Đang tải... (xem toàn văn)
Luận án Tiến Sĩ đề tài Nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp của tác giả Hoàng Văn Quốc Chương Đại học khoa học tự nhiên, đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.Người ta đã nhận thấy rằng bệnh tiểu đường là một trong những căn bệnh đe doạ nghiêm trọng đến sức khỏe của con người. Năm 2000, con số những người mắc bệnh tiểu đường trên thế giới ước tính khoảng từ 151 đến 171 triệu, và dự kiến đến năm 2010 con số này sẽ là 221 triệu và đến năm 2030 sẽ lên đến 366 triệu người. Và đương nhiên, việc gia tăng số người mắc bệnh tiểu đường sẽ kéo theo sự gia tăng các biến chứng của căn bệnh này như thần kinh, xơ vữa động mạch…Theo ước tính, số người tử vong trên thế giới do bệnh tiểu đường trong năm 2000 là 2,9 triệu và con số này sẽ còn tiếp tục tăng theo từng năm.Bệnh tiểu đường là một căn bệnh chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố. Tiểu đường gây ra do tác động phức tạp giữa gene và các yếu tố môi trường, từ đó dẫn đến bất bình thường trong quá trình điều hoà lượng Glucose trong cơ thể liên quan tới những vấn đề về hormon Insulin.Insulin là một hormon được ra bởi tế bào beta trong đảo Langerhans của tuyến tuỵ. Đây là hormon quan trọng nhất cho quá trình lưu trữ, sử dụng đường, acid amin và acid béo và duy trì lượng đường trong máu.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ♣♦♣ HOÀNG VĂN QUỐC CHƯƠNG NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT INSULIN TÁI TỔ HP LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2010 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ♣♦♣ HOÀNG VĂN QUỐC CHƯƠNG NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT INSULIN TÁI TỔ HP Chuyên ngành: Vi sinh học Mã số: 1.05.12 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. TRẦN LINH THƯỚC Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2010 -i- LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin chân thành gởi lời cảm ơn sâu sắc đến Phó giáo sư, Tiến só Trần Linh Thước. Thầy tận tụy hướng dẫn, giúp đỡ em trình học tập, tạo điều kiện tốt cho em để hoàn thành luận án. Không có hỗ trợ Thầy, em hoàn thành luận án này. Xin trân trọng cảm ơn Thầy! Em xin cảm ơn PGS.TS. Phạm Thành Hổ, thường xuyên quan tâm, động viên cung cấp thông tin q báu cho em trình học tập thực luận án. Xin gởi lời cảm ơn đến PGS.TS. Phan Văn Chi, Phó viện trưởng Viện khoa học Công nghệ Việt Nam, giúp đỡ phân tích trình tự mini-proinsulin. Xin cảm ơn TS. Peer Nobert Jorgensen, công ty Norvonordisk, Đan Mạch, cung cấp cho kháng thể sử dụng trình nghiên cứu. Em xin gởi lời cảm ơn đến tất q Thầy Cô Khoa sinh học, Trường Đại học khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí minh, cung cấp cho em kiến thức bổ ích suốt trình học tập Trường. Xin cảm ơn tất bạn, em phòng thí nghiệm công nghệ sinh học phân tử (Lab A) ĐH KHTN HCM. Cảm ơn bạn Hoàng, Trang, Thảo, Trí… cảm ơn em Nam, Nhung, Nghóa, Đạt, Đức, Trâm, Ngân… đặc biệt cảm ơn Hoa, giúp đỡ nhiều thời gian thực luận án. Không có giúp đỡ bạn, em, hoàn thành luận án này. Cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp động viên, hỗ trợ trình thực luận án. Và hết, xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân động viên, giúp đỡ suốt trình học tập. Đặc biệt cảm ơn Vợ mang lại cho niềm hạnh phúc, yên tâm trình thực luận án. Tp Hồ Chí Minh, Tháng 01 năm 2010 Luận án Tiến só Lời cảm ơn -ii- MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC HÌNH viii DANH MỤC BẢNG .xi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .5 1.1. Insulin vai trò thể 1.2. Bệnh tiểu đường .8 1.3. Các phương pháp sản xuất insulin 10 1.3.1. Sản xuất insulin từ tụy tạng động vật 10 1.3.2. Sản xuất insulin người kỹ thuật tái tổ hợp DNA 12 1.4. Sản xuất protein tái tổ hợp tế bào E. coli 18 1.4.1. Đặc điểm E. coli sản xuất protein tái tổ hợp .18 1.4.2. Các chủng E. coli thường dùng sản xuất protein tái tổ hợp .20 1.5. Các hệ thống vector biểu E. coli .24 1.5.1. 1.5.2. 1.5.3. 1.5.4. Hệ thống pGEX biểu protein dung hợp với GST 24 Hệ thống pET biểu protein dung hợp với 6xHis 25 Hệ thống biểu dung hợp với MBP - Hệ thống pMAL .27 Hệ thống IMPACT biểu protein dung hợp với CBP .27 1.6.1. 1.6.2. 1.6.3. 1.6.4. 1.6.5. Các phương pháp lên men sản xuất protein tái tổ hợp 28 Đặc điểm lên men mẻ .29 Đặc điểm lên men liên tục 32 Đặc điểm lên men mẻ-bổ sung .32 Các yếu tố ảnh hưởng đến lên men mẻ-bổ sung chủng E. coli để sản xuất protein tái tổ hợp .34 1.6. Phương pháp lên men vi sinh vật 28 1.7. Các bước xử lý sau lên men để thu nhận mini-proinsulin insulin có hoạt tính 39 1.7.1. 1.7.2. 1.7.3. 1.7.4. Thu nhận làm tan thể vùi chứa mini-proinsulin .39 Tái gấp cuộn mini-proinsulin tái tổ hợp 40 Cắt loại đoạn peptide C để thu nhận insulin có hoạt tính .43 Các bước xử lý để thu nhận protein mục tiêu từ protein dung hợp .44 Luận án Tiến só Mục lục -iii- 1.7.5. Các phương pháp tinh chế trung gian tinh chế hoàn tất sản xuất insulin từ mini-proinsulin .45 1.8. Qui trình sản xuất insulin tái tổ hợp theo mô hình mini-proinsulin .47 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP .49 2.1. Dụng cụ thiết bò .49 2.1.1. 2.1.2. 2.1.3. 2.1.4. Thiết bò dùng sinh học phân tử .49 Thiết bò dùng thao tác nuôi cấy vi sinh 49 Thiết bò dùng cho tinh chế protein 49 Thiết bò dùng xác đònh hàm lượng đường huyết 50 2.2. Hóa chất môi trường 50 2.2.1. Hóa chất 50 2.2.2. Môi trường nuôi cấy vi sinh .55 2.3. Nguyên vật liệu 55 2.3.1. 2.3.2. 2.3.3. 2.3.4. 2.3.5. Chủng vi sinh vật .55 Plasmid 56 Mồi dùng cho tổng hợp gen, tạo dòng giải trình tự 56 Thang phân tử lượng dùng điện di .57 Các kháng thể sử dụng cho Western Blot ELISA 57 2.4. Phương pháp .58 2.4.1. Thiết kế, tổng hợp gen mpi mã hóa 6xHis-MPI E. coli phương pháp PCR tái tổ hợp 58 2.4.2. Tạo dòng gen mpi plasmid pBlue (pBIns) 61 2.4.3. Tái tạo dòng gen mpi vào vector biểu pET-43.1a .62 2.4.4. Cảm ứng biểu xác nhận biểu 6xHis-MPI .63 2.4.5. Hoạt hóa chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins 66 2.4.6. Khảo sát điều kiện cảm ứng tối ưu biểu 6xHis-MPI chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins 66 2.4.7. Khảo sát thay trypton pepton môi trường LB nuôi cấy E. coli BL21(DE3)/pET43Ins 68 2.4.8. Khảo sát biểu 6xHis-MPI chủng E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins nuôi cấy môi trường LBp LB 68 2.4.9. Khảo sát điều kiện nuôi cấy E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins mật độ cao phương pháp mẻ-bổ sung qui mô phòng thí nghiệm 69 2.4.10. Khảo sát điều kiện lên men E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins nuôi cấy mẻ-bổ sung qui mô pilot 30L .70 2.4.11. Phương pháp thu sinh khối đồng tế bào .71 2.4.12. Thu nhận làm tan thể vùi chứa 6xHis-MPI .72 2.4.13. Thu nhận tinh chế sơ 6xHis-MPI sắc ký cột Ni-NTA 72 2.4.14. Phương pháp cắt loại bỏ 6xHis CNBr để thu nhận MPI 72 Luận án Tiến só Mục lục -iv- 2.4.15. Khảo sát điều kiện ảnh hưởng lên tái gấp cuộn MPI .73 2.4.16. Tủa mini-proinsulin insulin ion kẽm kim loại .75 2.4.17. Phương pháp xử lý MPI trypsin/carboxypeptidase B để thu nhận insulin có hoạt tính 75 2.4.18. Kiểm tra cấu hình MPI insulin phương pháp ELISA .76 2.4.19. Phân tích MPI insulin sắc ký RP-HPLC .77 2.4.20. Giải trình tự amino acid MPI khối phổ .77 2.4.21. Phương pháp đònh lượng protein .77 2.4.22. Phương pháp xác đònh tính hoạt tính insulin tái tổ hợp 79 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 80 3.1. Tạo dòng tế bào E. coli có khả biểu mini-proinsulin dung hợp với 6xHis (6xHis-MPI) .80 3.1.1. Tổng hợp gen mpi mã hóa mini-proinsulin biểu E. coli .80 3.1.2. Tạo dòng gen mpi vào plasmid pBlue 81 3.1.3. Tạo dòng tế bào E. coli BL21(DE3)/pET43Ins biểu MPI dạng dung hợp 6xHis-MPI 83 3.1.4. Kiểm tra trình tự amino acid 6xHis-MPI 87 3.2. Lên men E. coli BL21(DE3)/pET43Ins tổng hợp 6xHis-MPI tái tổ hợp qui mô phòng thí nghiệm qui mô pilot 89 3.2.1. Hoạt hóa, nhân giống kiểm tra khả biểu 6xHis-MPI chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins 89 3.2.2. Khảo sát điều kiện biểu tối ưu 6xHis-MPI E. coli BL21(DE3)/pET43Ins 91 3.2.3. Xác đònh điều kiện nuôi cấy mật độ cao chủng E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins qui mô phòng thí nghiệm .95 3.2.4. Nuôi cấy E. coli BL21(DE3)/pET43Ins theo phương thức mẻ- bổ sung qui mô 30 L để tổng hợp 6xHis-MPI .101 3.3. Thu nhận MPI có cấu hình tự nhiên 104 3.3.1. Thu nhận thể vùi chứa 6xHis-MPI 104 3.3.2. Thu nhận 6xHis-MPI từ thể vùi .105 3.3.3. Thu nhận MPI từ 6xHis-MPI .107 3.4. Thu nhận insulin từ MPI .111 3.4.1. Tái gấp cuộn MPI 111 3.4.2. Cắt loại peptide C trypsin .116 3.5. Kiểm tra hoạt tính insulin tái tổ hợp chuột .118 3.6. Sơ đồ qui trình công nghệ sản xuất insulin qui mô pilot 119 KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ .122 Luận án Tiến só Mục lục -v- DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 124 TÀI LIỆU THAM KHẢO 125 PHỤ LỤC .132 Luận án Tiến só Mục lục -1- ĐẶT VẤN ĐỀ “Thế kỷ 21 kỷ bệnh Nội tiết Rối loạn chuyển hóa mà điển hình bệnh đái tháo đường (Bệnh tiểu đường)”. Nhận xét nhóm chuyên gia dự báo tình hình bệnh tật Tổ chức Y tế giới trở thành thực với số cụ thể. Theo Tổ chức Y tế giới (WHO, 2008) [77], toàn giới có khoảng 180 triệu người mắc bệnh tiểu đường ước tính số tăng gấp đôi vào năm 2030, chiếm khoảng 5% dân số giới. Đáng lo ngại biến chứng bệnh, 10 giây có người tử vong nguyên nhân đái tháo đường, 30 giây lại có người đái tháo đường bò cắt cụt chi ngày có 5000 người khả nhìn biến chứng mắt bệnh. Mỗi năm có 3,2 triệu người chết bệnh liên quan tới đái tháo đường tương đương với số người tử vong bệnh HIV/AIDS [1]. Bệnh tiểu đường (BTĐ) trở thành gánh nặng cho kinh tế xã hội, năm hàng nghìn tỷ đôla Mỹ chi phí cho điều trò bệnh, chưa chi phí khổng lồ kinh tế lấp đầy tổn thất, mát tinh thần bệnh tật gây ra. Thực tế đáng lo ngại tình trạng bệnh xuất ngày nhiều từ lớp trẻ [1]. Ở Việt Nam, tỷ lệ người mắc BTĐ ngày cao thành phố lớn tỷ lệ tăng gấp đôi từ 2% lên 4% 10 năm giai đoạn 1990-2000. Số người mắc BTĐ khoảng 4,5 triệu người, chiếm 5,7% dân số, trở thành nước có tốc độ phát triển BTĐ nhanh giới [1]. Nguyên nhân BTĐ thiếu insulin thể người bệnh kháng insulin. Insulin polypeptide hormone sinh nhờ tế bào β tuyến tụy động vật, có vai trò điều hoà lượng đường máu. Phương Luận án Tiến só Đặt vấn đề -2- pháp điều trò BTĐ phổ biến tiêm insulin đònh kỳ cho người bệnh. Do số lượng người mắc BTĐ ngày cao nên nhu cầu sử dụng insulin lớn. Ở châu Âu, lượng insulin tăng lên lần vòng 12 năm từ 1995-2007. Theo ước tính, nhu cầu insulin giới tăng từ khoảng 5.000kg năm 2007 lên khoảng 16.000kg vào năm 2010, với thò trường dự tính khoảng 11,8 tỷ Mỹ kim [41]. Năm 1978, lần nhà khoa học công ty công nghệ sinh học Genetech dòng hóa thành công gen mã hóa cho insulin người vào vector biểu E. coli cho phép công ty Eli Lilly sử dụng kỹ thuật để sản xuất insulin người tái tổ hợp với tên thương mại Humulin. Năm 1982, Humulin FDA (Food & Drug Administration – Cơ quan Quản lý thuốc thực phẩm Hoa Kỳ) cho phép lưu hành. Hiện có nhiều công ty dược phẩm giới sản xuất insulin tái tổ hợp như: Eli Lilly, Novo disk, Sanofi Aventis … với nhiều loại sản phẩm insulin khác nhau. Công nghệ sản xuất insulin thường tiếp cận theo hai phương pháp: phương pháp chuỗi polypeptide phương pháp hai chuỗi polypeptide. Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp phương pháp chuỗi polypeptide bao gồm ba bước bản. Đầu tiên bước tạo dòng chủng chủ (thường E. coli) có khả mang gen ngoại tổng hợp chất tiền thân insulin (proinsulin). Đây khâu then chốt đònh thành công công nghệ cần phải biến đổi codon thích hợp để tăng cường hiệu biểu hiện. Tiếp theo bước lên men, cảm ứng biểu hiện, thu nhận proinsulin xử lý để thu nhận insulin. Protein biểu dạng thể vùi nằm tế bào chất, cần phải biến tính để làm tan, sau tiến hành tái gấp cuộn để có proinsulin có cấu hình tự nhiên. Proinsulin tái gấp cuộn xử lý protease cắt loại đoạn nối nội phân tử (đoạn peptide C) để thu insulin có hoạt tính. Đối với phương pháp sản xuất theo mạch polypeptide, Luận án Tiến só Đặt vấn đề -3- trước hết phải tạo dòng chủng chủ riêng rẽ mang gen mã hóa cho chuỗi polypeptide khác (chuỗi A, chuỗi B). Sau tinh chế thu nhận chuỗi polypeptide A B thực phản ứng tạo cầu nối disulfide để thu nhận insulin có hoạt tính. Ở Việt Nam, nhu cầu sử dụng insulin cao, nhiên toàn nguồn insulin sử dụng cho bệnh nhân mắc BTĐ phải nhập ngoại nên vừa gây tốn ngoại tệ vừa không chủ động nguồn thuốc để đáp ứng chữa trò kòp thời cho bệnh nhân. Để đảm bảo cho điều trò toàn bệnh nhân mắc BTĐ hàng ngày với liều dùng 0,5-1,0 U/kg trọng lượng thể ngày [78], Việt Nam cần phải nhập ngoại khoảng từ 120-240 triệu U/ năm, tương đương 420-840 kg insulin/ năm (100U =3,5 mg). Năm 2001, giấy phép độc quyền sản xuất insulin tái tổ hợp thức hết hiệu lực, mở hội lớn cho nước phát triển có Việt Nam, tiếp cận công nghệ phát triển qui trình sản xuất insulin người tái tổ hợp nước, mang lại triển vọng góp phần giải khó khăn trên. Mặc dù quyền sản xuất insulin công nghệ DNA tái tổ hợp hết hạn nhiên công ty dược phẩm tiếp tục giữ bí công nghệ có tính mạnh công ty nên khó tiếp cận để có qui trình công nghệ đầy đủ nhằm sản xuất insulin. Do vậy, cần phải nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ riêng dựa thông tin công bố trình độ công nghệ sẵn có để tiến đến việc sản xuất insulin nước đáp ứng yêu cầu đặt ra. Năm 2007, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh giao nhiệm vụ thực đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp điều trò bệnh đái tháo đường”, mã số Luận án Tiến só Đặt vấn đề -126- 10. Andersen L., Dinesen B., Jorgensen P.N., Poulsen F., Roder M.E. (1993), “Enzyme immunoassay for intact human insulin in serum or plasma”. Clinical Chemistry, 39, pp. 578-582. 11. Ausubel F., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A., Struhl K. (1992), Short protocols in molecular biology, Third edition, Wiley, USA. 12. Baker T. A., Grossman A. D., Gross C. A. (1984), “A gene regulating the heat shock response in Escherichia coli also affects proteolysis”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp. 6779-6783. 13. Berg H., Walter M., Mauch L. (1993), “Expression human preproinsulinExpression, purification and reaction with insulin autoantibodies in sera from patients with insulin-dependent diabetes mellitus”, Journal of Immunological Methods, 164, pp. 211-231. 14. Cabrita L.D., Bottomley S.P. (2004), “Protein expression and refolding- a practical guide to getting the most out of inclusion bodies”, Biotechnol. Annu., Rev. 10, pp. 31-50. 15. Chang S.G., Choi K.D., Kim D.Y., Kang H.T., Song M.C., Shin H.C. (2002), “The role of β-turn in the folding of mini-proinsulin”, Bull. Korean Chem Soc., 23(10), pp. 1369-1370. 16. Chang S.G., Kim D.Y., Choi K.D., Shin J.M., Shin H.C. (1998), “Human insulin production from a novel mini-proinsulin which has high receptorbinding activity”, Biochem J., 329 (3), pp. 631-635. 17. Chen J.Q., Zhang H.T., Hu M.H., Tang J.G. (1995), “Production of human insulin in an E. coli system with Met-Lys-human proinsulin as the expressed precursor”, Appl Biochem Biotechnol, 55(1), pp. 5-15. 18. Chen X. F., Chen C., Wu D. H., Huai H., Chi X. C. (1997), “A new baculovirus of cultured shrimp”, Sei. China Ser. C40, pp. 630-635. 19. Clark E.D. (2001), “Protein refolding for industrial processes”, Current opinion in Biotechnology, 12(2), pp. 202-207. 20. Clark E.D.B. (1998), “Refolding of recombinant proteins”, Curr. Opin. Biotechnol., 9, pp. 157-163. Luận án Tiến só Tài liệu tham khảo -127- 21. Dabrowski S., Brillowska A., Kur J. (1999), “Use of the Green Fluorescent Protein Variant (YFP) to monitor MetArg human proinsulin production in Escherichia coli”, Protein Expression and Purification 16, pp. 315–323. 22. Dodoson G.G., Whittingham J.L., “Insulin structure and diabetes treatment” (http://www.yorvic.york.ac.uk/projects/3/3.5.htm). 23. Dorschug et al (2005), “Mini-proinsulin, its preparation and use”. United state patent, US 6,875,589 B1, USA. 24. Fang M., Huang H.L. (2001), “Advances in in vitro refolding of inclusion body proteins”, Chinese Journal of Biotechnology, 17(6), pp. 608-12. 25. Fernandez J.M., Hoeffler J.P. (1999), “Gene expression systems. Using nature for the art of expression”, Academic Press, San Diego. 26. Fikrig E., Barthold S.W., Kantor F.S., et al (1990), “Protection of mice against the Lyme Disease agent by immunizing with recombinant OspA”, Science, 250, pp. 553-556. 27. Gary Walsh (2002), Proteins-biochemistry and biotechnology, John Wiley & Sons Ltd. } 28. Glick B. J., Pasternak J.J. (2003), Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, 3rd edition, American Society for Microbiology, USA. 29. Hénaut, Danchin (1996), “Codon Usage in E. coli; Analysis and Predictions from Escherichia coli sequences”, Escherichia coli and Salmonella, 2(114), pp. 2047-2066, Neidhardt FC ed., ASM press, Washington, D.C. 30. Invitrogen (2006), Ni-NTA purification system for purification of polyhistidinecontaining recombinant proteins, User manual, Invitrogen corporation, USA 31. Jonasson P., Nilsson J., Samuelsson E., Moks T., Stahl S., Uhlen M. (1996), “Single-step trypsin cleavage of a fusion protein to obtain human insulin and its C peptide”, Eur J Biochem., 236(2), pp. 656-61. 32. Jungbauer A., Kaar W. (2007), “Current status of technical protein refolding”, Journal of Biotechnology, 128(3), pp. 587-596. 33. Kaelin W.G.Jr., Krek W., Sellers W.R., DeCaprio J.A., Ajchenbaum F., Fuchs C.S., Chittenden T., Li Y., Farnham P.J., Blanar M.A., et al (1992), Luận án Tiến só Tài liệu tham khảo -128- “Expression cloning of a cDNA encoding a retinoblastomabinding protein with E2F-like properties”, Cell., 70(2), pp. 351-364. 34. Kang Y., Yoon J.W. (1994), “Effect of modification of connecting peptide of proinsulin on its export”. J. Biotechnol., 36(1), pp. 45-54. 35. King K.M., Rubin G. (2003), “A history of diabetes: from antiquity to discovering insulin”, British journal of nursing, 12(8), pp. 1091-1095. 36. Kjeldsen T, Pettersson A.F., Hach M. (1999), “Secretory expression and characterization of insulin in Pichia pastosis”, Biotechnology & Applied Biochemistry, 29, pp. 79-86. 37. Kjeldsen T. (2000), “Yeast secretory expression of insulin precursors”, Appl Microbiol Biotechnol., 54, pp. 277-86. 38. Knorre W.A., Deckwer W.D., Korz D., Pohl H.D., Riesenberg D., Ross A., Sanders E., Schulz V. (1991), “High cell density fermentation of recombinant Escherichia coli with computer-controlled optional growth rate”, Annals NewYork Academy of Sciences, 646(1), pp. 300-306. 39. Kroeff E.P., Owens R.A., Campbell E.L., Johnson R.D., Marks H.I. (1989), “Production scale purification of Biosynthetic human insulin by reversedphase high-performance liquid chromatography”, Journal of chromatography, 461, pp. 45-61. 40. Leon O., Roth M. (2000), “Zinc fingers: DNA binding and protein-protein interactions”, Biological research. Biol. Res. v-33 n.l. 41. Lewcock A. (2007), “Cost-cutting plant-based insulin to hit market by 2010” (http://www.in-pharmatechnologist.com/Materials-Formulation/Cost-cuttingplant-based-insulin-to-hit-market-by-2010). 42. Lightner D.V. (1996), a handbook of shrimp pathology and diagnostic procedures for for disease of cultured penaeid shrimp, World aquaculture Society, Baton Rouge, Lousiana, USA. 43. Lilie H., Schwarz E., Rudolph R. (1998), “Advances in refolding of protein produced in E. coli”, Current opinion in Biotechnology, 9(5), pp. 497-501. 44. Luli G. W., Strohl W.R. (1990), “Comparison of growth, acetate production, and acetate inhibition of Escherichia coli strains in Batch and Fed-batch Luận án Tiến só Tài liệu tham khảo -129- fermentations”, Applied and environmental microbiology, 56(4), pp.10041011. 45. Microfluidics (2006), User Manual, Model M-110EH-30 Microfluidizer® Processor, Part No.85.0004. 46. Mierendorf R., Yeager K., Novy R. (1994), “pET system: Your choice for expression”, News letter of Novagen Inc., 1(1). 47. New England Biolabs (2005), Tools for Protein Research, New England Biolabs Inc., Ipswich, USA 48. New England Biolabs, IMPACTTM I: One-step protein purification system, Purification of recombinant by a self- cleavable affinity tag, version 1.8, New England Biolabs Inc., Ipswich, USA 49. Nilsson J., Jonasson P., Samuelsson E., Stahl S., Uhlen M. (1996), “Integrated production of human insulin and its C-peptide”. Journal of Biotechnol., 48(3), pp 241-250. 50. Nilsson J., Stahl S., Lundeberg J., Uhlen M., Nygren P.A. (1997), “Affinity Fusion Strategies for Detection, Purification, and Immobilization of Recombinant Proteins”, Protein Expression And Purification, 11, pp. 1–16, Article No. PT970767. 51. Novagen (2006), pET System Manual, TB055 11th Edition, Rev.B 0403, USA 800-207-0144. 52. Olmos-Soto J, Contreras-Flores R. (2003), “Genetic system constructed to overproduce and secrete proinsulin in Bacillus subtilis”. Appl Microbiol Biotechnol., 62, pp. 369-373. 53. Pais J.M., Varas L., Valdes J., Cabello C., Rodriguez L., Mansur M. (2003), “Modeling of mini-proinsulin production in Pichia pastoris using the AOX promoter”, Biotechnol Lett., 25(3), pp. 251-255. 54. Rodney J.Y. Ho, Gibadi M. (2003), Biotechnology and Biopharmaceuticals Transforming proteins and genes into drugs, Wiley-Liss,USA. 55. Rossini A.A., Like A.A., Chick W.L., Appel M.C., Cahill G.F. (1977), “Studies of streptozotocin-induced insulitis and diabetes”, Proc. Acad. Sci. USA, Cell Biology, 74(6), pp. 2485-2489. Luận án Tiến só Tài liệu tham khảo -130- 56. Sambrook J., Rusell D.W. (2001), Molecular cloning, a laboratory manual, Third Edition, Cold Spring Habor, New york, USA. 57. Schmidt M., Babu K.R., Khanna N., Marten S., Rinas U., (1999), “Temperature-induced production of recombinant human insulin in high-cell density cultures of recombinant Escherichia coli”, Journal of Biotechnology, 68, pp. 71-83. 58. Shiloach J., Fass R. (2005), “Growing E. coli to high cell density-A historical perspective on method development”, Biotechnology Advances, 23, pp. 345537. 59. Shin C.S., Hong M.S., Bae C.S., Lee J. (1997), “Enhanced production of Human Mini-Proinsulin in Fed-Batch culture at high cell density of Escherichia coli BL21(DE3)[pET-3aTM2]”, Biotechnol. Pro., 13, pp, 249-257. 60. Stahl S.J., Christiansen L. (1988), “Selection for signal sequence mutations that enhance production of secreted human proinsulin by Escherichia coli”. Gene., 71(1), pp. 147-156. 61. Stanbury P.F., Whitaker A., Hall S.J. (1995), Principles of Fermentation Technology, Second edition, Pergamon, USA. 62. The QIAexpressionistTM (2003), A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins, Fifth edition, QIAGEN, Germany. 63. Tjissen P. (1985), Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 15, Practice and Theory of Enume Immunoassqs, Elsevier, New York, USA. 64. Thim L., Hansen M.T., Sorensen A.R. (1987), “Secretion of human insulin by transformed yeast cell”, Published by Elsevier Science publishers B.V, 212(2), pp. 307-312. 65. Tsumoto K., Ejima D., Kumagai I., Arakawa T. (2003), “Practical considerations in refolding proteins from inclusion bodies”, Protein Expr Purif., 28(1), pp. 1-8. 66. Thermo scientific (2008), Nanodrop 100 Spectrophotometer V3-7 User’s Manual, Thermo fisher scientific, USA. Luận án Tiến só Tài liệu tham khảo -131- 67. Vallejo L.F., Rinas U., (2004), “Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins”. Microb Cell Fact, 3, pp. 11. 68. GraceVydac (2002), The handbook of analysis and purification of peptides and proteins by reversed-phase HPLC, third edition, GraceVydac®, USA (www.gracevydac.com). 69. Walker J.M.(2002), The protein protocol handbooks. Second edition, University of Herfordshire, Hatfield, UK. 70. Whittingham J.L., Scott D.J., Chance K., Wilson A., Finch J., Brange J., Dodson G.G. (2002), “Insulin at pH 2: Structural analysis of the conditions promoting Insulin Fibre Formation”. J.Mol. Biol., 318, pp. 479-490. 71. Wild S., Roglic G., Green A, Sicree R., King H. (2004), “Global Prevalence of Diabetes”, Diabetes care, 27(5), Epidemiology/Health Services/ Psychosocial Reasearch. 72. Winter J., Lilie H., Rudolph R. (2002), “Renaturation of human proinsulin-a study on refolding and conversion to insulin”, Analytical Biochemistry, 310, pp. 148-155. 73. Winter J., Neubauer P., Glockshuber R., Rudolph R. (2001), “Increased production of human proinsulin in the periplasmic space of Escherichia coli by fusion to DsbA”. J Biotechnol., 84(2), pp. 175-85. 74. US Pharmacopeia National Formulary (2004), USP 27, NF22, United states pharmacopieal convention. Inc, 12601 Twinbrock Parkway, Rockville: MD 20852. 3. Tài liệu tham khảo từ internet 75. http://mbel.kaist.ac.kr/research/protein_en5.html. High cell density cultivation (HCDC), down load date: Aug. 18, 2008. 76. http://www.ncbi.nlm.nil.gov/entrez/viewer.fcgi?db=protein&val=266373 77. http://www.who.int/diabetes/ 78. http://www.thuocbietduoc.com.vn/thuoc/thuoc-goc537.aspx Luận án Tiến só Tài liệu tham khảo -132- PHỤ LỤC 5.1. PHỤ LỤC 1: Xác đònh trình tự amino acid 6His-MPI phương pháp MS/MS 5.1.1. Phương pháp 5.1.1.1. Thủy phân protein gel enzyme trypsin Protein sau phân tách qua SDS-PAGE cắt nhỏ (kích thước xấp xỉ 1mm3) tiến hành thủy phân protein gel theo phương pháp mô tả (Cohen SL Chait BT, 1997; Shevchenko A et al, 2000; Stensballe A Jensen ON, 2001). Các protein sau thủy phân chiết rút khỏi gel dung dòch chiết (60% acetonitrile, 1% TFA). Dòch chiết có chứa peptide làm khô hệ máy SPD1010 SpeedVacđ System (ThermoSavant, USA). 5.1.1.2. Phân tách thành phần protein sắc ký lỏng chiều Hỗn hợp peptide sau thủy phân phân tích qua hệ thống sắc ký lỏng chiều thông qua cột ngược pha (reverse phase, RP-C18). Mẫu đưa vào với thể tích 20μl đẩy lên cột với tốc độ dòng 30μl/ phút 0,1% formic acid. Các peptide bám cột RP-C18 (75μm id.x15cm) pha linh động A (0,1% formic acid) B (85% acetonitrile 0,1% formic acid) với tốc độ dòng 200nl/phút, theo gradient nồng độ tuyến tính từ đến 100% pha linh động B 90 phút. Cột ngược pha C18 gắn vào đầu đưa mẫu Silica Tip kết nối với máy khối phổ QSTA®XL nguồn ESI. 5.1.1.3. Ghi phổ LC-ESI-MS/MS Máy khối phổ QSTA®XL vận hành chế độ IDA (Information Dependent Acquisition) để thực việc chuyển từ quét phổ TOF MS đơn ion nằm dải khối (TOF mass) từ 400 đến 1200 sang khối phổ liên Luận án Tiến só Phụ lục -133- tiếp ion phân tử có mật độ cao lớn 15 xác đònh tự động nhờ phần mềm BioAnalyst QS v1.8 (AppliedBiosystems). Sai số khối (mass tolerance) đặt mức 100ppm, thời gian không thực lại MS/MS mảnh 90 giây. Hiệu điện đặt để ion hóa mẫu 2200V. 5.1.1.4. Phân tích phổ khối peptide phần mềm Mascot Phổ khối MS/MS phân tích phần mềm Mascot v1.8, phần mềm có khả phân tích liệu phổ MS/MS để nhận dạng protein dựa thuật toán Mowse (Perkins DN et al., 1999) phát triển MatrixScience (London, UK). Cơ sở liệu dùng để tìm kiếm Mascot NCBInr, sở liệu protein không đồng toàn diện với khoảng 1,7 triệu trình tự khác cài đặt máy tính HP Proliant Server. 5.1.2. Kết Sắc ký đồ kết phân tách thành phần protein qua hệ thống sắc ký lỏng chiều ghi nhận Hình 5.1. + Phổ phổ ion tổng số hỗn hợp peptide sau thuỷ phân. Kết cho thấy lượng peptide thu cao (> e5), đảm bảo lượng peptide cho phân tích MS/MS. + Phổ thứ hai phổ quét TOF MS hỗn hợp peptide + Phổ thứ ba bốn phổ MS/MS hai ion có m/z tương ứng 549,2 417,2. Đây kết phân tích tìm kiếm protein từ peptide phân tích MS/MS. Kết tìm kiếm insulin với số đăng ký gi:266373 [76] mảnh peptide tìm thấy thực nghiệm FFYTPKTR. Phổ MS/MS peptide có trình tự FFYTPKTR xác đònh thực nghiệm. Luận án Tiến só Phụ lục -134- Hình 5.1. Kết phân tích nhận dạng MPI. Luận án Tiến só Phụ lục -135- Tài liệu tham khảo: 7. Perkins DN, Pappin DJ, Creasy DM, Cottrell JS (1999), Probabilitybased protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis, 20, pp. 355-356. 8. Cohen S L, Chait BT (1997), Mass spectrometry of whole proteins eluted from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis gels. Analytical Biochemistry, 247, pp. 257-267. 9. Stensballe A, Jensen ON (2001), Simplified sample preparation for mass spectrometry: in-gel digestion on the maldi probe. Proteomics, 1, pp. 955-66. 5.2. PHỤ LỤC 2: Hình ảnh thiết bò nghiên cứu 5.2.1. Hệ thống lên men Hình 5.2. Hệ thống lên men mini-jar 5L. Luận án Tiến só Phụ lục -136- Hình 5.3. Hệ thống lên men pilot. 5.2.2. Máy phá tế bào microfluidizer Hình 5.4. Máy phá tế bào Microfluidizer M-110EH-30. Luận án Tiến só Phụ lục -137- 5.2.3. Máy tinh chế protein FPLC (A) (B) Hình 5.5. Hệ thống FPLC dùng để tinh chế protein. (A) qui mô phòng thí nghiệm; (B) qui mô pilot. 5.2.4. Máy phân tích protein RP-HPLC Hình 5.6. Hệ thống sắc ký ngược pha RP-HPLC. Luận án Tiến só Phụ lục -138- 5.2.5. Máy lọc protein dạng tiếp tuyến (A) (B) Hình 5.7. Hệ thống lọc tiếp tuyến protein. (A) qui mô phòng thí nghiệm; (B) qui mô pilot. 5.2.6. Ly tâm sinh khối Hình 5.8. Máy ly tâm cao tốc thu sinh khối tế bào qui mô pilot. Luận án Tiến só Phụ lục -139- 5.2.7. Máy đo đường huyết Hình 5.9. Máy đo đường huyết Accu-check Active. 5.3. PHỤ LỤC 3: Ký hiệu amino acid theo ký tự Bảng 5.1. Bảng ký hiệu theo ký tự amino acid Amino acid Ký hiệu Amino acid Ký hiệu Isoleucine I Serine S Leucine L Tyrosine Y Valine V Tryptophan W Phenylalanine F Glutamine Q Methionine M Asparagine N Cysteine C Histidine H Alanine A Glutamic acid E Glycine G Aspartic acid D Proline P Lysine K Threonine T Arginine R (Nguồn: http://algoart.com/aatable.htm) Luận án Tiến só Phụ lục -140- 5.4. PHỤ LỤC 4: Bảng mã codon ưa dùng E. coli Bảng 5.2. Bảng mã codon ưa dùng E. coli Amino Codon Acid Phe Leu Ser Tyr TER Class I II III ttt 55.09 29.08 67.14 ttc 44.91 70.92 32.86 tta 10.99 3.44 ttg 13.02 tct Amino Codon Acid III ctc 10.40 8.03 9.04 20.09 cta 3.09 0.83 6.81 5.47 15.05 ctg 52.79 76.67 29.99 13.26 32.41 19.63 cct 13.71 11.23 28.30 tcc 15.02 26.56 11.34 ccc 11.19 tca 10.83 4.79 22.09 cca 18.63 15.25 31.50 tcg 16.88 7.39 10.60 ccg 56.47 71.89 23.94 tat 54.42 35.23 69.60 cat 56.80 29.77 61.69 tac 45.58 64.77 30.40 cac 43.20 70.23 38.31 caa 33.40 18.65 37.06 cag 66.60 81.35 62.94 cgt 38.99 64.25 26.05 cgc 42.23 32.97 21.94 taa Leu Pro His Gln tgt 40.90 38.85 55.71 tgc 59.10 61.15 44.29 tga Trp tgg Met II 9.70 TER Ile I ctt tag Cys Class 100.00 100.00 100.00 att 51.20 33.49 47.57 atc 44.37 65.94 26.65 ata 4.43 0.57 atg Luận án Tiến só Arg 5.56 19.00 1.63 16.26 cga 5.52 1.07 12.80 cgg 8.97 0.80 13.62 gtt 23.74 39.77 34.33 gtc 22.48 13.45 18.95 25.78 gta 14.86 19.97 21.78 100.00 100.00 100.00 gtg 38.92 26.81 24.94 Val Phụ lục -141- Thr Asn Lys Ser Arg act 14.85 29.08 26.83 gct 14.52 27.54 22.86 acc 46.83 53.60 24.45 gcc 27.62 16.14 23.67 aca 10.52 4.67 27.93 gca 19.63 24.01 31.27 acg 27.81 12.65 20.80 gcg 38.23 32.30 22.19 aat 40.87 17.25 64.06 gat 62.83 46.05 70.47 aac 59.13 82.75 35.94 gac 37.17 53.95 29.53 aaa 75.44 78.55 72.21 gaa 68.33 75.35 66.25 aag 24.56 21.45 27.79 gag 31.67 24.65 33.75 agt 13.96 4.52 18.73 ggt 32.91 50.84 31.79 agc 30.04 24.33 17.61 ggc 43.17 42.83 24.51 aga 1.75 0.62 15.63 gga 9.19 1.97 24.75 agg 1.54 0.29 9.96 ggg 14.74 4.36 18.95 Ala Asp Glu Gly (Nguồn: Hénaut and Danchin, 1996 [29]) 5.5. PHỤ LỤC 5: Kết theo dõi hàm lượng đường máu chuột sau tiêm insulin Bảng 5.3. Kết theo dõi hàm lượng đường máu chuột sau tiêm insulin Mẫu chuột Trọng lượng chuột (g) Nồng độ mẫu (IU/ml) 1. Insulin chuẩn (chứng dương) 25,08 0,02508 231 37 59 2. Dung dòch PBS (chứng âm) 20,45 - 155 115 93 3. Mẫu Insulin tái tổ hợp A 18,35 0,01835 331 238 240 4. Mẫu insulin tái tổ hợp B 26,76 0,02676 231 175 188 Luận án Tiến só Hàm lượng đường (mg/dl) sau tiêm phút 30 phút 60 phút Phụ lục [...]... phương pháp sản xuất insulin người bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA và đã được chấp nhận sử dụng từ năm 1982 1.3.2 Sản xuất insulin người bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA Insulin người tái tổ hợp được sản xuất theo hai phương án: (1) Biểu hiện hai chuỗi A, B độc lập sau đó thực hiện phản ứng tạo cầu nối disulfide hình thành phân tử insulin (phương án hai chuỗi); (2) Sản xuất proinsulin tái tổ hợp sau đó dùng... tiễn của đề tài là ứng dụng công nghệ gen, công nghệ lên men và công nghệ protein để tạo ra chế phẩm insulin có hoạt tính dùng làm thuốc trò bệnh tiểu đường Luận án tập trung nghiên cứu cụ thể các vấn đề sau: - Tạo chủng E coli tái tổ hợp có mang vector biểu hiện mini-proinsulin tái tổ hợp của người - Xây dựng qui trình lên men nuôi cấy chủng E coli tái tổ hợp biểu hiện mini-proinsulin - Thiết lập qui... KC.04.09/06-10 Nội dung nghiên cứu của luận án là thực hiện một phần trong nội dung của đề tài cấp nhà nước này Về mặt khoa học, mục tiêu của luận án nhằm bước đầu nghiên cứu qui trình tổng hợp insulin người tái tổ hợp theo phương pháp một chuỗi polypeptide trong E coli bao gồm tạo dòng E coli tái tổ hợp biểu hiện mini-proinsulin, lên men, tái gấp cuộn mini-proinsulin và xử lý để tạo insulin có hoạt tính... hiệu (trypsin/carboxypeptidase) cắt bỏ đoạn peptide C tạo insulin có hoạt tính (phương án một chuỗi) Gần đây, thay cho proinsulin trong phương án một chuỗi, người ta biểu hiện mini-proinsulin (có đoạn C ngắn hơn so với trường hợp proinsulin) để sản xuất insulin 1.3.2.1 Sản xuất insulin tái tổ hợp bằng phương án hai chuỗi Chế phẩm insulin tái tổ hợp của người đầu tiên được thu nhận bằng cách gắn hai đoạn... đạt đến 25% tổng protein của tế bào Phần dung hợp T2 sau đó được cắt bỏ bởi CNBr và M2PI mini-proinsulin được tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion Hiệu suất tái gấp cuộn của M2PI miniproinsulin tốt hơn từ 20-40% so với hiệu suất gấp cuộn của proinsulin 1.3.2.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất insulin trong nước Ở Việt Nam, công trình nghiên cứu sản xuất insulin tiếp cận theo hướng biểu hiện proinsulin ở tế... Lys để tạo vò trí cần cho việc cắt bỏ đoạn protein dung hợp (fusion protein) ra khỏi insulin sau này Do vậy, cấu trúc phức hợp này thường là Met-peptide/protein dung hợp- Arg/Lys- Proinsulin Sau đây là một số hướng tiếp cận trong sản xuất insulin người tái tổ hợp theo phương án một chuỗi - Biểu hiện proinsulin tái tổ hợp trong tế bào chất Preproinsulin được biểu hiện ở dạng thể vùi không tan trong tế... Phức tạp Có Có Có Có Có 1.4.2 Các chủng E coli thường dùng trong sản xuất protein tái tổ hợp Nhiều chủng E coli khác nhau đã được nghiên cứu thiết lập để biểu hiện protein tái tổ hợp bằng các vector biểu hiện khác nhau Khi lập phương án sản xuất protein tái tổ hợp trong E coli cần lựa chọn hệ thống vector biểu hiện và chủng chủ thích hợp cho protein mục tiêu Sau đây là một số chủng E coli tiêu biểu... khác nhau (chủng K12) và biểu hiện hai chuỗi A, B tái tổ hợp riêng rẽ Hai chuỗi peptide A, B sau đó được tinh sạch tạo các cầu nối disulfide để hình thành insulin có hoạt tính Năm 1999, Michael Schmidt và cộng sự công bố một nghiên cứu về Sản xuất insulin người bằng E.coli tái tổ hợp với cảm ứng nhiệt” theo phương án hai chuỗi Hai chuỗi A, B được tổng hợp riêng rẽ trên hai hệ thống biểu hiện sử dụng... nhiều nhà khoa học đã cố gắng phân lập những hợp chất từ tụy tạng có khả năng trò được BTĐ Năm 1922, Macleod chính thức công bố sự khám phá ra insulin Năm 1955, Fredick Sanger xác đònh trình tự amino acid của insulin Năm 1979, insulin được sản xuất bằng phương pháp tái tổ hợp và được thương mại hóa vào năm 1982, trở thành protein tái tổ hợp đầu tiên được sản xuất bằng phương pháp này và được sử dụng cho... chuỗi dạng mini-proinsulin tái tổ hợp Nhiều nghiên cứu cho thấy việc thay đoạn peptide C có chứa 35 amino acid bằng một đoạn peptide ngắn hơn cũng tạo được dạng tiền thân của insulin, gọi là mini-proinsulin (MPI), có cấu hình tự nhiên giống proinsulin nhưng có hiệu suất gấp cuộn cao hơn Lars Thim và cộng sự (1987) [53] đã tiếp cận nghiên cứu sản xuất insulin thông qua mô hình mini-proinsulin với đoạn . pháp sản xuất insulin người bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA và đã được chấp nhận sử dụng từ năm 1982. 1.3.2. Sản xuất insulin người bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA Insulin người tái tổ hợp được sản. hiện mini-proinsulin (có đoạn C ngắn hơn so với trường hợp proinsulin) để sản xuất insulin. 1.3.2.1. Sản xuất insulin tái tổ hợp bằng phương án hai chuỗi Chế phẩm insulin tái tổ hợp của người. nhà nước Nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp điều trò bệnh đái tháo đường”, mã số -4- Luận án Tiến só Đặt vấn đề KC.04.09/06-10. Nội dung nghiên cứu của luận án là thực