecule-1 and P-selectin resulting in preferential adhesion of lymphocytes. Immunology, 100, 441-8. Lang, K. S., Duranton, C., Poehlmann, H., Myssına, S., Bauer, C., Lang, F., Wıeder, T. & Huber, S. M. 2003. Cation channels trigger apoptotic death of erythrocytes. Cell Death Differ, 10, 249-56. Lee, T. H., D'astı, E., Magnus, N., Al-Nedawı, K., Meehan, B. & Rak, J. 2011. Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer--the emerging science of cellular 'debris'. Semin Immunopathol, 33, 455-67. Losche, W., Scholz, T., Temmler, U., Oberle, V. & Claus, R. A. 2004. Platelet-derived microvesicles transfer tissue factor to monocytes but not to neutrophils. Platelets, 15, 109-15. Ludwıg, A. K. & Gıebel, B. 2012. Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication. Int J Biochem Cell Biol, 44, 11-5. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 43 Mandal, D., Mazumder, A., Das, P., Kundu, M. & Basu, J. 2005. Fas-, caspase 8-, and caspase 3-dependent signaling regulates the activity of the aminophospholipid translocase and phosphatidylserine externalization in human erythrocytes. J Biol Chem, 280, 39460-7. Manno, S., Takakuwa, Y. & Mohandas, N. 2002. Identification of a functional role for lipid asymmetry in biological membranes: Phosphatidylserine-skeletal protein interactions modulate membrane stability. Proc Natl Acad Sci U S A, 99, 1943-8. Mıyamoto, S., Kowalska, M. A., Marcınkıewıcz, C., Marcınkıewıcz, M. M., Mosser, D., Edmunds, L. H., Jr. & Nıewıarowskı, S. 1998. Interaction of leukocytes with platelet microparticles derived from outdated platelet concentrates. Thromb Haemost, 80, 982-8. Mohandas, N., Clark, M. R., Jacobs, M. S. & Shohet, S. B. 1980. Analysis of factors regulating erythrocyte deformability. J Clin Invest, 66, 563-73. Nguyen, D. B., Wagner-Brıtz, L., Maıa, S., Steffen, P., Wagner, C., Kaestner, L. & Bernhardt, I. 2011. Regulation of phosphatidylserine exposure in red blood cells. Cell Physiol Biochem, 28, 847-56. Orrenıus, S., Zhıvotovsky, B. & Nıcotera, P. 2003. Regulation of cell death: the calciumapoptosis link. Nat Rev Mol Cell Biol, 4, 552-65. Ouyang, L., Shı, Z., Zhao, S., Wang, F. T., Zhou, T. T., Lıu, B. & Bao, J. K. 2012. Programmed cell death pathways in cancer: a review of apoptosis, autophagy and programmed necrosis. Cell Prolif, 45, 487-98. Polgar, J., Matuskova, J. & Wagner, D. D. 2005. The P-selectin, tissue factor, coagulation triad. J Thromb Haemost, 3, 1590-6. Raposo, G. & Stoorvogel, W. 2013. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol, 200, 373-83. Ratajczak, J., Wysoczynskı, M., Hayek, F., Janowska-Wıeczorek, A. & Ratajczak, M. Z. 2006. Membrane-derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication. Leukemia, 20, 1487-95. Reınhardt, T. A., Lıppolıs, J. D., Nonnecke, B. J. & Sacco, R. E. 2012. Bovine milk exosome proteome. J Proteomics, 75, 1486-92. Romero, P. J. & Romero, E. A. 1999. The role of calcium metabolism in human red blood cell ageing: a proposal. Blood Cells Mol Dis, 25, 9-19. Sarkar, A., Mıtra, S., Mehta, S., Raıces, R. & Wewers, M. D. 2009. Monocyte Derived Microvesicles Deliver a Cell Death Message via Encapsulated Caspase-1. PLoS One, 4. Steffen, P., Jung, A., Nguyen, D. B., Muller, T., Bernhardt, I., Kaestner, L. & Wagner, C. 2011. Stimulation of human red blood cells leads to Ca2+-mediated intercellular adhesion. Cell Calcium, 50, 54-61. Templeton, N. S. 2002. Cationic liposome-mediated gene delivery in vivo. Biosci Rep, 22, 283-95. Tıffert, T., Etzıon, Z., Bookchın, R. M. & Lew, V. L. 1993. Effects of deoxygenation on active and passive Ca2+ transport and cytoplasmic Ca2+ buffering in normal human red cells. J Physiol, 464, 529-44. Tıffert, T. & Lew, V. L. 1997. Apparent Ca2+ dissociation constant of Ca2+ chelators incorporated non-disruptively into intact human red cells. J Physiol, 505, 403-10. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 44 Thomas, S. L., Bouyer, G., Cueff, A., Egee, S., Glogowska, E. & Ollıvaux, C. 2011. Ion channels in human red blood cell membrane: actors or relics? Blood Cells Mol Dis, 46, 261-5. Trams, E. G., Lauter, C. J., Salem, N., Jr. & Heıne, U. 1981. Exfoliation of membrane ectoenzymes in the form of micro-vesicles. Biochim Biophys Acta, 645, 63-70. Van Doormaal, F. F., Kleınjan, A., Dı Nısıo, M., Buller, H. R. & Nıeuwland, R. 2009. Cellderived microvesicles and cancer. Neth J Med, 67, 266-73. Vıdal, M. 2010. Exosomes in erythropoiesis. Transfus Clin Biol, 17, 131-7. Wıllıamson, P., Kulıck, A., Zachowskı, A., Schlegel, R. A. & Devaux, P. F. 1992. Ca2+ induces transbilayer redistribution of all major phospholipids in human erythrocytes. Biochemistry, 31, 6355-60. Wolf, P. 1967. The nature and significance of platelet products in human plasma. Br J Haematol, 13, 269-88. Woon, L. A., Holland, J. W., Kable, E. P. & Roufogalıs, B. D. 1999. Ca2+ sensitivity of phospholipid scrambling in human red cell ghosts. Cell Calcium, 25, 313-20. Yuan, A., Farber, E. L., Rapoport, A. L., Tejada, D., Denıskın, R., Akhmedov, N. B. & FARBER, D. B. 2009. Transfer of microRNAs by embryonic stem cell microvesicles. PLoS One, 4, e4722. Zhou, Q., Lı, M., Wang, X., Lı, Q., Wang, T., Zhu, Q., Zhou, X., Wang, X., Gao, X. & Lı, X. 2012. Immune-related microRNAs are abundant in breast milk exosomes. Int J Biol Sci, 8, 118-23. Zwaal, R. F., Comfurıus, P. & Bevers, E. M. 2004. Scott syndrome, a bleeding disorder caused by defective scrambling of membrane phospholipids. Biochim Biophys Acta, 1636, 119-28. Zwaal, R. F. & Schroıt, A. J. 1997. Pathophysiologic implications of membrane phospholipid asymmetry in blood cells. Blood, 89, 1121-32. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 45 [...]...hành đề tài Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng tới sự hình thành vi thể (microvesicle) từ tế bào hồng cầu tập trung vào vi c xác định các điều kiện ảnh hưởng tới sự hình thành vi thể và thu nhận vi thể từ tế bào hồng cầu 2 Mục đích nghiên cứu - Xác định được các điều kiện để cảm ứng để hình thành vi thể ở tế bào hồng cầu - Phát hiện sự xuất hiện vi thể thông qua protein gắn huỳnh... tương tự như sự lão hóa tế bào hồng cầu trong cơ thể thì vai trò của các protein khung xương tế bào liên quan đến sự hình thành vi thể vẫn có thể khác nhau trong điều kiện in vitro và in vivo Hơn Học vi n Nông nghiệp Vi t Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 13 thế nữa các kiểu hình thái khác nhau của tế bào hồng cầu cũng có thể liên quan hoặc ảnh hưởng tới sự hình thành vi thể là khác nhau... Nguyen et al., 2011) 1.2.2 Sự hình thành vi thể ở tế bào hồng cầu Các thành phần của màng tế bào hồng cầu đóng vai trò quan trọng trong vi c hình thành và giải phóng vi thể, chính vì vậy xác định được vai trò của các thành phần màng tế bào hỗ trợ rất nhiều cho vi c giải thích cơ chế hình thành các vi thể Màng tế bào hồng cầu bao gồm một lớp phospholipid kép mà bị xuyên qua bởi các protein xuyên màng (ví... cho sự hình thành và giải phóng các vi thể khỏi màng tế bào Kết quả nghiên cứu của Knowles và cs (1997) cho thấy, bộ khung xương tế bào hồng cầu không bị hỏng nhưng co lại vào trong tế bào khi màng tế bào biến dạng dưới áp lực (shear stress) (Knowles et al., 1997) Điều này có thể giải thích cho sự giải phóng các vi thể khỏi các thành phần khung xương tế bào Một nghiên cứu mô phỏng màng tế bào hồng cầu. .. ngoại bào) có khả năng hoạt hóa tiểu cầu (Andrews and Berndt, 2004) 1.1.3 Sự tương tác của vi thể với các tế bào Vi thể được tách ra từ màng tế bào nên chúng mang các thụ thể vốn là những protein màng, chính vì vậy vi thể có đóng vai trò tương tác giữa các tế bào, gắn với kháng kháng nguyên, kháng thể Chẳng hạn thụ thể CD41 có nguồn gốc từ tiểu cầu có thể tương tác với các tế bào nội mô hoặc các tế bào. .. gốc từ tiểu cầu, phần ít hơn có nguồn gốc từ các tế bào máu khác, mức độ MV từ hồng cầu tăng lên trong quá trình của một số bệnh lý như bệnh sốt rét và bệnh tế bào hình liềm (Barteneva et al., 2013) Đối với tế bào hồng cầu, những tế bào chưa trưởng thành tiết ra exosome trong khi đó tế bào trưởng thành tiết ra các microvesicle (Lee et al., 2011, de Vooght et al., 2013) Sự giải phóng vi thể từ tế bào hồng. .. canxi đã đẩy Ca2+ ra khỏi tế bào Do ở điều kiện bình thường, tế bào hồng cầu có nồng độ Ca2+ nội bào rất thấp, luôn được ổn định bởi hoạt động của bơm Ca2+ Hình 3.2 .Tế bào hồng cầu ở điều kiện sinh lý Hình ảnh tế bào hồng cầu sau 20 phút quan sát ở điều kiện sinh lý Dòng Ca2+ đi vào và ra khỏi tế bào (Ca2+ flux) được biểu diễn dưới dạng các đường trong Hình 3.3 Học vi n Nông nghiệp Vi t Nam – Luận văn Thạc... của các tế bào đích Một số nghiên cứu về MV có nguồn gốc từ một số tế bào biểu mô của người cho thấy vi thể cũng có thể hoạt động như một phương tiện để chuyển mRNA giữa các tế bào Các vi thể gắn với các tế bào bằng cách tương tác với các intergrin α4 và β1 trên bề mặt của chúng sau đó chuyển RNA như một dạng tải nạp mRNA từ vi thể đến tế bào đích Quá trình này đã được chứng minh bằn cách gắn các mRNA... thước của vi thể Học vi n Nông nghiệp Vi t Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về vi thể 1.1.1 Giới thiệu về vi thể Vi thể là những cấu trúc có kích thước nhỏ được hình thành và giải phóng từ các cấu trúc màng của tế bào Đến nay vi thể được phát hiện ở nhiều loại tế bào khác nhau trong cơ thể như: tế bào xương, tiểu cầu, hồng cầu, tế bào ung thư... giữa các cấu trúc màng tế bào (Nguyen et al., 2011, Steffen et al., 2011) 1.2 Nghiên cứu về sự hình thành vi thể ở tế bào 1.2.1 Sự hình thành và tiết của các vi thể Trong điều kiện sinh lý bình thường, các phospholipid trong màng tế bào phân bố không đồng đều giữa hai lớp màng Vì vậy, hai lớp màng sẽ khác nhau về thành phần phospholipid (Mandal et al., 2005) Cho đến nay, mô hình màng tế bào được nghiên . Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng tới sự hình thành vi thể (microvesicle) từ tế bào hồng cầu tập trung vào vi c xác định các điều kiện ảnh hưởng tới sự hình thành vi thể và thu nhận vi thể. nội bào đến sự hình thành vi thể 33 3.6.1 Ảnh hưởng của A23187 và Ca 2+ nội bào đến sự hình thành vi thể 33 3.6.2 Ảnh hưởng của LPA và Ca 2+ nội bào đến sự hình thành vi thể 34 3.6.3 Ảnh hưởng. hình thành vi thể ở tế bào 9 1.2.1 Sự hình thành và tiết của các vi thể 9 1.2.2 Sự hình thành vi thể ở tế bào hồng cầu 10 1.3 Vai trò sinh học của Ca 2+ 12 1.3.1 Vai trò của Ca 2+ trong điều