BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ------------------------ĐẶNG XUÂN CƢỜNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN PHLOROTANNIN TỪ RONG MƠ (SARGASSUM SERRATUM) TẠI NHA TRANG VÀ THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG TRONG ĐỒ UỐNG CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến Thủy sản Mã số: 62540105 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT Nha Trang - 2015 Công trình hoàn thành tại: Trường Đại học Nha Trang Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang. Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Vũ Ngọc Bội Trường Đại học Nha Trang 2. PGS. TS. Trần Thị Thanh Vân Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang Phản biện 1: GS. TSKH Nguyễn Trọng Cẩn Phản biện 2: PGS. TS Phùng Thị Thanh Tú . Phản biện 3: PGS. TS Nguyễn Anh Tuấn . Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án Tiến sỹ cấp Trường họp tại: …………………………………………………………………………… Vào hồi …………giờ ……… ngày ……tháng ……….năm……… Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Trường Đại học Nha Trang thư viện Quốc gia Hà Nội. MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết luận án Rong nâu (Phaeophyta) loại rong giàu chất có hoạt tính sinh học lamilaran, fucoidan, alginate, phlorotannin, … Các chất có nhiều hoạt tính sinh học, đáng ý hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm…. Ngành rong nâu (Phaeophyta) có nhiều họ như: Alariaceae, Fucaceae Sargassaceae. Ở Việt Nam, chi rong mơ (Sargassum) thuộc họ rong mơ (Sargassaceae) biết chi rong có sản lượng lớn có giá trị cao, chi rong có chứa nhiều hoạt chất sinh học có giá trị fucoidan, laminaran, alginate, phlorotannin,…. Trong đáng ý phlorotannin - hợp chất chuyển hóa thứ cấp kiểu hỗn hợp phenolic. Phlorotannin có nhiều hoạt tính sinh học khác như: hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm, chống khối u, ngừa ung thư,… Hoạt tính chống oxy hóa phlorotannin hoạt tính nghiên cứu nhiều phlorotannin biết đến chất chống oxy hóa không độc an toàn với người nên khai thác sử dụng hỗ trợ thể đào thải gốc tự giúp tăng cường sức khỏe. Do vậy, phlorotannin từ rong mơ nhà nghiên cứu quan tâm. Vùng biển Nha Trang có nguồn lợi rong mơ Sargassum phong phú đa dạng số lượng, chủng loại. Mặt khác, rong mơ vùng biển Nha Trang cho có chứa hoạt chất sinh học fucoidan, phlorotannin, alginate,…. với hàm lượng cao. Do việc nghiên cứu “Nghiên cứu thu nhận phlorotannin từ rong mơ Sargassum serratum Nha Trang thử nghiệm sử dụng đồ uống có hoạt tính chống oxy hóa” cần thiết. 2. Mục tiêu Luận án: - Nghiên cứu thu nhận phlorotannin có hoạt tính chống oxy hóa từ rong mơ (Sargassum serratum) thu hoạch vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa. - Thử nghiệm sử dụng phlorotannin đồ uống có hoạt tính chống oxy hóa. 3. Đối tƣơng phạm vi nghiên cứu 3.1. Đối tƣợng nghiên cứu Rong mơ (Sargassum serratum) sinh trưởng vùng biển Nha Trang thu mẫu, rửa nước mặn, sấy khô đến độ ẩm 19% bảo quản nhiệt độ thường để dùng làm nguyên liệu suốt trình nghiên cứu thu nhận phlorotannin. 3.2. Phạm vi nghiên cứu: gồm phần 1) Nghiên cứu tách chiết tối ưu hóa trình thu nhận phlorotannin từ rong mơ (Sargassum serratum) thu hoạch vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa. 2) Bước đầu phân đoạn tinh phlorotannin thu nhận từ rong mơ (Sargassum serratum). 3) Nghiên cứu sấy phun để thu nhận bột phlorotannin từ dịch chiết rong mơ S. serratum. 4) Đánh giá độc tính phlorotannin thu từ rong mơ S. serratum. 5) Thử nghiệm sử dụng phlorotannin đồ uống có hoạt tính chống oxy hóa. 4. Phƣơng pháp nghiên cứu Luận án sử dụng phương pháp nghiên cứu chuẩn Thế giới Việt Nam nghiên cứu thu nhận phlorotannin từ rong mơ (Sargassum serratum), có sử dụng toán học để tối ưu hóa nhằm tìm quy luật, phát tính chất mới, mối quan hệ đại lượng kiểm chứng giả thuyết. 5. Các đóng góp mặt khoa học - Lần nghiên cứu cách toàn diện phlorotannin rong mơ (Sargassum serratum) thu hoạch vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa từ nghiên cứu tối ưu hóa trình tách chiết đến tinh sạch, thử nghiệm độc tính chuột, nghiên cứu sấy phun để tạo bột chế phẩm phlorotannin có hoạt tính chống oxy hóa cao thử nghiệm sản xuất đồ uống phlorotannin có hoạt tính chống oxy hóa. Do vậy, kết nghiên cứu Luận án có ý nghĩa khoa học cao. Kết góp phần khẳng định giá trị nguồn lợi rong biển Việt Nam. Mặt khác, kết luận án tài liệu tham khảo phục vụ cho nghiên cứu giảng dạy lĩnh vực nghiên cứu chất tự nhiên từ rong biển. - Kết nghiên cứu luận án sở để doanh nghiệp sản xuất thực phẩm phát triển thương mại hóa số sản phẩm từ phlorotannin thu nhận từ rong mơ (Sargassum serratum) thu hoạch vùng biển Nha Trang. 6. Kết cấu luận án Luận án bao gồm 171 trang, 34 trang tổng quan, 22 trang phương pháp nghiên cứu, 89 trang kết nghiên cứu, kết luận trang, tài liệu tham khảo 24 trang phụ lục. CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ RONG MƠ Rong mơ nguồn tài nguyên giàu hoạt chất sinh học với hoạt tính sinh học phong phú đa dạng, chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm, chống đông tụ chống xạ UV-B, khả làm lành vết thương tái tạo cấu trúc tế bào (Kang ctv., 2003). Thực tế cho thấy, tỉnh Khánh Hòa có 21 loài rong mơ loài Sargassum serratum loài phân bố rộng, trữ lượng lớn loài mới, có chứa nhiều chất có hoạt tính tự nhiên fucoidan, phlorotannin,… chưa nghiên cứu cách đầy đủ. 1.2. GIỚI THIỆU VỀ PHLOROTANNIN Phlorotannin hoạt chất chống oxy hóa mạnh mẽ có nguồn gốc từ rong mơ (Ahn cộng (2007); Kang cộng (2003); LIM (2002); Kuda (2007) Shibata (2008)). Phlorotannin có đơn vị phloroglucinol (1,3,5-trihydroxybenzene) với kích thước phân tử dao động khoảng 126 Da - 650 kDa (Singh cộng (2006)) có kiểu liên kết đặc trưng cấu trúc như: liên kết ether, liên kết phenyl, liên kết ether liên kết phenyl, liên kết dibenzodioxin (La Barre cộng (2010)). Điều thú vị hàm lượng, cấu trúc chế chống oxy hóa polyphenol/ phlorotannin rong nâu có mối liên hệ chặt chẽ với hoạt tính chống oxy hóa. Phlorotannins hỗn hợp phenolic với chất polymer phloroglucinol, chúng tồn nhiều họ ngành rong nâu như: Alariaceae, Fucaceae Sargassaceae. Như thấy phlorotannin hoạt chất đáng để quan tâm nghiên cứu. 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ PHLOROTANNIN TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM * Tình hình nghiên cứu phlorotannin giới Nhiều nghiên cứu rằng, hỗn hợp phenolic rong nâu phlorotannin (Jormalainen cộng sự, (2004); Koivikko cộng sự, (2007); Swanson cộng sự, (2002)). Siti A. Budhiyanti cộng (2012) công bố khả bắt gốc tự (DPPH) dao động từ 14,61 ÷ 48,71% 0,17 ÷ 44,05% tương ứng dịch chiết từ thành tế bào tế bào chất có nồng độ 0,45 mg/ml; hoạt tính khử sắt dao động từ 2,05 ÷ 12,51% 26,77 ÷ 68,80% tương ứng dịch chiết từ tế bào chất thành tế bào số loài Sargassum thu bờ biển Indonesia có nồng độ 0,45 mg/ml sử dụng, dịch chiết chứa phlorotannin. Hoạt tính bắt gốc tự DPPH loài S. ramifolium S. pteropleuron với số oxi hóa EC50 dao động từ 6,64 đến 7,14 mg/ml (Mayalen Zubia cộng sự, 2007). Đồng thời Soo Jin Heo cộng (2005) khả bắt gốc tự loài S. thunbergii S. fulvellum tương ứng 97,41% 84,66%. Hoạt tính chống oxy hóa mạnh phlorotannin tinh chế từ số loài rong nâu có mối liên hệ mật thiết với phân tử skeleton (Ahn cộng sự, 2007). Như thấy có đa dạng hoạt tính hoạt lực phlorotannin loài rong Sargassum khác giới. Những nghiên cứu công bố Barry Halliwell (2001) cho thấy, phlorotannin có khả giảm thiểu tổn thương tế bào tác động gốc tự như: superoxide, hydroxyl, peroxyl, alkoxyl, hydroperoxyl, nitric oxide nitrogen dioxide coi gốc tự do. Điều minh chứng loài S. ringgoldianum có khả bắt gốc (.OH) đến 78% (O2-) đến 88,4% hoặt tính bắt gốc tự (DPPH) loài S. vulgare 0,2% ÷ 20,3% (Naja cộng sự, 2012) loài S. pallidum có hoạt tính chống oxy hóa tổng dao động từ 0,04 ± 0,02 đến 52,08 ± 0,02µmol FeSO4/mg (Hong Ye cộng sự, 2009). * Tình hình nghiên cứu nƣớc phlorotannin Phlorotannin chống oxy hóa chiết từ rong nâu bước đầu nghiên cứu Việt Nam từ năm 2009. Tuy nhiên đến năm 2010 có số công bố hoạt tính chống oxy hóa số loài rong nâu vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa, Việt Nam công bố nhóm nghiên cứu tác giả công bố. 1.4. ỨNG DỤNG SẤY PHUN TẠO BỘT CHỨA PHLOROTANNIN Thực tế cho thấy kỹ thuật sấy phun giúp chuyển hóa hoạt chất từ dạng dịch qua dạng bột, loại bỏ hầu hết dung môi, tiết kiệm chi phí vận chuyển, nâng cao thời gian bảo quản hoạt chất quan trọng hình thành hạt vi nang nâng cao độ bền hoạt chất nhờ khả liên kết bao gói chất trợ sấy đính kèm trình sấy phun. Nên kỹ thuật sấy phun phù hợp để tạo bột phlorotannin chống oxy hóa có nguồn gốc từ rong biển. Từ phân tích thấy rằng, giới chưa có công trình nghiên cứu chiết tách, tối ưu, sấy phun tạo bột ứng dụng, xác định cấu trúc phlorotannin từ rong nâu Sargassum serratum sinh trưởng bờ biển Nha Trang, Khánh Hòa, Việt Nam hay sàng lọc đánh giá hàm lượng trữ lượng theo mùa vụ thời gian sinh trưởng tích lũy phân bố phần rong hay theo thời gian bảo quản. Do Luận án tập trung nghiên cứu vấn đề trên. CHƢƠNG II. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Rong mơ (Sargassum serratum) thuộc: Ngành (Phaeophyta), Lớp (Phaeophyceae), Bộ (Fucales), Họ (Sargassaceae), Chi (Sargassum). Rong mơ (Sargassum serratum) sinh trưởng vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa thu mẫu, rửa nước mặn, sấy khô đến độ ẩm 19% bảo quản nhiệt độ thường để dùng suốt trình nghiên cứu. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phƣơng pháp phân tích 2.2.1.1. Phƣơng pháp định lƣợng phlorotannin: theo Swanson cộng sự, 2002, với phloroglucinol chất chuẩn. 2.2.1.2. Phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa + Hoạt tính chống oxy hóa tổng (TA): theo phương pháp Prieto cộng sự, (1999) với chất chuẩn acid ascorbic. + Hoạt tính khử Fe (RP): xác định theo Zhu cộng sự, (2002) với chất chuẩn FeSO4. + Hoạt tính bắt gốc tự (DPPH): xác định hoạt tính bắt gốc tự (DPPH) theo Blois M. S. (1958) Sử dụng máy UV-Vis Spectrophotometer JenWay 6400/6405 để đo độ hấp thụ. 2.2.1.3. Phƣơng pháp xác định độ màu sản phẩm: theo phương pháp xử lý UF Neslihan cs (2005). 2.2.1.4. Phƣơng pháp định lƣợng số thành phần khác - Định lượng carbohydrate: Xác định hàm lượng carbohydrate theo AOAC (1990). - Định lượng hàm lượng Pb: theo TCVN 7602:2007 Thực phẩm. - Định lượng hàm lượng acid citric: Theo phương pháp AOAC (1932). - Định lượng hàm lượng đường sucrose: Theo phương pháp AOAC (2000). 2.2.2. Phƣơng pháp tinh chế Mỗi phân đoạn tiến hành chạy sắc ký mỏng với hệ dung môi rửa giải chloroform: methanol: acid formic (90: 9: 1). Thuốc thử phát phlorotannin FeCl3 5% cồn ethanol 96%. Sau kiểm tra lại độ tinh mẫu mỏng LC/MS phân tích phlorotannin theo phương pháp Swanson cộng sự. Phân đoạn phlorotannin chạy qua sắc ký cột Sephadex LH 20 với dung môi chạy sắc ký chloroform : methanol : acid formic theo tỷ lệ (90 : 9: 1). Phân đoạn phlorotannin thu từ cột LH 20 chạy NMR 1H 13C. (pha động gồm pha A H2O 0,1% acid formic, pha B Acetonitril 0,1% acid formic). Phương pháp chạy HPLC-MS, nhận biết chất qua tỉ lệ m/z. - Chạy LC/MS: Chương trình gradient sau: Bảng 2.1. Chƣơng trình gradient LC/MS Thời gian Pha B (%) 10 10 10 40 90 60 90 61 10 70 10 22 hóa phân đoạn ethyl acetate cao so với phân đoạn nghiên cứu. Hoạt chất chống oxy hóa phlorotannin chạy qua cột sephadex LH 20 có độ tinh từ 92% trở lên. Tuy nhiên, để xác định cụ thể chất nhóm hợp chất phlorotannin (polyphenol) cần phải có thêm số nghiên cứu khác cần tiếp tục nghiên cứu sâu nghiên cứu tiếp theo. 3.4.3. Đề xuất quy trình thu nhận phlorotannin từ rong mơ S. serratum Từ nghiên cứu cho phép đề xuất quy trình thu nhận phlorotannin từ rong mơ S. serratum hình 3.13. Nguyên liệu rong mơ Chiết Thời gian: 33 Nhiệt độ: 430C Tỷ lệ DM:NL: 27:1 (v/w) Lọc Cô đặc Phân đoạn lần Phân đoạn nhexan Phân đoạn lần Phân đoạn chloroform Phân đoạn lần Phân đoạn EtOAC Phân đoạn lần Phân đoạn nbutanol Hệ dung môi rửa giải: Chloroform : methanol : acid formic: 90:9:1 Sắc ký Sephadex LH 20 Phlorotannin tinh Dung dịch nước lại Hình 3.13. Sơ đồ quy trình tinh chế phlorotannin từ rong S. serratum 23 * Thuyết minh quy trình + Nguyên liệu Rong mơ Sargassum serratum thu mẫu vịnh Nha Trang Khánh Hòa, Việt Nam. Sau thu mẫu, rong mơ làm sạch, định danh sấy khô đến hàm ẩm 19%. Rong mơ khô thường có hàm lượng phlorotannin chiếm vào khoảng 0,6%. + Chiết Rong mơ khô sau xay, dùng để chiết phlorotannin ethanol 96%. Quá trình chiết tiến hành theo phương pháp ngâm chiết nhiệt độ 430C, 33 với tỷ lệ DM:NL 27:1 (v/w). + Lọc Dịch chiết lọc qua giấy lọc để thu dịch lọc. Dịch lọc phlorotannin bảo quản chai sẫm màu nhằm hạn chế tác động ánh sáng làm hư hỏng phlorotannin. + Cô đặc Dịch lọc cô đặc nhiệt độ 400C để thu cao chiết. Sau cô đặc, cao chiết tái hòa tan ethanol 99,5% loại bỏ phần cặn không tan ethanol 99,5%. Dịch tái hoà tan thu được, tiếp tục tái cô đặc lại phần ba thể tích bảo quản chai sẫm màu. Phần dịch phân đoạn làm dung môi hữu từ không phân cực tới phân cực mạnh công đoạn tiếp theo. + Phân đoạn lần Dịch sau cô đặc tách phân đoạn n-hexan để thu phân đoạn tan n-hexan tách phân đoạn n-hexan bảo quản chai sẫm màu. + Phân đoạn lần Dịch lại sau tách phân đoạn n-hexan tiếp tục tách phân đoạn chloroform để thu phân đoạn tan chloroform tách riêng phân đoạn chloroform bảo quản chai sẫm màu. + Phân đoạn lần 24 Dịch lại sau phân đoạn chloroform tiếp tục phân đoạn ethyl acetate để thu phân đoạn tan ethyl acetate. Phân đoạn ethyl acetate tách riêng, bảo quản chai sẫm màu để dung cho việc tinh qua cột sắc ký qua cột sephadex LH 20. + Phân đoạn lần Dịch chiết lại sau phân đoạn ethyl acetate, tiếp tục tách phân đoạn n-butanol. Sau tách phân đoạn, thu phân đoạn tan n-butanol dịch lại. Phân đoạn nbutanol dịch lại bảo quản bình sẫm màu. + Sắc ký lọc gel Sephadex LH 20 Phân đoạn ethyl acetate có độ hàm lượng phlorotannin lớn nên tiếp tục sử dụng để tinh phlorotannin qua cột lọc gel Sephadex LH 20 để thu phlorotannin tinh sạch. Hệ dung môi rửa giải thu phlorotannin tinh chloroform : methanol : acid formic (90:9:1). Khả làm phlorotannin qua phân đoạn n-hexan/ chloroform/ ethyl acetate/ n-butanol tương ứng 29,8%, 20,6%, 81,8% 51,94% so với dịch chiết ethanol ban đầu. Độ tinh phlorotannin sau sắc ký cột 92%. Dẫn xuất phloroglucinol thu dự đoán epicatechin với m/z vào khoảng 301. Tuy nhiên cần tiếp tục nghiên cứu tinh chế phlorotannin sâu để phục vụ y dược thực phẩm. 3.5. THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PHLOROTANIN TỪ RONG MƠ S. SERRATUM BẰNG KỸ THUẬT SẤY PHUN 3.5.1. Xác định chất trợ sấy Kết thử nghiệm sử dung chất trợ sấy khác nhau: maltodextrin, glucose, saccharose sấy phun tạo chế phẩm phlorotannin từ rong mơ S. serratum cho thấy hàm lượng phlorotannin có hoạt tính chống oxy hóa chế phẩm bột phlorotannin sau sấy phun thu từ mẫu sấy bổ sung chất trợ sấy khác 25 giảm dần theo trình tự chất trợ sấy sử dụng: maltodextrin/ glucose/ saccharose. Do vậy, maltodextrin lựa chọn làm chất trợ sấy sấy phun thu bột chế phẩm phlorotannin từ rong mơ S. serratum. 3.5.2. Xác định tỷ lệ maltodextrin Phân tích ANOVA hồi quy cho thấy tỉ lệ chất trợ sấy (maltodextrin) sử dụng có mối tương quan chặt chẽ với hàm lượng phlorotannin hoạt tính chống oxy hóa (R2 > 0,81); hàm mục tiêu tuân theo mô hình phi tuyến bậc 2. Kết phân tích cho thấy tỷ lệ maltodextrin sử dụng 10% phù hợp cho trình sấy phun thu bột chế phẩm phlorotannin từ rong mơ S. serratum. 3.5.3. Xác định áp suất khí nén Kết phân tích ANOVA cho thấy hàm lượng phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa có mối tương quan chặt chẽ với áp suất khí nén (R2 > 0,75) sử dụng sấy phun dịch chiết phlorotannin từ rong mơ S. serratum áp suất khí nén lựa chọn để sấy phun dịch chiết phlorotannin từ rong mơ S. serratum thu mẫu Khánh Hòa 0,8bar. 3.5.4. Xác định tốc độ bơm nhập liệu Phân tích mức độ tương quan yếu tố ANOVA cho thấy có mối liên hệ quan chặt chẽ tốc độ bơm nhập liệu với hàm lượng phlorotannin sản phẩm sau sấy (R2 > 0,92; F > Fcrit). Tốc độ bơm nhập liệu lựa chọn để sấy phun dịch chiết phlorotannin từ rong mơ S. serratum 10 vòng/phút. 3.5.5. Xác định nhiệt độ đầu vào trình sấy Phân tích ANOVA hồi quy cho thấy có khác biệt mang ý nghĩa thống kê hàm lượng phlorotannin hoạt tính chống oxy hóa bột phlorotannin thu sấy điều kiện nhiệt độ đầu vào trình sấy khác nhau. Nhiệt độ khí đầu vào trình sấy phun tạo chế phẩm bột phlorotannin từ dịch chiết phlorotannin từ rong mơ S. serratum thích hợp 1100C. 26 3.5.6. Đề xuất quy trình thu nhận bột phlorotannin kỹ thuật sấy phun Từ nghiên cứu cho phép đề xuất quy trình thu nhận bột phlorotannin kỹ thuật sấy phun trình bày hình 3.14. * Thuyết minh quy trình: + Dịch chiết phlorotannin: phlorotannin từ rong mơ S. serratum chiết theo kỹ thuật ngâm chiết. Sau chiết rút, cô đặc dịch chiết để đạt 3g phlorotannin/ 500ml dịch chiết với hoạt tính chống oxy hóa tương đương 6,7g acid ascorbic. + Đồng hoá: Tiến hành bổ sung maltodextrin với tỷ lệ 10% vào dịch chiết. Mục đích việc bổ sung chất trợ sấy (maltodextrin) để giúp hình thành “vi nang” bao bọc phlorotannin để hạn chế biến đổi phlorotannin trình sấy. Sau bổ sung chất trợ sấy, tiến hành đồng hoá để đảm bảo maltodextrin hòa tan vào dịch sấy. Dịch chiết phlorotannin Maltodextrin 10% - Áp suất bơm 0,8bar Tốc độ bơm 10 v/p Nhiệt độ đầu vào 1100C Đồng hóa Sấy phun Bột chế phẩm Bao gói Bảo quản Sản phẩm Hình 3.14. Quy trình sấy phun thu nhận bột phlorotannin từ dịch chiết rong mơ S. serratum 27 + Sấy phun: Quá trình sấy phun hỗn hợp thực máy sấy phun SD 05 với thông số trình sấy sau: Áp suất bơm mẫu: 0,8 bar, tốc độ bơm nhập liệu: 10 vòng/ phút tương ứng với 350ml/h, nhiệt độ không khí đầu vào trình sấy: 1100C, maltodextrin sử dụng làm chất trợ sấy. + Bột chế phẩm phlorotannin: bột chế phẩm phlorotannin thu nhận bình thu sản phẩm có màu tối bọc lại để tránh ánh sáng. Vì để phlorotannin tiếp xúc với ánh sáng nhanh chóng bị oxy hóa dẫn đến giảm hoạt tính chống oxy hóa hàm lượng phlorotannin + Bao gói: bột chế phẩm bao gói bao bì PE PP. Sản phẩm bao gói đặt vào hộp giấy carton để tránh sản phẩm tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng. + Bảo quản: Sản phẩm bao gói bao bì PE PP bảo quản nơi khô, mát, tránh ánh sáng trực tiếp. + Sản phẩm: điều chế theo quy trình công nghệ đạt tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm đạt hàm lượng phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa. 3.6. ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA CHẾ PHẨM PHLOROTANNIN Sử dụng bột chế phẩm thu để nghiên cứu đánh giá độc tính chuột bạch. Chuột phân làm nhóm khác nhau, nhóm 1: sử dụng nước muối sinh lý, nhóm 2: sử dụng maltodextrin hòa nước muối sinh lý nhóm 3: sử dụng bột phlorotannin chống oxy hóa hòa nước muối sinh lý. Kết nghiên cứu thể bảng 3.4. 28 Bảng 3.4. Khối lƣợng chuột bạch thí nghiệm sau ngày nuôi chế độ khác (sử dụng nƣớc muối sinh, sử dụng maltodextrin hòa nƣớc muối sinh lý sử dụng bột phlorotannin chống oxy hóa hòa nƣớc muối sinh lý) STT Mã chuột Khối lƣợng trung bình chuột lô NMSL Mã chuột Khối lƣợng trung bình chuột lô Đối chứng Mã chuột Khối lƣợng trung bình chuột lô mẫu LV 26,450±2,940 GV 26,888±2,000 MV 28,900±4,280 LVPSV 25,988±2,770 GVPTV 21,275±0,610 MVPTV 24,525±2,400 LVTTV 25,900±2,050 GVPSV 26,213±3,510 MVPSV 27,575±3,380 LVTSV 25,025±2,550 GVTTV 25,913±2,250 MVTTV 25,375±1,660 LV2PV 27,488±2,720 GVTSV 24,850±2,580 MVTSV 23,175±0,980 LV2TV 26,975±3,710 GVE0PV 23,375±2,250 MVE0PV 23,063±1,060 LVPTV 28,525±3,980 GVE0TV 23,825±2,020 MVE0TV 26,475±1,930 LVE0PV 25,325±2,680 GV2PV 23,900±2,930 MV2PV 23,750±2,150 LVE0TV 25,725±3,250 GV2E0V 23,900±1,190 MV2E0V 25,613±1,720 10 LV2E0V 26,150±3,830 GV2TV 25,588±2,610 MV2TV 24,750±2,880 TB 26,360 ± 1,050 g/con 24,570 ± 1,660 g/con 25,320 ± 1,900 g/con * Ghi chú: NMSL: nước muối sinh lý Từ kết nghiên cứu bảng 3.4 cho thấy chuột bạch phát triển mạnh khỏe, tăng cân đực cái. Kết đánh giá trọng lượng phân tích thống kê cho thấy nhóm chuột 1, nhóm nhóm có khối lượng trung bình sau tuần nghiên cứu tương ứng sau: 26,360 ± 1,050g/con, 24,570 ± 1,660g/con 25,320 ± 1,900g/con. Kết phân tích ANOVA cho thấy khác biệt nhóm nghiên cứu cân nặng tốc độ tăng trưởng (p = 0,055; F = 3,22 < Fcrit = 3,35). Đồng thời tất chuột nghiên cứu khỏe mạnh. Từ kết phân tích chuột cho thấy bột chế phẩm phlorotannin thu từ rong mơ S. serratum độc tính. 29 3.7. THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG PHLOROTANNIN TRONG SẢN XUẤT ĐỒ UỐNG 3.7.1. Xác định ngƣỡng cảm vị acid citric Kết phân tích hồi quy ANOVA cho thấy tổng điểm trung bình chung cảm vị acid citric đồ uống có mối liên hệ chặt chẽ với tỷ lệ acid citric bổ sung. Ngưỡng cảm vị ưa thích acid citric đồ uống nghiên cứu 0,11% tỷ lệ acid citric bổ sung 0,11% lựa chọn cho nghiên cứu tiếp theo. 3.7.2. Xác định tỷ lệ đƣờng bổ sung Kết xác định tỷ lệ đường bổ sung vào đồ uống cho thấy tỷ lệ đường bổ sung 17% phù hợp. 3.7.3. Xác định tỷ lệ hỗn hợp acid citric acid ascorbic bổ sung Kết xác định cho thấy tỷ lệ sử dụng phối hợp acid citric ascorbic 0,07% 0,04% đồ uống có tổng điểm điểm cảm quan chung đạt cao 18,3 điểm. 3.7.3. Xác định tỷ lệ carrageenan - xanthan gum bổ sung Kết phân tích cảm quan cho thấy bổ sung hỗn hợp 0,05% carrageenan 0,05% xanthan gum sản phẩm đồ uống có tổng điểm cảm quan cao đạt 18,5 điểm. 3.7.5. Xác định tỷ lệ phlorotannin bổ sung Kết bổ sung Phc vào đồ uống cho thấy hàm lượng Phc phối trộn vào đồ uống thích hợp 30mg/200ml sản phẩm. 3.7.6. Xác nhiệt độ thời gian đồng hóa Kết phân tích cho thấy trình đồng hóa tiến hành nhiệt độ 45 C thời gian từ 1-2 phút phù hợp. 3.7.7. Xác định thời gian trùng Kết trùng sản phẩm đồ uống 800C với công thức trùng khác cho thấy công thức trùng phù hợp với việc trùng đồ uống chứa phlorotannin từ rong mơ. 30 3.7.8. Đề xuất quy trình sản xuất nƣớc giải khát bổ sung phlorotannin Từ kết nghiên cứu cho phép đề xuất quy trình sản xuất nước giải khát bổ sung phlorotannin trình bày hình 3.15. Bột phlorotannin 30mg/200ml Saccharose 17% Acid citric 0,07% Nước Carrageenan: 0,04% Xanthan gum: 0,05% Acid ascorbic: 0,04% Thanh trùng Phối trộn Lọc Chai Thanh trùng Nhiệt độ: 450C Thời gian: 1-2 phút Đồng hóa Rót chai Đóng nắp Công thức trùng Thanh trùng Làm nguội Dán nhãn Sản phẩm Hình 3.15. Sơ đồ quy trình sản xuất nƣớc giải khát phlorotannin 31 * Thuyết minh quy trình + Bột phlorotannin Bột phlorotannin thu nhận từ rong mơ S. serratum có đặc tính kỹ thuật sau: tan nước, màu vàng sẫm, độ ẩm 5,3%, hàm lượng phlorotannin đạt 2,268 ± 0,010g/100g bột, hoạt tính chống oxy hóa tổng tương đương 4,347 ± 0,018g acid ascorbic/100g bột, hoạt tính khử sắt tương đương 9,390 ± 0,024 g/100g bột hoạt tính bắt gốc tự DPPH đạt 70,020 ± 0,260%. + Phối trộn: Các thành phần sử dụng để phối trộn đồ uống. - Nƣớc: nước đạt tiêu chuẩn nước cấp theo quy định Bộ Y tế. - Đƣờng: tỷ lệ đường sử dụng sản xuất đồ uống 17%. - Carrageenan: tỷ lệ carrageenan sử dụng sản xuất đồ uống là: 0,05%. - Xanthan gum: tỷ lệ xanthan gum sử dụng là: 0,05%. Sau hòa tan hoàn toàn carrageenan xanthan gum nước, tiến hành lọc hỗn hợp để loại bỏ phần cặn không hoà tan. - Acid ascorbic: tỷ lệ acid ascorbic sử dụng là: 0,04%. - Acid citric: tỷ lệ acid citric sử dụng là: 0,07%. - Sodium benzoate: tỷ lệ sodium benzoate sử dụng là: 0,02%. - Postasium sorbate: postasium sorbate tinh khiết đạt tiêu chuẩn làm phụ gia thực phẩm. Tỷ lệ postasium sorbate sử dụng là: 0,02% - Phlorotannin: bột phlorotanin sản xuất từ rong mơ S. serratum sử dụng theo tỷ lệ 30mg/ 200ml dung dịch. Quá trình phối trộn tiến hành sau: trước tiên cho dung dịch carrageenan xanthan gum vào nước. Hòa tan hoàn toàn carrageenan 32 xanthan gum nước bổ sung acid ascorbic, acid citric. Sau bổ sung phlorotannin, dung dịch đường chuẩn bị tiến hành đồng hoá. - Đồng hóa Quá trình đồng hoá tiến hành nhiệt độ 450C thời gian 1-2 phút để hỗn hợp hoàn toàn đồng nhất. - Rót chai Dung dịch sau đồng hóa lọc tiến hành rót chai. - Đóng nắp Sau rót chai, sản phẩm khí đóng nắp. Sau đóng nắp, bán thành phẩm chuyển qua công đoạn trùng. - Thanh trùng Tiến hành trùng theo công thức trùng để tiêu diệt phần vi sinh vật nhằm kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm. - Làm nguội Sản phẩm sau trùng tiến hành làm nguội nhiệt độ. - Dán nhãn Bán thành phẩm dán nhãn theo nghị định số 89/2006/NĐ-CP Chính phủ, Nghị định số 38/2012/NĐ-CP Chính Phủ thông tư liên tịch số 34/2014/TTLT-BYT-BNNPTNT-BCT Bộ Y tế, Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, Bộ Công Thương. - Sản phẩm Sản phẩm sản xuất theo quy trình đạt chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm, đạt tiêu chuẩn theo nghị định, thông tư liên tịch có liên quan Chính phủ Bộ. 33 3.8. SẢN XUẤT THỬ VÀ ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI CHẤT LƢỢNG SẢN PHẨM ĐỒ UỐNG PHLOROTANNIN THEO THỜI GIAN BẢO QUẢN 3.8.1. Sản xuất thử đánh giá chất lƣợng sản phẩm Sản phẩm đồ uống phlorotannin sản xuất đạt chất lượng cảm quan loại đạt tiêu chuẩn vi sinh theo quy định hành Bộ Y tế. Hàm lượng phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa đạt công nghệ xây dựng. 3.8.2. Đánh giá chất lƣợng sản phẩm theo thời bảo quản Tiến hành sản xuất đồ uống phlorotannin bảo quản đồ uống điều kiện lạnh (40C) nhiệt độ thường. Kết bảo quản cho thấy sau 12 tháng bảo quản sản phẩm nhiệt độ thường hoạt tính chống oxy hóa tổng, khử sắt hàm lượng phlorotannin sản phẩm giảm khoảng 65% so với ban đầu vừa sản xuất. Trong đó, bảo quản sản phẩm nhiệt độ lạnh sau 12 tháng bảo quản, hoạt tính chống oxy hóa hàm lượng phlorotannin đồ uống 75% so với hoạt tính phlorotannin sản phẩm ban đầu. Như bảo quản sản phẩm nhiệt độ lạnh, hoạt tính chống oxy hóa hàm lượng phlorotannin sản phẩm có giảm mức độ giảm chậm so với trình bảo quản nhiệt độ thường. 3.8.3. Sơ tính giá chi phí nguyên vật liệu Sơ tính chi phí nguyên vật liệu cho sản xuất lon đồ uống phlorotannin thể tích 200ml 4.257,2 đồng. 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu cho phép rút số kết luận: 1) Điều kiện chiết tối ưu cho thu nhận phlorotannin từ rong mơ S. serratum là: dung môi chiết ethanol 96%, nhiệt độ chiết 430C, thời gian chiết 33 giờ, tỷ lệ DM:NL 27:1 (v/w). Dịch chiết thu có hàm lượng phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa (tổng, khử sắt DPPH) thu tương ứng 5,950 ± 0,017 mg phloroglucinol/g DW, 15,050 ± 0,035 mg acid ascorbic/g DW, 45,300 ± 0,021 mg FeSO4/g DW 63,98% ± 1,2%. 2) Các phân đoạn dung môi n-hexan/ chloroform/ ethyl acetate/ n-butanol có hàm lượng phlorotannin tương ứng 29,8%, 20,6%, 81,8% 51,94% so với tổng lượng phlorotannin có dịch chiết ethanol ban đầu. Phlorotannin thu tách phân đoạn dung môi ethyl acetate tinh qua cột lọc gel Sephadex LH 20 thu đỉnh có hoạt tính phlorotannin với độ tinh lên tới 92%. 3) Điều kiện thích hợp sấy phun tạo bột phlorotannin: chất trợ sấy Maltodextrin, tỷ lệ maltodextrin/dịch chứa phlorotannin: 10%, áp suất bơm: 1,0 bar, tốc độ bơm: 10 vòng/ phút, nhiệt độ khí đầu vào: 1100C. Chế phẩm bột phlorotannin thu có hàm lượng phlorotannin: 2,268 ± 0,010g/ 100g, hoạt tính chống oxy hóa tổng: 4,347 ± 0,018g acid ascorbic/100g hoạt tính khử sắt: 9,390 ± 0,024g FeSO4/100g. 4) Chế phẩm bột phlorotannin từ rong mơ S. serratum không gây độc chuột bạch thí nghiệm. 5) Thông số thích hợp cho quy trình sản xuất đồ uống chứa phlorotannin dung tích 200ml sau: Tỷ lệ đường: 17%, Tỷ lệ acid citric: 0,07%, tỷ lệ carrageenan: 0,05%, tỷ lệ xanthan gum: 0,05%, tỷ lệ acid ascorbic: 0,04%, tỷ lệ phlorotannin: 1,4g/200ml, tỷ lệ sodium 35 benzoate: 0,04g/200ml. Các thành phần đồng hóa nhiệt độ 450C 1-2 phút trùng 800C phút. 2. ĐỀ XUẤT Ý KIẾN Từ nghiên cứu cho phép đề xuất ý kiến: Tiến hành thiết kế nhãn mác, sản xuất sản phẩm đồ uống phlorotannin quy mô lớn để thử nghiệm thương mại hóa sản phẩm. 36 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 1. Dang Xuan Cuong, Tran Thi Thanh Van, Vu Ngoc Boi, Le Xuan Hai. (2011), “Multiobjective optimization for phlorotannin extraction and antioxidant activity of brown algae Sargassum serratum collected in Nha Trang bay, Viet Nam using Box-Behnken model”, J. Sci. Dev., (Eng.Iss. 1), pp. 155 – 162. 2. Đặng Xuân Cường, Trần Thị Thanh Vân, Bùi Minh Lý, Vũ Ngọc Bội (2011), “Sự tích lũy phân bố phlorotannin chống oxy hóa số loài rong nâu Sargassum Khánh Hòa theo thời gian sinh trưởng”, Hội nghị khoa học công nghệ Biển toàn quốc, Tiểu ban công nghệ sinh học nguồn lợi biển, 699 - 704. 3. Đặng Xuân Cường, Vũ Ngọc Bội, Trần Thị Thanh Vân (2012), “Sự tích lũy phân bố phlorotannin có hoạt tính chống oxy hóa rong nâu Sargassum duplicatum khánh hòa theo thời gian sinh trưởng”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Thủy sản, Số 4, Trường Đại học Nha Trang. 4. Đặng Xuân Cường, Vũ Ngọc Bội, Trần Thị Thanh Vân Ngô Đăng Nghĩa (2013), “Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa số loài rong nâu Sargassum Khánh Hòa, Việt Nam”, Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học, 25, Tr. 36-42. 5. Đặng Xuân Cường, Vũ Ngọc Bội, Trần Thị Thanh Vân, Lê Như Hậu (2013), “Đánh giá hàm lượng phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa rong nâu sargassum thu vịnh Nha Trang, Việt Nam”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, Đại học Thái Nguyên, Tr. 137. 6. Đặng Xuân Cường, Bùi Minh Lý, Trần Thị Thanh Vân, Vũ Ngọc Bội, Lê Như Hậu, Đào Trọng Hiếu (2014), “Bước đầu nghiên 37 cứu tinh chế hoạt tính chống oxy hóa phlorotannin tách chiết từ rong nâu Sargassum serratum vùng biển Nha Trang”, Tạp chí Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, Số 2, Trang 71-76 7. Dang Xuan Cuong, Vu Ngoc Boi, Tran Thi Thanh Van, Le Nhu Hau (2015), “Effects of storage time on phlorotannin content and antioxidant activity of six Sargassum species from Nhatrang Bay, Vietnam”, Journal of Applied Phycology, Springer, Springer, Published online: 23 May 2015, ISSN 0921-8971. 8. Đặng Xuân Cường, Vũ Ngọc Bội, Trần Thị Thanh Vân, Đào Trọng Hiếu (2015), “Nghiên cứu quy trình sản xuất đồ uống giầu phlorotannin từ tảo biển”, Tạp chí Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, Hà Nội. [...]... thực phẩm 3.5 THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PHLOROTANIN TỪ RONG MƠ S SERRATUM BẰNG KỸ THU T SẤY PHUN 3.5.1 Xác định chất trợ sấy Kết quả thử nghiệm sử dung các chất trợ sấy khác nhau: maltodextrin, glucose, saccharose trong sấy phun tạo chế phẩm phlorotannin từ rong mơ S serratum cho thấy hàm lượng phlorotannin có hoạt tính chống oxy hóa trong chế phẩm bột phlorotannin sau sấy phun thu được từ các mẫu... TÍNH CỦA CHẾ PHẨM PHLOROTANNIN Sử dụng bột chế phẩm thu được để nghiên cứu đánh giá độc tính trên chuột bạch Chuột được phân làm 3 nhóm khác nhau, nhóm 1: sử dụng nước muối sinh lý, nhóm 2: sử dụng maltodextrin hòa trong nước muối sinh lý và nhóm 3: sử dụng bột phlorotannin chống oxy hóa hòa trong nước muối sinh lý Kết quả nghiên cứu thể hiện ở bảng 3.4 28 Bảng 3.4 Khối lƣợng chuột bạch thí nghiệm sau... nhiệt độ không khí đầu vào quá trình sấy: 1100C, maltodextrin được sử dụng làm chất trợ sấy + Bột chế phẩm phlorotannin: bột chế phẩm phlorotannin được thu nhận trong bình thu sản phẩm có màu tối hoặc được bọc lại để tránh ánh sáng Vì nếu để phlorotannin tiếp xúc với ánh sáng sẽ nhanh chóng bị oxy hóa dẫn đến giảm hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng phlorotannin + Bao gói: bột chế phẩm được bao gói bằng... phlorotannin từ dịch chiết phlorotannin từ rong mơ S serratum thích hợp là 1100C 26 3.5.6 Đề xuất quy trình thu nhận bột phlorotannin bằng kỹ thu t sấy phun Từ các nghiên cứu ở trên cho phép đề xuất quy trình thu nhận bột phlorotannin bằng kỹ thu t sấy phun trình bày ở hình 3.14 * Thuyết minh quy trình: + Dịch chiết phlorotannin: phlorotannin từ rong mơ S serratum được chiết theo kỹ thu t ngâm chiết... tinh chế phlorotannin từ rong S serratum 23 * Thuyết minh quy trình + Nguyên liệu Rong mơ Sargassum serratum được thu mẫu ở vịnh Nha Trang Khánh Hòa, Việt Nam Sau khi thu mẫu, rong mơ được làm sạch, định danh và sấy khô đến hàm ẩm 19% Rong mơ khô thường có hàm lượng phlorotannin chiếm vào khoảng 0,6% + Chiết Rong mơ khô sau khi xay, được dùng để chiết phlorotannin bằng ethanol 96% Quá trình chiết được... chiết phlorotannin từ rong mơ S serratum 01 lần 3.3 NGHIÊN CỨU CÔ ĐẶC DỊCH CHIẾT PHLOROTANNIN TỪ RONG MƠ S SERRATUM Kết quả nghiên cứu cô đặc dịch chiết thu nhận từ rong mơ S serratum được lọc và cô đặc lần 1 ở các nhiệt độ khác nhau: 400C, 500C, 600C cho thấy khi tăng nhiệt độ cô đặc thì hàm lượng Phc với hoạt tính chống oxy hóa của dịch sau cô đặc có xu hướng giảm theo phương trình hồi quy bậc 1 và. .. để chiết phlorotannin từ rong mơ 3.1.2 Xác định nồng độ dung dịch ethanol sử dụng chiết rút phlorotannin Kết quả phân tích cho thấy sử dụng ethanol ở nồng độ 96% để chiết phlorotannin từ rong mơ S serratum thì dịch chiết thu được có hàm lượng Phc, TA và RP cao nhất Phân tích ANOVA và hồi quy cho thấy có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê giữa Phc, TA và RP ở các điều kiện chiết khác nhau và có sự tương... phút Đồng hóa Rót chai Đóng nắp Công thức thanh trùng Thanh trùng Làm nguội Dán nhãn Sản phẩm Hình 3.15 Sơ đồ quy trình sản xuất nƣớc giải khát phlorotannin 31 * Thuyết minh quy trình + Bột phlorotannin Bột phlorotannin thu nhận từ rong mơ S serratum có các đặc tính kỹ thu t như sau: tan trong nước, màu vàng sẫm, độ ẩm 5,3%, hàm lượng phlorotannin đạt 2,268 ± 0,010g/100g bột, hoạt tính chống oxy hóa tổng... sạch từ 92% trở lên Tuy nhiên, để xác định cụ thể chất gì trong nhóm hợp chất phlorotannin (polyphenol) cần phải có thêm một số nghiên cứu khác nữa và cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn nữa ở những nghiên cứu tiếp theo 3.4.3 Đề xuất quy trình thu nhận phlorotannin từ rong mơ S serratum Từ các nghiên cứu ở trên cho phép đề xuất quy trình thu nhận phlorotannin từ rong mơ S serratum ở hình 3.13 Nguyên liệu rong. .. chiết phlorotannin từ rong mơ S serratum là 10 vòng/phút 3.5.5 Xác định nhiệt độ đầu vào của quá trình sấy Phân tích ANOVA và hồi quy cho thấy có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê về hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa của bột phlorotannin thu được khi sấy ở các điều kiện nhiệt độ đầu vào của quá trình sấy khác nhau Nhiệt độ khí đầu vào của quá trình sấy phun tạo chế phẩm bột phlorotannin . thu nhận phlorotannin có hoạt tính chống oxy hóa từ rong mơ (Sargassum serratum) thu hoạch ở vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa. - Thử nghiệm sử dụng phlorotannin trong đồ uống có hoạt tính chống. vậy việc nghiên cứu “ Nghiên cứu thu nhận phlorotannin từ rong mơ Sargassum serratum tại Nha Trang và thử nghiệm sử dụng trong đồ uống có hoạt tính chống oxy hóa là cần thiết. 2 2. Mục. GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐẶNG XUÂN CƢỜNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN PHLOROTANNIN TỪ RONG MƠ (SARGASSUM SERRATUM ) TẠI NHA TRANG VÀ THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG TRONG ĐỒ