BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRÍCH LY VÀ TINH SẠCH ENDOGLUCANASE TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN DD9 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Ths. VÕ VĂN SONG TOÀN TRẦN NGỌC QUÍ PGs. Ts. TRẦN NHÂN DŨNG MSSV: 3112527 LỚP: CNSH K37 Cần Thơ, Tháng 12/2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRÍCH LY VÀ TINH SẠCH ENDOGLUCANASE TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN DD9 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Ths. VÕ VĂN SONG TOÀN TRẦN NGỌC QUÍ PGs. Ts. TRẦN NHÂN DŨNG MSSV: 3112527 LỚP: CNSH K37 Cần Thơ, Tháng 12/2014 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) (ký tên) Ths. Võ Văn Song Toàn Trần Ngọc Quí CÁN BỘ HƢỚNG DẪN (ký tên) PGs. Ts. Trần Nhân Dũng XÉT DUYỆT CỦA BỘ MÔN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 TRƢỞNG BỘ MÔN (ký tên) LỜI CẢM TẠ Sau thời gian học tập thực đề tài tốt nghiệp Đại học chuyên nghành Công nghệ sinh học viện NC&PT CNSH, nhận nhiều quan tâm từ gia đình, hướng dẫn dạy tận tình quý thầy cô với giúp đỡ nhiệt tình bạn bè để hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này. Cám ơn thầy Võ Văn Song Toàn, thầy Trần Nhân Dũng tận tâm hướng dẫn, bảo giúp đỡ suốt trình thực luận văn. Xin gửi lời cám ơn đến Ban lãnh đạo Viện NC&PT Công nghệ Sinh học quý thầy cô Viện tạo điều kiện truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu giúp có kiến thức hữu ích phục vụ cho việc thực đề tài. Cám ơn tổ bảo vệ Viện giúp đỡ, hỗ trợ cho làm việc phòng thí nghiệm để hoàn thành luận văn thời hạn. Xin chân thành cám ơn bạn sinh viên, anh chị học viên cao học phòng thí nghiệm Sinh hóa phòng Công nghệ Enzyme toàn thể lớp Công nghệ sinh học khóa 37 nhiệt tình ủng hộ chia sẻ kinh nghiệm giúp hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân động viên, khích lệ ủng hộ mặt vật chất tinh thần suốt thời gian học tập thực luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn! Cần thơ, ngày 28 tháng 11 năm 2014 Trần Ngọc Qúi Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT TÓM LƢỢC Enzyme cellulase tổng hợp nhiều Bacillus subtilis có nhiều ứng dụng quan trọng. Đề tài “Trích ly tinh endoglucanase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn cỏ dê DD9” thực nhằm mục tiêu tinh endoglucanase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn DD9. Dòng vi khuẩn DD9 đồng hình với Bacillus subtilis RC24 mức độ 94% . Dịch vi khuẩn DD9 nuôi cấy môi trường có chất bã mía sau ủ kỵ khí ngày 380C để thu nhận enzyme ngoại bào. Từ lít dịch enzyme thô ban đầu có hàm lượng protein tổng 54,3 mg, hoạt tính tổng 4311 U, đánh giá qua ba phương pháp tinh sạch: tủa phân đoạn với ammonium sulphate, tủa với ethanol tủa với acetone. Endoglucanase thể hàm lượng hoạt tính protein cao (1,012 mg 908 U) tủa với 40-80% ammonium sulphate. Bốn phân đoạn tủa 4070% ammonium sulphate tinh sắc ký trao đổi ion gel Uno Sphere Q. SDS-PAGE kết hợp với phương pháp nhuộm bạc xác định hai endoglucanase với trọng lượng phân tử xấp xỉ (có thể hai đồng phân) 51 kDa 53 kDa với hiệu suất tinh 6% độ tinh lần. Từ khóa: Vi khuẩn DD9, endoglucanase, tủa phân đoạn, sắc ký trao đổi ion. ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ TÓM LƢỢC i MỤC LỤC . ii DANH SÁCH HÌNH .vi TỪ VIẾT TẮT vii CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU .1 1.1. Đặt vấn đề 1.2. Mục tiêu đề tài .2 CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan Bacillus subtilis 2.1.1. Lịch sử phát .3 2.1.2. Phân loại 2.2. Tổng quan Endoglucanase 2.2.1. Cấu trúc chế hoạt động endoglucanase .4 2.2.2. Ảnh hưởng số yếu tố đến hoạt tính endoglucanase 2.2.2.1. Ảnh hưởng nhiệt độ 2.2.2.2. Ảnh hưởng pH 2.2.2.3. Tính đặc hiệu chất endoglucanase .7 2.2.2.4. Ảnh hưởng số chất ức chế hoạt hóa .7 2.3. Các phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp kết tủa protein .7 2.3.1.1. Phương pháp tủa muối .7 2.3.1.2. Phương pháp tủa dung môi hữu 2.3.1.3. Phương pháp tủa điểm đẳng điện .9 2.3.1.4. Tủa ion kim loại .10 ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 2.3.3. Trường ĐHCT Một số phương pháp sắc ký 11 2.3.3.1 Sắc ký trao đổi ion .11 2.3.3.2 Sắc ký lọc gel 12 2.3.4. Phương pháp điện di gel polyacrylamide (Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE) .13 2.3.4.1. Điện di gel điều kiện có chất gây biến tính SDS βmercaptoethanol .14 2.3.5. Một số phương pháp khác .15 2.3.5.1. Phương pháp Bradford 15 2.3.5.2. Phương pháp Nelson Smogyi 17 2.3.5.3. Phương pháp định tính đường kính vòng tròn thủy phân 17 2.4. Tình hình nghiên cứu nƣớc 17 2.4.1 Tình hình nghiên cứu nước .17 2.4.2 Tình hình nghiên cứu nước .18 CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu .20 3.1.1. Thời gian địa điểm 20 3.1.2. Dụng cụ, thiết bị 20 3.1.3. Nguyên vật liệu .20 3.1.4. Hóa chất .20 3.1.5. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật 21 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .22 3.2.1. Tinh endoglucanase phương pháp kết tủa 22 3.2.1.1. Kết tủa phân đoạn endoglucanase với Ammonium Sulfate bãohòa .22 3.2.1.2. Kết tủa endoglucanase với ethanol .22 3.2.1.3. Kết tủa endoglucanase với acetone .23 3.2.2. Tinh endoglucanase phương pháp sắc ký trao đổi ion .23 ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1. Tinh endoglucanase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn DD9 25 4.1.1 Tinh endoglucanase phương pháp tủa phân đoạn với ammonium sulphate .25 4.1.2 Tinh endoglucanase phương pháp tủa với ethanol 27 4.1.3 Tinh endoglucanase phương pháp tủa evới acetone 28 4.1.4 Tinh endoglucanase phương pháp sắc ký trao đổi ion âm 30 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .35 5.1. Kết luận .35 5.2. Kiến nghị .35 TÀI LIỆU THAM KHẢO .36 PHỤ LỤC PHỤ LỤC ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Bảng 1. Thành phần môi trường cải tiến (M1) 21 Bảng 2. Thành phần môi trường cải tiến (M2) 21 Bảng 3. Kết tủa phân đoạn với ammonium sulphate 25 Bảng 4. Kết tủa với ethanol 27 Bảng 5. Kết tủa với acetone 28 Bảng 6. So sánh hiệu ba phương pháp tủa .30 Bảng 7. Kết sắc ký gel Uno Sphere Q .31 ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Hình 1.Vi khuẩn Bacillus subtilis Hình 2. Mô hình cấu trúc endoglucanase Hình 4. Tủa phân đoạn protein với Ammonium sulfate Hình 5. Đồ thị hàm log biểu diễn độ hòa tan prtotein biến thiên theo nồng độ muối .8 Hình 6. Tỷ lệ protein tủa theo pH 10 Hình 7. Các trình phương pháp sắc ký sinh học 12 Hình 8. Sắc ký lọc Gel .13 Hình 9. Sự phân tách protein phương pháp điện di SDS-PAGE 14 Hình 10. Minh họa phản ứng Coomassie G-250 với protein 16 Hình 11. Kết đường kính vòng halo phân đoạn tủa AS .26 Hình 12. Kết đường kính vòng halo tỷ lệ tủa ethanol 27 Hình 13. Kết đường kính vòng halo tỷ lệ tủa acetone 29 Hình 14. Sắc ký đồ gel Uno Sphere Q .30 Hình 15. Kết định tính endoglucanase tinh phân đoạn sắc ký .31 Hình 16. Kết điện di SDS-PAGE phân đoạn tủa AS 32 Hình 17. Kết điện di SDS-PAGE phân đoạn sắc ký .33 ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT 2. Đƣờng chuẩn Nelson Bảng 14. Gía trị OD520nm đƣờng chuẩn Nelson Nồng độ glucose 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 (µg/ml) OD1 0,078 0,156 0,303 0,375 0,481 0,670 OD2 0,078 0,166 0,295 0,407 0,486 0,710 OD3 0,075 0,161 0,315 0,372 0,494 0,642 TB-ĐC 0±0,002 0,084±0,005 0,227±0,010 0,308±0,019 0,410±0,006 0,597±0,034 0,70 y = 0,003x - 0,037 R² = 0,979 0,60 0,50 OD 520nm 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 50 100 150 200 Nồng độ glucose (µg/ml) Hình 18. Đƣờng chuẩn Nelson ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT 3. Kết thí nghiệm 1: Tủa endoglucanase với Ammonium Sulphate Bảng 15. Kết đo OD595nm định lƣợng protein Mẫu nƣớc (ĐC): 0,795 Nồng độ Trung Bình OD595nm OD-ĐC Thô 0,921 0,128±0,015 40% AS 0,941 0,148±0,025 50% AS 0,854 26,8±0,017 60% AS 1,58 0,689±0,016 70% AS 1,06 0,163±0,023 80% AS 0,950 0,055±0,009 90% AS 0,871 0,078±0,019 Bảng 12. Kết định lƣợng protein Hàm lƣợng protein Nồng độ Thể tích (ml) Thô 900 0,060±0,007 54,3±6,56 40% AS 21 0,071±0,012 1,31±0,258 50% AS 26 0,027±0,009 0,698±0,222 60% AS 12 0,341±0,008 4,09±0,100 70% AS 11 0,078±0,005 0,858±0,061 80% AS 0,027±0,004 0,223±0,040 90% AS 15 0,036±0,009 0,535±0,139 (mg/ml) Protein tổng (mg) ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT Bảng 16. Kết đo OD520nm định tính protein Nồng độ Trung Bình OD520nm OD-ĐC Thô 0,304 0,098±0,023 40% AS 0,353 0,127±0,036 50% AS 0,285 0,055±0,011 60% AS 0,367 0,114±0,031 70% AS 0,357 0,061±0,031 80% AS 0,379 0,013±0,013 90% AS 0,365 Bảng 17. Kết định tính protein Nồng độ Thể tích Hoạt tính (U/ml) Hoạt tính tổng (U) (ml) Thô 900 4,79±1,74 4311±1564 40% AS 21 12,15±2,70 255±56,8 50% AS 26 6,84±0,813 178±21,1 60% AS 12 11,24±2,30 135±27,6 70% AS 11 7,28±2,26 80,1±24,8 80% AS 3,73±0,941 33,6±8,5 90% AS 15 ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT Bảng 18. Kết đƣờng kính vòng halo Enzyme lần lần lần Thô 40%AS 6±1 50%AS 7±1 60%AS 4,33±0,577 70%AS 4,67±0,577 80%AS Trung Bình 4. Kết thí nghiệm 2: Tủa endoglucanase với ethanol Bảng 19. Kết đo OD595nm định lƣợng protein Mẫu nƣớc (ĐC): 0,818 Tỷ lệ tủa enzyme: ethanol Trung Bình OD595nm OD-ĐC Thô 0,921 0,128±0,015 1:1 0,887 0,069±0,028 1:2 1,04 0,223±0,022 1:3 0,983 0,165±0,043 1:4 1,01 0,193±0,007 Bảng 20. Kết định lƣợng protein Tỷ lệ tủa Thể tích (ml) Hàm lƣợng protein (mg/ml) Protein tổng (mg) Thô 200 0,060±0,007 12,1±1,457 1:1 0,031±0,014 0,248±0,111 1:2 0,108±0,011 0,864±0,089 1:3 0,079±0,022 0,473±0,131 1:4 0,098±0,003 0,590±0,021 enzyme: ethanol ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT Bảng 21. Kết đo OD520nm định tính protein Tỷ lệ tủa enzyme: Trung bình OD520nm OD-ĐC Thô 0,304 0,098±0,023 1:1 0,328 0,04±0,007 1:2 0,397 30,3±0,015 1:3 0,376 0,03±0,018 1:4 0,315 ethanol Bảng 22. Kết định tính protein Tỷ lệ tủa enzyme: Thể tích (ml) Hoạt tính (U/ml) Hoạt tính tổng (U) Thô 200 4,79±1,74 958±347 1:1 5,38±0,52 43,1±4,16 1:2 6,74±1,09 53,9±8,73 1:3 5,28±1,34 31,7±8,06 1:4 ethanol Bảng 22. Kết đƣờng kính vòng halo Ti le tua lần lần lần Thô 1:1 1:2 7,33±0,577 1:3 4,67±0,577 1:4 Trung Bình ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT 5. Kết thí nghiệm 3: Tủa endoglucanase với acetone Bảng 24. Kết đo OD595nm định lƣợng protein Mẫu nƣớc (ĐC): 0,818 Tỷ lệ tủa enzyme: aceton Trung Bình OD595nm OD-DC Thô 0,921 0,128±0,015 1:1 0,941 0,123±0,015 1:2 0,958 0,140±0,008 1:3 1,07 0,250±0,010 1:4 1,08 0,259±0,018 Bảng 25. Kết định lƣợng protein Tỷ lệ tủa Thể tích (ml) Hàm lƣợng protein (mg/ml) Protein tổng (mg) Thô 200 0,060±0,007 12,1±1,46 1:1 0,058±0,008 0,175±0,023 1:2 0,077±0,004 0,232±0,014 1:3 0,122±0,005 0,365±0,016 1:4 0,126±0,009 0,378±0,027 enzyme: ethanol ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT Bảng 26. Kết đo OD520nm định tính protein Tỷ lệ tủa enzyme: Trung bình OD520nm OD-DC Thô 0,304 0,098±0,023 1:1 0,268 0,043±0,026 1:2 0,163 0,019±0,010 1:3 0,225 0,009±0,008 1:4 0,327 0,110±0,006 ethanol Bảng 27. Kết định tính protein Tỷ lệ tủa enzyme: Hoạt tính tổng Thể tích (ml) Hoạt tính (U/ml) Thô 200 4,79±1,74 958±347 1:1 2,21±1,89 17,7±5,67 1:2 1,56±0,760 12,5±2,28 1:3 1,69±0,594 10,1±1,78 1:4 5,46±0,408 32,7±1,22 ethanol (U) Bảng 28. Kết đƣờng kính vòng halo Ti le tua lần lần lần Trung Bình Thô 1:1 6,33±0,577 1:2 1:3 4,67±0,577 1:4 8,67±0,577 ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT 6. Kết thí nghiệm Bảng 26. Kết OD280nm phân đoạn sắc ký gel Uno Sphere Q Ống OD280nm Ống OD280nm Ống OD280nm Ống OD280nm 0,206 31 0,178 61 0,528 91 0,427 0,200 32 0,255 62 0,538 92 0,437 0,205 33 0,525 63 0,552 93 0,467 0,268 34 0,734 64 0,576 94 0,438 0,233 35 0,322 65 0,580 95 0,431 0,267 36 0,433 66 0,588 96 0,439 0,265 37 0,420 67 0,632 97 0,453 0,219 38 0,349 68 0,656 98 0,370 0,450 39 0,189 69 0,679 99 0,339 10 0,557 40 0,159 70 0,679 100 0,332 11 0,599 41 0,168 71 0,667 101 0,332 12 1,061 42 0,133 72 0,638 102 0,330 13 0,959 43 0,118 73 0,624 103 0,330 14 0,881 44 0,117 74 0,603 104 0,307 15 0,892 45 0,180 75 0,580 105 0,289 16 0,821 46 0,176 76 0,561 106 0,284 17 0,946 47 0,175 77 0,545 107 0,301 18 0,863 48 0,208 78 0,528 108 0,304 19 0,795 49 0,217 79 0,521 109 0,270 20 0,789 50 0,232 80 0,521 110 0,260 21 0,223 51 0,226 81 0,509 111 0,276 22 0,159 52 0,203 82 0,496 112 0,260 23 0,186 53 0,217 83 0,473 113 0,303 24 0,179 54 0,261 84 0,378 114 0,270 25 0,205 55 0,331 85 0,382 115 0,263 26 0,182 56 0,389 86 0,389 116 0,252 27 0,156 57 0,421 87 0,415 117 0,250 28 0,207 58 0,449 88 0,460 118 0,255 29 0,220 59 0,479 89 0,436 119 0,270 30 0,248 60 0,505 90 0,435 ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT Bảng 27. Kết đo OD 595nm định lƣợng protein Mẫu H2O (ĐC): 0,631 Phân đoạn TB TB-ĐC UB 0,649 0,018 F1 0,693 0,062±0,007 F2 0,687 0,056±0,004 F3 0,702 0,071±0,003 F4 0,703 0,072±0,002 F5 0,676 0,045 Bảng 28. Kết định lƣợng protein Hàm lƣợng protein Hàm lƣợng protein tổng (µg/ml) (mg) 32 F1 11 3,50 0,038±0,037 F2 0,333 0,001±0,009 F3 30 8,17 0,245±0,045 F4 12,5 0,100±0,018 F5 18 Phân đoạn Thể tích (ml) UB ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT Bảng 29. Kết đo OD520nm định lƣợng hoạt tính Phân đoạn Trung bình (TB) Đối chứng (ĐC) TB-ĐC UB 0,156 0,185 F1 0,196 0,169 0,027±0,008 F2 0,142 0,221 F3 0,176 0,141 0,035±0,014 F4 0,144 0,111 0,032±0,018 F5 0,138 0,151 Bảng 30. Kết định tính Phân đoạn Thể tích (ml) Hoạt tính (U/ml) Hoạt tính tổng (U) UB 32 F1 11 3,63±0,945 39,9±10,4 F2 F3 30 4,44±1,59 133±47,9 F4 12,5 4,15±2,05 51,9±25,7 F5 18 ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT Bảng 31. Số liệu đƣờng tuyến tính trọng lƣợng phân tử khoảng cách di chuyển protein chuẩn Băng M (kDa) logM Rp (cm) 116 2,06 1,2 0,222 66,2 1,82 1,9 0,352 45 1,65 2,6 0,481 35 1,54 3,2 25 1,40 4,1 0,759 18,4 1,26 5,1 0,944 14,4 1,16 5,4 1,00 RB (cm) Rf=Rp/RB 5,4 0,593 2,5 y = -1,069x + 2,223 R² = 0,969 Log M 1,5 0,5 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,2 Rf Hình 19. Đƣờng chuẩn trọng lƣợng phân tử protein chuẩn Bảng 32. Trọng lƣợng phân tử băng protein tinh Băng Rp (cm) RB (cm) Rf=Rp/RB Log M M (kDa) 2,1 5,5 0,382 1,722 53 2,2 5,5 0,400 1,705 51 ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT PHỤ LỤC 3. KẾT QUẢ THỐNG KÊ Kết thống kê đƣờng kính thủy phân thí nghiệm ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT Kết thống kê đƣờng kính thủy phân thí nghiệm ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT Kết thống kê đƣờng kính thủy phân thí nghiệm ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT LÝ LỊCH KHOA HỌC I. LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên sinh viên: Trần Ngọc Qúi Ngày, tháng năm sinh: 25/12/1993 Nơi sinh: Châu Thành, Cần Thơ Địa nay: Ấp nhơn phú 2, xã nhơn nghĩa A, huyện Châu Thành A, Tỉnh Hậu Giang Điện thoại: 01644197444 E-mail: qui112527@student.ctu.edu.vn II. QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO 1. Đại học Hệ đào tạo: Chính quy Nghành đào tạo: Công nghệ Sinh học 2. Trình độ ngoại ngữ Chứng anh văn trình độ B (Trung tâm ngoại ngữ - Đại học Cần Thơ) ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học [...]... (2006) đã tinh sạch và khảo sát hoạt tính của endoglucanase từ loài vi khuẩn chịu nhiệt Bacillus licheniformis với hoạt tính đặc hiệu 183 (U/mg), hiệu suất tinh sạch 17% Sadhu et al 2013 đã tinh sạch và khảo sát hoạt tính, khả năng sinh endoglucanase từ chủng vi khuẩn chịu nhiệt phân lập từ phân bò Kết quả endoglucanase được tinh sạch gấp 8,5 lần so với dịch enzyme thô ban đầu, hiệu suất tinh sạch 68,1%,... (1944)  Xác định trọng lượng phân tử và độ tinh sạch của endoglucanase bằng phương pháp SDS-PAGE _ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 24 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Tinh sạch endoglucanase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn DD9 4.1.1 Tinh sạch endoglucanase bằng phƣơng pháp tủa... subtilis RC24” được thực hiện, mở ra hướng nghiên cứu mới về cellulase trên đối tượng vi khuẩn 1.2 Mục tiêu đề tài Đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu tinh sạch endoglucanase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn DD9 bằng sắc ký trao đổi ion âm _ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT... nghiên cứu trong nƣớc Trong nước ta, đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào về tinh sạch cellulase nói chung hay endoglucanase nói riêng trên vi khuẩn Bacillus được công bố Các nghiên cứu trong nước chủ yếu chỉ tập trung vào cellulase thu nhận từ nấm Trịnh Đình Khá và ctv (2007), tinh sạch sơ bộ và đánh giá tính chất hoá lý của cellulase từ chủng Penicillium sp DTQ-HK1 sau khi tủa bằng 95% acetone hoặc ethanol... Schumann, 2007; Zhang và Zhang, 2010) Nhưng trên thực tế các nghiên cứu về cellulase từ Bacillus vẫn còn hạn chế so với các nghiên cứu được thực hiện trên nấm Các enzyme chỉ thể hiện đầy đủ hoạt tính và chức năng sinh học khi không có lẫn tạp chất, tinh sạch là bước đầu cần thiết trong vi c tìm hiểu chức năng của protein (Berg et al., 2002) Do đó đề tài trích ly tinh sạch endoglucanase từ Bacilus subtilis... hằng số tốc độ phản ứng và ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của enzyme Tùy vào từng chủng loài vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy cụ thể mà nhiệt độ tối ưu của endoglucanase có thể khác nhau Nhiệt độ tố ưu của endoglucanase khảo sát ở dòng Bacillus phân lập từ phân bò khoảng 50oC (Sadhu et al., 2013), ở Bacillus circulans là 45oC (Nirmala et al., 2011), trong khi ở dòng Bacillus M-9 endoglucanase có hoạt... trong nuôi cấy tế bào và tái tổ hợp, phá vở thành tế bào thực vật giúp cho vi t ly trích các chất từ thực vật được dể dàng Điều này còn giúp vi c nghiên cứu nuôi cấy tế bào “trần” lai tạo những tế bào khác nhau tạo ra tế bào mới theo mong muốn (Nguyễn Đức Lượng, 2002) Trong công nghiệp cellulase có nhiều ứng dụng _ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Vi n... tử protein thu được qua SDS-PAGE là 97 kDa Vijayaraghavan et al (2011) cũng đã có báo cáo về kết quả tinh sạch carboxymethyl cellulase (Endoglucanase) từ một chủng Bacillus, được phân lập từ ruộng lúa Kết quả enzyme được tinh sạch có hoạt tính đặc hiệu 246U/mg, độ tinh sạch _ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 18 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt... ưu 5,6-5,8 và nhiệt độ tối ưu 65oC Enzyme tinh sạch bằng SDS-PAGE với trọng lượng phân tử 35,5 kDa và sắc ký lọc gel Sephadex G-75 vởi trọng lượng phân tử 70 kDa Baba et al (2005) tinh sạch và khảo sát hoạt tính của endo-1,4-beta-D-glucanase mới từ Beltraniella portoricensis, với trọng lượng phân tử enzyme sau khi tinh sạch là 40 kDa được xác định bằng phương pháp SDS-PAGE, pH tối ưu là 4,5 và nhiệt... Bacillus subtilis đã và đang được nghiên cứu rộng rãi với nhiều tiềm năng và ứng dụng hiệu quả trong chăn nuôi, công nghiệp, xử lý môi trường… 2.1.2 Phân loại Theo phân loại của Bergey (1974), vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc Giới (Kingdom) : Bacteria Nghành (Division) : Firmicutes Lớp (Class) : Bacilli Bộ (Oder) : Bacillales Họ (Family) : Bacillaceae Giống (Genus) : Bacillus Hình 1 .Vi khuẩn Bacillus subtilis . nuôi cấy vi khuẩn dạ cỏ dê DD9 được thực hiện nhằm mục tiêu tinh sạch endoglucanase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn DD9. Dòng vi khuẩn DD9 đồng hình với Bacillus subtilis RC24 ở mức độ 94% . Dịch vi. Công nghệ Sinh học iv Vi n NC&PT Công nghệ Sinh Học CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1. Tinh sạch endoglucanase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn DD9 25 4.1.1 Tinh sạch endoglucanase bằng phương. cứu mới về cellulase trên đối tượng vi khuẩn. 1.2. Mục tiêu đề tài Đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu tinh sạch endoglucanase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn DD9 bằng sắc ký trao đổi ion âm.