BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN DUY DƢƠNG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ NHẬN DẠNG MỘT SỐ NGUỒN GEN HOA LAN HOÀNG THẢO (DENDROBIUM) BẢN ĐỊA CỦA VIỆT NAM Chuyên ngành : Di truyền Chọn giống trồng Mã số : 62.62.01.11 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI - 2015 Luận án hoành thành tại: VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Lã Tuấn Nghĩa 2. TS. Nguyễn Thị Thanh Thuỷ Phản biện 1:…………………………………………………… . Phản biện 2:……………………………………………………… Phản biện 3:……………………………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sỹ Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Vào lúc:……giờ…….ngày…….tháng… năm… Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết đề tài Chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) có số lượng lớn, đa dạng hình dáng, màu sắc kích thước với 1148 loài khác nhau, đứng thứ họ hoa lan, sau chi lan Lọng (Bulbophyllum) (Leitch cs., 2009). Vùng Đông Nam Á coi quê hương chi lan Hoàng Thảo với hàng trăm loài, riêng Việt Nam có 100 loài (Trần Hợp, 1998; Nguyễn Xuân Linh, 2002; Averyanov, 2004; Dương Đức Huyến, 2007), chúng phân bố rộng rãi khắp vùng miền nước. Trong công tác bảo tồn sử dụng bền vững tài nguyên di truyền thực vật, việc đánh giá quỹ gen công đoạn vô quan trọng không phục vụ cho việc xác định giống/loài khác mà nhằm tìm hiểu mối quan hệ di truyền giống/loài để bảo tồn đa dạng nguồn gen. Sự phát triển mạnh mẽ phương pháp kỹ thuật lĩnh vực sinh học phân tử tạo công cụ hữu hiệu nhanh chóng ứng dụng nghiên cứu bảo tồn đa dạng sinh học. Ưu kỹ thuật phân tử có khả xác định đa dạng mức độ gen, tạo sở để đánh giá giá trị bảo tồn loài quần thể. Chính vậy, việc tạo lập sở liệu ADN (DNA fingerprinting) giống/loài, đăng kí ngân hàng gen giới, khẳng định chủ quyền quốc gia tài nguyên di truyền thực vật nước ta việc xác định quyền giống trồng thực quyền sở hữu trí tuệ tên giống trồng quý, đặc hữu Việt Nam nói chung lan Hoàng Thảo nói riêng vấn đề quan trọng, cấp bách, mang tính khoa học thực tiễn cao, không phục vụ cho lợi ích trước mắt mà định hướng mục tiêu lâu dài công tác bảo tồn khai thác hiệu qủa nguồn gen phục vụ chương trình kinh tế trọng điểm đất nước. sở , đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu đa dạng di truyền xác định thị nhận dạng số nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo (Dendrobium) địa Việt Nam”. 2. Mục tiêu luận án - Đánh giá đa dạng di truyền mức độ hình thái kết hợp với thị phân tử để xác định mối quan hệ di truyền giống/loài hoa lan Hoàng Thảo địa phục vụ cho công tác phân loại, chọn lai tạo giống mới. - Sử dụng thị ITS để để nhận dạng số nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo địa quý Việt Nam phục vụ cho công tác bảo tồn, làm sở liệu cho xây dựng ADN mã vạch. 3. Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học - Cung cấp liệu khoa học đa dạng di truyền mức hình thái mức phân tử mẫu giống hoa lan thuộc chi Hoàng Thảo địa, sở để tuyển chọn nguồn gen ưu tú phục vụ cho công tác chọn lai tạo giống mới; - Kết đề tài có ý nghĩa việc nhận dạng số giống/loài lan Hoàng Thảo địa Việt Nam, làm sở cho công tác bảo tồn, lưu giữ nguồn gen quý, có giá trị kinh tế đăng kí ngân hàng gen giới. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn - Đề tài góp phần thu thập lưu giữ nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo địa Việt Nam; góp phần bảo tồn sử dụng hợp lí nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo quý Việt Nam bảo tồn, l . 4. Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu đề tài 4.1. Đối tƣợng nghiên cứu - Là mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo địa phân bố vùng miền Việt Nam. 4.2. Địa điểm thời gian nghiên cứu - Thí nghiệm triển khai tại: Bộ môn Kĩ thuật Di truyền, thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp- Phạm Văn Đồng -Từ Liêm, Hà Nội. - Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2010 đến năm 2014. 5. Những đóng góp luận án Luận án công trình nghiên cứu cách có hệ thống đánh giá đa dạng di truyền thị hình thái kết hợp với thị phân tử, nhận dạng mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo địa quý Việt Nam dựa vào trình tự vùng ITS. Kết luận án có ý nghĩa việc phân loại, phục vụ cho việc bảo tồn, , phong l . CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lƣợc chi lan Hoàng Thảo 1.1.1. Hệ thống phân loại Trong hệ thống phân loại thực vật, chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) thuộc họ lan hay họ phong lan (Orchidaceae), lan (Orchidales), phân lớp Hành (Liliidae), lớp mầm (Liliopsida), ngành thực vật hạt kín Angiospermanophyta), phân giới thực vật bậc cao (Cosmobionia), giới thực vật (Plantae) (Trần Hợp, 1998; Hoàng Thị Bé, 2004; Leitch cs., 2009; Evans cs., 2012). Nghiên cứu phân loại chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium. sw) Việt Nam thường dựa hệ thống Seidenfaden (1985). Hệ thống rõ ràng, không phức tạp, có độ tin cậy cao phù hợp với đại diện chi lan Hoàng Thảo Việt Nam (Trần Hợp, 1998; Dương Đức Huyến, 2007). 1.1.2. Đặc điểm hình thái 1.1.2.1. Thân Thân đại diện chi lan Hoàng Thảo phân đốt, hình trụ, hình suốt, hình chùy, hình trứng, có chiều dài thay đổi từ 2-3cm đến 120cm hơn, kích thước phổ biến 20-50cm (Trần Hợp, 1998). Thân mảnh, dẹp bên dày mập lên hay có dạng tràng hạt. 1.1.2.2. Rễ Rễ đại diện chi lan Hoàng Thảo rễ khí sinh, thường mảnh, hình trụ, màu xanh chuyển thành nâu già, chúng thường ôm lấy giá thể buông thõng xuống. 1.1.2.3. Lá Lá mọc thành hai dãy so le nhau, cuống mà có bẹ ôm thân, bẹ. Lá thường cứng, dạng da, bóng, nạc mềm, bề mặt thường nhẵn. Lá thường hình mác, bầu dục, hình kiếm, hình thuôn hình thoi dài (Averyanov, 2004). 1.1.2.4. Nhóm hoa Nhóm hoa thường nhiều hoa, hoa hoa đơn độc. Nhóm hoa dài thường rủ thõng xuống, nhiều loài có nhóm hoa đẹp có giá trị làm cảnh (Trần Hợp, 1998). 1.1.2.5. Hoa Hoa lưỡng tính, đối xứng hai bên. Màu sắc hoa đa dạng, sặc sỡ. Hoa đa số loài có hương thơm. 1.1.2.6. Quả Quả nang thường hình chùy hình suốt, chứa nhiều hạt nằm xen lẫn sợi lông mảnh 1.1.3. Phân bố vùng sinh thái Ở 100 loài phân bố chủ yếu vùng núi suốt từ Bắc, Trung, Nam số đảo ven biển nước ta (Trần Hợp, 1998; Averyanov, 2004). 1.2. Giá trị sử dụng củaa hoa lan Hoàng Thảo Ngoài ý nghĩa làm cảnh, số loài Hoàng Thảo vị thuốc dân tộc cổ truyền h cs., 2004; Cai cs., 2012; Feng cs., 2013). 1.3. Tổng quan phƣơng pháp nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền xác định maker nhận dạng thực vật 1.3.1. Khái niệm đa dạng di truyền Đa dạng di truyền đa dạng thành phần gen cá thể loài loài khác nhau, đa dạng gen di truyền quần thể quần thể. 1.3.2. Ý nghĩa việc nghiên cứu đa dạng di truyền Đa dạng sinh học cần thiết cho tồn loài, quần xã tự nhiên quan trọng người. 1.3.3. Các phƣơng pháp đánh giá đa dạng di truyền xác định thị nhận dạng thực vật 1.3.3.1. Phƣơng pháp dựa vào thị hình thái Phương pháp đánh giá đa dạng mức hình thái phương pháp truyền thống, bao gồm việc miêu tả đặc điểm, cấu tạo hình thái bên ngoài, cụ thể thân, lá, hoa. 1.3.3.2. Phƣơng pháp dựa vào thị hóa sinh Các isozyme định nghĩa dạng khác enzyme (protein) có chức giống hay gần gũi có cá thể (Salazar, 2003). 1. 3. 3. 3. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền dựa vào thị phân tử ADN Các thị ADN phổ biến nghiên cứu sinh học phân tử thực vật là: Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP); Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP); Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD); Microsatellite hay Simple Sequence Repeates (SSR); Inter-simple sequence repeats (ISSRs) (Singh cs., 2012; Shangguo cs., 2013; Swati Das cs., 2014). 1.3.3.4. Các phƣơng pháp nghiên cứu phân loại thực vật dựa trình tự gen * Vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) đoạn RNA chức năng, nằm RNA cấu trúc ribosome thường dịch mã. Cấu trúc vùng ITS gồm ITS1 – 5.8S – ITS2. Một lợi vùng ITS bao gồm locus riêng biệt (ITS1 ITS2) nối với qua locus 5.8S. Vùng 5.8S bảo ôn, thực tế có đủ tín hiệu phát sinh loài phân biệt mức ngành (Richardson cs., 2001; Sharma cs, 2012). * Vùng Gen rbcL (ribulose-bisphosphate carboxylase) sử dụng nhiều để dựng phát sinh loài. Tuy nhiên, mối quan hệ di truyền mức loài phân tích gen gặp nhiều hạn chế (Kress Erickson, 2007). * Vùng gen matK (gen mã hóa cho maturaseK): Các nghiên cứu sử dụng trình tự gen matK để xây dựng phát sinh loài cho thấy gen matK có tính đa dạng gen khác có lục lạp gen matK trở thành gen thị quan trọng để giúp phân loại thực vật (Asahina cs., 2010; Sharma cs., 2012). 1. 4. Tình hình nghiên cứu hoa lan giới Việt Nam 1.4.1. Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền xác định thị nhận dạng hoa lan giới 1.4.1.1. Nghiên cứu mức độ hình thái Đối với loài Lan Hoàng Thảo (Dendrobium), có nhiều nghiên cứu lan Hoàng Thảo nghiên cứu Pellegrino cs., 2005; Krishnan cs., 2011). 1.4.1.2. Nghiên cứu mức độ phân tử * Các nghiên cứu dựa vào thị RFLP ADN lạp thể Đối với hoa lan Hoàng Thảo, Surin cs., 2014 sử dụng kĩ thuật RFLP để xác định định dạng 25 giống hoa lan Hoàng Thảo địa Thái Lan. 23 số 25 giống nhận dạng, có hai loài D. crumenatum D. formosum không xác định được. * Các nghiên cứu dựa vào thị RAPD Đã có nghiên cứu sử dụng thị RAPD để phân tích đa hình lan, nghiên cứu chủ yếu tập trung vào số loại lan Kiếm (Cymbidiums), lan Hài (Paphiopedilum), lan Hồ Điệp (Phalaenopsis), lan Đai Châu (Rhynchostylis gigantea) lan Hoàng Thảo (Dendrobium) (Bateman, 2001; Choi cs., 2006; Goh cs., 2005; Li cs., 2007; Parab cs., 2008; Zha cs., 2009; Chattopadhyay cs., 2012; Paromik Suman, 2014). Trên hoa lan Hoàng Thảo, nhất, Pritam Chattopadhyay cs., 2012 sử dụng mồi RAPD để phân tích mối quan hệ di truyền loài lan Hoàng Thảo phía Bắc Ấn Độ. Kết cho thấy, với tổng số 124 băng ADN phân tích phát có 25 băng cá biệt giống lan Hoàng Thảo. * Các nghiên cứu dựa vào thị SSR Đối với . Đối với chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium), có vài nghiên cứu sử dụng thị SSR để đánh giá đa dạng di truyền năm gần nghiên cứu Fan cs., 2009, Cai cs., 2012; Liu cs., 2014). * Các nghiên cứu dựa vào thị ISSR Với hoa lan Hoàng Thảo, năm 2009 tác giả Wang cộng sử dụng 17 thị ISSR để đánh giá đa dạng di truyền 31 loài hoa lan Hoàng Thảo thu thập Trung Quốc. Kết cho thấy, số tổng 2368 băng khuếch đại thi có 278 ISSR locus có độ đa hình 100%. * Các nghiên cứu dựa vào trình tự ADN Công trình giới sử dụng mã vạch ADN để phân biệt Dendrobium công trình nhóm tác giả Trung Quốc công bố năm 2009 (Yao cs., 2009). Trong nghiên cứu này, tác giả giải mã vùng chen psbA-trnH nằm genome lục lạp 17 loài Dendrobium. Cũng đối tượng Dendrobium, nhóm tác giả Nhật Bản (Asahina cs., 2010) lại sử dụng trình tự gen matK rbcL để phân định loài đồng thời nghiên cứu phát sinh chủng loài nhóm Dendrobium dùng y học. 1.4.2. Tình hình nghiên cứu hoa lan Việt Nam Từ năm 1985 đến có số viện nghiên cứu trường đại học Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, Viện Sinh học Nhiệt đới, Đại học Nông Nghiệp I, Đại học Lâm Nghiệp, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Rau hoa tập trung vào nghiên cứu, điều tra, phân loại lưu giữ số tập đoàn phong lan nước ta. Đối với hoa lan Hoàng Thảo, Nguyễn Thị Mỹ Duyên cộng sự., 2012 nghiên cứu dựa đặc điểm hình thái tìm ba loài D.pulchellum, D.Gatton Sunray D.moschatum có mối quan hệ gần nhau, mức tương đồng 96,5% 95%. : “Đánh giá đa dạng di truyền giống lan rừng Dendrobium . rker nhận dạng đối tượng lan Hoàng Thảo dựa giải trình tự vùng gen ITS, matK, rbcL . Mới nhất, Trần Hoàng Dũng cộng 2012 ứng dụng công nghệ ADN để phânn loại nhận diện lan Hoàng thảo trầm rừng (D.parishii) Phi điệp (D.anosmum) Việt nam. CHƢƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Vật liệu phục vụ cho nghiên cứu bao gồm: - Kế thừa nguồn vật liệu có Viện Di truyền Nông nghiệp GS. TS. Trần Duy Quý, 32 mẫu giống hoa lan thuộc chi Hoàng Thảo (độ tuổi từ 2-3 năm) thu thập tỉnh miền nước lưu giữ vườn lan thuộc Trung tâm công nghệ cao, Viện Di truyền Nông nghiệp nhà vườn số 422, đường Phạm Văn Đồng, Từ Liêm, Hà Nội. 2.2. Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Nội dung 1: Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo địa Việt Nam 2.2.1.1. Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo mức hình thái 2.2.1.2. Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo mức độ phân tử thị RAPD 2.2.2. Nội dung 2: Giải trình tự vùng ITS gen ribosom nhân để nhận dạng số nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo địa tập đoàn nghiên cứu 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2. 3.1. Phƣơng đánh giá đa dạng di truyền mức hình thái - Mô tả hình thái hoa lan theo phương pháp Pellegrino, 2005 phương pháp truyền thống, bao gồm việc miêu tả đặc điểm, cấu tạo hình thái bên ngoài. 2.3.2. Phƣơng pháp đánh giá đa dạng di truyền mở mức phân tử thị RAPD 2.3.2.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số 2.3.2.2. Điện di kiểm tra kết tách chiết ADN tổng số 2.3.2.3. Kiểm tra ADN gel agarose 2.3.2.4. Kiểm tra ADN máy đo quang phổ 2.3.2.5. Phản ứng RAPD Các loại mồi RAPD thuộc nhóm OPA OPN hãng Operon cung cấp; mồi ITS Sigma cung cấp. 2.3.3. Giải trình tự vùng ITS gen ribosom nhân 2. 3.3.1. Khuếch đại vùng ITS kỹ thuật PCR Vùng ITS khuếch đại cặp mồi ITS1 ITS4. 2.3.3.2. Giải trình tự sản phẩm PCR 2. 3.3.3. So sánh với sở liệu GenBank 2. 3.3.5. Xây dựng phát sinh loài 2.4. Phần mềm xử lý số liệu - Số liệu nghiên cứu phân tích, xử lý dựa phần mềm Excel version 5.0, phần mềm PCORD, phần mềm NTSYS, MEGA: phiên 5.2.1, để xây dựng phát sinh loài. 2. 5. Địa điểm thời gian nghiên cứu - Địa điểm thời gian nghiên cứu: Bộ môn Kĩ thuật Di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp, thời gian nghiên cứu: 2010-2014. 3.1. CHƢƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN tập đoàn chi lan Hoàng Thảo hoa lan nhà vườn số 422 Phạm Văn Đồng, Từ Liêm, Hà Nội Thảo C (D2 - . Các mẫu giống hoa như: D4, D7, D8, D12, D13, D14, D17, D19, D20, D21, D22, D23, D24 D25 có dải phân bố rộng từ Bắc đến Nam. Các mẫu giống hoa lại tìm thấy số địa phương vài tỉnh miền Trung phía Nam, có mẫu giống hoa Hoàng thảo Vani (D27), Hoàng Thảo Đại Bạch hạc (D32) tìm thấy Kontum. 3.1.1. Kết đánh giá đa dạng si truyền thị hình thái Thân đại diện chi Hoàng thảo phân đốt, có nhiều hình dạng như: hình suốt, hình chùy, hình vuông, hình tràng hạt, thuôn tròn, phổ biến hình trụ. Thân có nhiều dạng khác như, thân mảnh thân bám, thân phình to mập, thân dài, thân ngắn phình to, đa số thân dài, buông thõng xuống. Cá biệt có loài có mấu dày lên, lóng không có, làm thân có dạng tràng hạt (D2) dày lên độc lập lóng làm thành dạng đùi gà nối tiếp (D28). Đây dấu hiệu đặc trưng để nhận dạng hoa lan Hoàng Thảo Điện Biên (D2) loài đặc hữu Điện Biên. Bảng 3.1. Các Ký hiệu D1 D2 Tên tiếng Việt Hoàng Thảo Long nhãn Lai Châu Hoàng Thảo Chuỗi ngọc Điện Biên Tên Latin Xuất xứ Ký hiệu Tên tiếng Việt Tên Latin Xuất xứ D. fimbriatum Lai Châu D17 Hoàng Thảo Kim Điệp D. capillipes Lâm Đồng D. findlayanum Điện Biên D18 Hoàng Thảo Chuỗi Ngọc D. findlayanum Kontum D. farmeri Đồng Nai D. chrysotoxum D. chrysotoxum Kontum Lâm Đồng Hoàng Thảo Kiều trắng Đồng Nai Hoàng Thảo Tiểu hoàng lạp Hoàng Thảo Đại hoàng lạp D3 Hoàng Thảo Thái Bình D. moschatum Thái Bình D19 D4 D5 Hoàng Thảo Phi Điệp tím Hoàng Thảo Trầm tím D. anosmum D.parishii Hòa Bình Sơn La D20 D21 D6 Hoàng Thảo trầm trắng D.parishii.var alba Điện Biên D22 Hoàng Thảo bạch hạc langbiang D. wattii Lâm Đồng D7 Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng D. chrysanthum Yên Bái D23 Hoàng Thảo Hạc vĩ D. aphylum Đà Lạt Hoàng Thảo Phi điệp vàng D. chrysanthum Điện Biên D24 Hoàng Thảo vảy rồng nhỏ D.lindleyi QuảngTrị D9 Hoàng Thảo Long tu Bắc D. primulinum Sơn La D25 Hoàng Thảo Vảy rồng trung D. lindleyi Lâm Đồng D10 Hoàng Thảo Trúc D. hancockii Ninh Bình D26 Hoàng Thảo Thủy tiên mỡ gà D. haveyanum D11 Hoàng Thảo Xoắn D. tortile Ninh Bình D27 D12 D13 Hoàng Thảo Hoàng Thảo Kiều vàng D. amabile D. thyrsiflorum D28 Tuyên Quang D29 Hoàng Thảo Đùi gà Hoàng Thảo Long tu đá D14 Hoàng Thảo Kiều trắng D. farmeri Tuyên Quang D30 Hoàng Thảo Môi tơ D15 Hoàng Thảo Tam Đảo D. daoense Tam Đảo D31 Hoàng Thảo Nhất Điểm Hồng D32 Hoàng Thảo Đại bạch hạc Hoàng Thảo Hoàng lạp Tây D. chrysotoxum Bắc Ghi chú: D. Dendrobium D16 Hoàng Thảo Vani Lâm Đồng D. aduncum Kon Tum D. nobile D. primulinum D. delacourii Guill D. draconis Rchb.f Đà Lạt Tây Nguyên D. christyanum Kontum Tây Nguyên Lâm Đồng I II III IV V Hình 3.6. Sơ đồ hình mối quan hệ di truyền 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo dựa thị hình thái Nhóm II: gồm 15 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo khác có hệ số tương đồng di truyền từ 37-100% bao gồm mẫu giống D2, D7, D9, D12, D13, D14, D17, D18, D19, D22, D23, D26, D27, D29, D30 mức độ tương đồng di truyền từ 37-100%. Ở mức độ tương đồng di truyền 43% mẫu lại chia thành hai nhóm phụ khác bao gồm: Nhóm phụ II.1: Bao gồm mẫu giống mẫu D2, D9, D17, D18, D23, D27, D29 D30 hai mẫu D2 D18 có hệ số tương đồng di truyền 100%. Nhóm phụ II.2: Bao gồm mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo gồm D7, D12, D13, D14, D17, D19 D26 mức độ tương đồng di truyền 68%. Nhóm phụ thứ II.2 chia thành hai nhóm nhỏ D7 D17 vào nhóm lại mẫu giống D12, D13, D14, D19, D26 tạo thành nhóm. Đây giống hoa lan Hoàng Thảo Kiều miền Bắc hay gọi Thủy Tiên theo cách gọi người miền Nam. Các mẫu giống hoa nhóm đặc điểm hình thái thân, lá, hình dạng hoa giống nhau, khác màu hoa Nhóm bao gồm loài mang đặc điểm có hoa to, cánh môi thường phủ lông rậm, có u lồi. Tuy khác biệt lớn thân có hình suốt, tập trung đỉnh, cụm hoa thường nhiều hoa (Clements, 2003; Dương Đức Huyến, 2007). Nhóm III: Bao gồm mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo D8, D28, D31và D32. Trong số mẫu giống hai mẫu giống D31 D32 dễ nhầm chúng có đặc điểm hình thái thân, lá, rễ, hoa tương đối giống nhau. Hai mẫu giống khác đặc điểm hình dạng cánh môi, mẫu giống D31 có hình dạng hình mác, mẫu giống D32 có dạng hình cằm. Nhóm IV: Bao gồm mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo mẫu giống D16, D20 D21. Trong số mẫu giống hai mẫu giống D20 D21 phân bố hai tỉnh Đồng Nai Lâm Đồng. Về mặt hình thái chúng có màu hoa giống hình thái thân, lá, rễ nhau, khác kích thước lá. 10 Nhóm V: gồm hai mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo Hoàng Thảo vảy rồng nhỏ (D24) Hoàng Thảo Vảy rồng trung (D25). Đây hai mẫu giống phân bố khắp ba miền Bắc, Trung Nam có đặc điểm hình thái khác kích cỡ lá. Có thể nhận thấy hai giống loài khác vùng phân bố nên khả sinh trưởng phát triển chúng có sai khác đặc biệt lá. Sự phân loại chi Dendrobium từ trước đến vấn đề phức tạp họ Orchidaceae đa dạng hình thái, phạm vi phân bố rộng, số lượng loài lớn, biến đổi hình thái chồng chéo loài. Cho tới nay, đại đa số nhà phân loại chia chi lan Hoàng Thảo thành nhóm (section). Một vài tác giả chọn cách phân chia chi Dendrobium thành phân chi (subgenra)(Dressler, 1993; Kumar cs., 2011; Schuiteman, 2011). Chính vậy, nghiên cứu này, việc sử dụng thị hình thái để đánh giá đa dạng di truyền tương đối . Tuy nhiên, việc phân loại loài thuộc chi lan Hoàng Thảo Việt Nam mức hình thái thị RAPD. 3.1.2. Kết đánh giá đa dạng di truyền mức phân tử 3.1.2.1. Kết tách chiết ADN tổng số . 3.1.2.2. Kết thực mẫu số 408 loại 4,5 2. Với 20 mồi ngẫu nhiên, mồi OPN9 có tổng số băng nhân lên nhiều (254 băng), mồi OPN7 có tổng số băng nhân lên thấp (84 băng). Dưới số mồi RAPD điển hình (Hình 3.11). Trong tổng số 20 mồi RAPD sử dụng nghiên cứu có 26 loại băng cá biệt băng khuyết xuất hiện. Mồi OPN7 cho năm loại băng khác nhau. Còn lại mồi OPN1, OPN2, OPN3, OPN6, OPN8, OPN11, OPN12, OPN13, OPN16, OPN19, OPN20, OPA3 OPA6 xuất 1-2 băng cá biệt/hoặc băng khuyết. V mẫu . * 11 Hình 3.11. Ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo với mồi OPN11; Giếng 1-32: Các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo địa (D1-D32); M: 1kb ladder 3.1.2.3. Mối quan hệ di truyền mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo quan hệ hệ số tương đồng di truyền sơ đồ 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo 3.13). Xét mức độ tương đồng di truyền 32%, 32 . Hình 3.13. dựa thị phân tử RAPD : 34- 100%. Nhóm phụ thứ (I.1) gồm mẫu giống bao gồm giống D1 (Hoàng Thảo Long Nhãn Lai Châu), D3 (Hoàng Thảo Thái Bình), D11 (Hoàng Thảo Xoắn), D15 (Hoàng Thảo Tam Đảo), D10 (Hoàng Thảo Trúc) D30 (Hoàng Thảo Môi tơ) có hệ số tương đồng di truyền từ 50-80%. Nhóm phụ thứ (I.2) bao gồm mẫu giống giống D4, D5, D6, D7 D17. Trong nhóm này, giống D4 (Hoàng Thảo Phi điệp tím), D5 (Hoàng Thảo Trầm tím) D6 (Hoàng Thảo Trầm trắng) có hệ số tương đồng di truyền cao từ 80-100%. (Hình 3.14). Trong mẫu giống hai mẫu giống D5 D6 có hệ số tương đồng 100%. Đây hai giống Hoàng Thảo trầm thu thập hai vùng Sơn La Điện 12 Biên có đặc điểm hình thái thân, lá, kiểu hoa giống khác màu sắc hoa. Kết tương tự tác giả Trần Hoàng Dũng cs., 2012 nghiên cứu tập đoàn lan Hoàng Thảo địa với hai loài Trầm rừng (Dendrobium parishii) Phi điệp (Dendrobium anosmum) Việt Nam (Trần Hoàng Dũng cs., 2012 ). Nhóm phụ thứ ba (I.3) hai mẫu giống D10 (Hoàng Thảo Trúc) D15 (Hoàng Thảo Tam Đảo) với hệ số tương quan di truyền 53%. Hai giống hoa thu thập miền Bắc Ninh Bình Tam Đảo, chúng khác hoàn toàn thân, hoa. Hình 3.14. Giống lan Hoàng Thảo D4 (Phi Điệp tím), D5 (Trầm tím), D6 (Trầm trắng) Nhóm II: Gồm mẫu giống D9, D12, D13, D14, D29, D19, D26 D27 chia thành hai nhóm phụ khác mức độ tương đồng di truyền 47%. Nhóm phụ thứ (II. 1) gồm bốn mẫu giống D9, D29, D27 D26 có hệ số tương đồng dao động từ 51-75 % có hai giống D9 (Hoàng Thảo Long tu Bắc) D29 (Hoàng Thảo Long tu đá) có hệ số tương đồng cao 75%. Nhóm phụ thứ hai (II. 2) gồm mẫu giống D12, D13, D14 D19 có hệ số tương đồng di truyền từ 65-80%. Các giống Kiều đặc điểm thân gần giống nhau, hoa dạng trùm khác màu hoa. Trong giống Kiều có hai giống D13 (Hoàng Thảo Kiều vàng) D14 (Hoàng Thảo Kiều trắng) có hệ số tương đồng cao 80%. Nhóm III: gồm mẫu giống D23 (Hoàng Thảo Hạc vĩ) D28 (Hoàng Thảo đùi gà) mức độ tương đồng di truyền 50%. Nhóm IV: gồm giống giống D16, D20, D21, D22, D31và D32 chia làm hai nhóm phụ với hệ số tương đồng di truyền dao động từ 33-50%. Nhóm phụ thứ (IV.1) gồm hai mẫu giống D31 D32 với hệ số tương quan di truyền 50%; Nhóm phụ thứ hai (IV.2) gồm giống D16, D20, D21 D22 với hệ số tương quan di truyền dao động từ 50-75%. Trong đó, giống D20 D21 có hệ số tương quan di truyền cao 75%. Nhóm V: gồm ba giống D8, D24, D25 có hệ số tương đồng di truyền tương đối cao số nhóm dao động từ 50-100%. Trong nhóm này, hai giống D24 (Hoàng Thảo vảy rồng nhỏ) D25 (Hoàng Thảo vảy rồng trung) đồng d 100%. 13 3.1.3. Kết hợp thị hình thái thị RAPD phân tích đa dạng di truyền giống hoa lan Hoàng Thảo 32 mẫu . Qua kết so sánh sơ đồ hình thị hình thái sơ đồ hình thị RAPD cho thấy 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo chia làm nhóm khác nhau. Các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo có quan hệ gần mặt di truyền xếp chung vào nhóm. Trong số mẫu giống có mẫu giống có hệ số di truyền như mẫu giống D5 (Hoàng Thảo Trầm tím) D6 (Hoàng Thảo Trầm trắng); D24 (Hoàng Thảo Vảy rồng nhỏ) D25 (Hoàng Thảo vảy rồng trung). Bên cạnh mẫu giống khác D2 (Hoàng Thảo Chuỗi Ngọc Điện Biên) D18 (Hoàng Thảo Chuỗi Ngọc); giống lan Hoàng Thảo Kiều có hệ số tương đồng cao từ 65-80%. Tóm lại, việc nghiên cứu, đánh giá so sánh đa dạng di truyền tập đoàn giống Hoa lan Hoàng Thảo công việc cần thiết nhằm tạo nên sở liệu cho phương pháp bảo tồn, phát triển sử dụng bền vững nguồn tài nguyên di truyền, đồng thời có ý nghĩa chiến lược chương trình cải thiện giống. Việc kết hợp phương pháp . Tuy nhiên, việc sử dụng thị RAPD việc phân loại loài/dưới loài nhiều hạn chế, để xác định loài, loài cần phải kết hợp giải trình tự ADN lục lạp vùng ITS, giải trình tự gen matK, gen rbcL (Richardson cs., 2001; Sharma cs, 2012, Liu cs., 2014). 3.2. Kết nhận dạng mẫu giống hoa lan Hoàng thảo dựa trình tự vùng ITS 3.2.1. Kết khuếch đại vùng ITS PCR Với cặp mồi ITS1 ITS4, khuếch đại thành công đoạn ITS PCR. Kết sản phẩm PCR thu có chất lượng tốt với băng rõ cho giống lan Hoàng Thảo gel agarose 1% sau điện di (Hình 3.17). Các băng nằm vị trí khoảng 700-800 bp. Như vậy, kích thước vùng gen ITS khuếch đại phù hợp. Kết phù hợp với kết nghiên cứu tác giả khác khuếch đại vùng ITS lan Hoàng Thảo (Chiang Tsong, 2012; Trần Hoàng Dũng cs., 2012; Liu cs., 2014). Các băng sản phẩm rõ, kích thước nên sử dụng giải trình tự. Sản phẩm đoạn ITS sau khuếch đại PCR tinh phương pháp Qiagen Kit. 14 Hình 3.17. Ảnh điện di đoạn ITS 32 mẫu giống hoa hoa lan Hoàng Thảo đƣợc khuếch đại PCR với cặp mồi ITS1 ITS4 Giếng 1-32: Các giống hoa lan Hoàng Thảo; M: 100bp ladder 3.2.2. Kết phân tích trình tự mẫu giống hoa lan Hoàng thảo dựa trình tự vùng ITS 3.3.2.1. Kết giải trình tự vùng ITS 32 mẫu lan Hoàng Thảo Qua kết giải trình tự cho thấy, 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo khuếch đại giải trình tự vùng ITS bao gồm phần vùng 18S, toàn vùng ITS1, 5.8S, ITS2 phần vùng 26S, tổng chiều dài thu từ 652 đến 715 nucleotide, trung bình 685,3 nucleotide. Tỉ lệ % trung bình T(U)= 22,4%; C = 24,3%; A = 23,7 %; G =29,6%. Kết khá phù hợp với nhận định Xu cs., 2005; Sigh cs., 2012; Liu cs., 2014. 3.3.2.2. Kết so sánh trình tự đoạn ITS số mẫu hoa lan Hoàng Thảo địa Việt Nam giới Để so sánh khác biệt trình tự mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo Việt nam giới, tiến hành phân tích trình tự mẫu lan Hoàng Thảo Việt nam giới dựa phân tích cột thẳng hàng. Dưới số kết so sánh trình tự vùng ITS số mẫu hoa lan Hoàng Thảo Việt Nam giới. * Kết so sánh trình tự mẫu D2 (Hoàng Thảo Chuỗi Ngọc Điện Biên) D18 (Hoàng Thảo Chuỗi Ngọc) Qua kết phân tích cột thẳng hàng (alignments) trình tự ITS mẫu D2, D18 Việt Nam hai mẫu D. findlayanum |KF143462.1|, |HQ114257.1| giới cho thấy bảng thống kê số nucleotid trình tự ITS loài D.findlayanum có giao động số nucleotid trình tự từ 688- 694 nucleotid Với kết so sánh trình tự mẫu D.findlayanum cho thấy trình hai mẫu D2 D18 có khoang 19 khác biệt. Khi so sánh hai mẫu D2 D18 với hai mẫu tham chiếu D.findlayanum mẫu D2 D18 có khoảng khác biệt trình tự so với hai mẫu D. findlayanum giới (Hình 3.19). Kết cho thấy mẫu lan Hoàng Thảo D2 D18 Việt Nam khác biệt so với mẫu D.findlayanum giới. 15 Hình 3.19. Kết phân tích cột thẳng hàng (alignments) trình tự vùng ITS mẫu giống D2, D18 hai mẫu giống D.findlayanum |KF143462.1|, |HQ114257.1| Tương tự mẫu lan Hoàng Thảo khác phân tích cột thẳng hàng (alignments) với mẫu lan Hoàng Thảo giới để xác định sai khác trình tự nhận dạng loài/dưới loài dựa trình tự vùng ITS. Tuy nhiên việc so sánh với sở liệu GenBank nhằm mục đích cho kết so sánh với nhóm loài tương đồng với trình tự tham chiếu. Kết BLAST kết luận xác loài. Với trường hợp BLAST có độ bao phủ tương đồng cao (99%) suy ngược lại tên loài. Bởi kết BLAST hiển thị trình tự tương đồng mà GenBank có. Do vậy, để xác định tên loài cần phải thực thêm nhiều phân tích khác so sánh với liệu hình thái xác định mối liên hệ qua phát sinh loài dựa trình tự vùng ITS. Chính vậy, định tiến hành xây dựng phát sinh chủng loài Dendrobium để xác định xác tên mẫu vật nghiên cứu này. 3.2.3. Kết phân định loài dựa phát sinh loài Qua hình 3.25 cho thấy, phát sinh loài chia 32 mẫu giống lan Hoàng Thảo làm XVII nhóm khác nhau: Nhóm thứ I: gồm trình tự mẫu giống Việt Nam D4 (D. anosmum), D5 (D. parishi.var alba) D6 (D.parishi) với trình tự gồm HM590378.1, HM054736.1, HM054735.1, AB5936930.1 thuộc loài D.parishi trình tự EU477499.1, JN388570.1 thuộc loài D.asosmum. Ở vị trí phân kỳ sớm, mẫu giống D6 nhận dạng hình thái D.parishi nằm gần mẫu giống EU47749.1 nhận dạng D.anosmum mẫu giống HM590378.1. HM054736.1, HM054735.1, AB5936930.1 thuộc loài D. parishi nằm với nhau. Điều khẳng định mẫu giống EU47749.1 phải D. parishi D. anosmum, từ ta suy mẫu giống D6 thuộc loài D.parishi. Ở vị trí phân kỳ trễ, mẫu giống D4, D5 mẫu giống JN388570.1 nằm chung nhóm. Xét hình thái, mẫu giống D4 nhận dạng D.anosmum mẫu giống D5 nhận dạng D. parishi.var alba. Tuy nhiên hai mẫu giống lại nằm chung 16 với mẫu giống JN388570.1 trùng khớp đến 99%. Do kết luận mẫu giống D5 D. anosmum.var alba D.parishii.arlba. Kết trùng khớp với nghiên cứu Trần Hoàng Dũng cs., 2012 nghiên cứu phân tích hai loài lan Việt nam Hoàng Thảo trầm rừng (D. parishi) Hoàng Thảo Phi điệp (D. anosmum)(Trần Hoàng Dũng cs., 2012). Nhóm thứ II bao gồm D9 D29 với trình tự thuộc loài D.primulinum KF14399.1, AB593641.1 AB59352.1. Hai mẫu D9 D29 nằm chung với mẫu AB59352.1 với số boostrap lên tới 99%. Đây hai mẫu Long tu được phân bố hai vùng phía Bắc Tây Nguyên. Về hình thái, chúng có đặc điểm tương đối giống nhận dạng thuộc loài D.primulinum. Do hai mẫu D9 D29 nhận dạng xác thuộc loài D.primulinum. Nhóm thứ III mẫu giống D23 nhận dạng hình thái D. aphylum nằm chung nhóm với trình tự HM590384.1, HQ114247.1, HQ114248.1 KF143430.1 trùng khớp với đến 100%. Vậy kết luận mẫu D23 thu thập xác lan Hoàng Thảo Hạc vĩ (D. aphylum). Nhóm thứ IV: bao gồm giống D11 D28 nằm chung nhóm với trình tự so sánh. Trong nhóm này, mẫu D11 (D.tortile) phân chia nằm chung với trình tự khác EU4775071(D.nobile), EU477507.1(D.fiedricksianum), ,KF143518.1(D.sp.Jin XHs.n.9) EU477511.1 (D.tortile) với số bootstrap lên tới 98%. Xét hình thái, D11 khác hoàn toàn hình thái thân, lá, hoa so với mẫu EU477507.1 (D. fiedricksianum), KF143518.1(D. sp.Jin XHs.n.9). Ngay từ kết so sánh Balst, mẫu nằm lộn xộn không tập trung. Chính mà nhận dạng mẫu giống D11 có D.tortile hay không. Tuy nhiên, mẫu giống D28 nằm chung với hai trình tự thuộc D.nobile KC205193.1 JN38579.1 với số bootstrap 85%. Do mẫu giống D28 nhận dạng xác D. nobile. Nhóm V: gồm mẫu giống D27, D2 D18 chia thành nhóm phụ: - Nhóm phụ thứ bao gồm mẫu D27 (D.aduncum) chia thành nhóm nằm chung với trình tự khác thuộc loài D.aduncum gồm trình tự JF713083.1, KF143428.1 JN388580.1 với số bootstrap nhóm 99%. Đặc điểm hình thái, mẫu D27 giống với mẫu loại thuộc loài D.aduncum nên khẳng định xác loài D.aduncum. Nhóm phụ thứ gồm mẫu D2 D18, hai mẫu Long tu (D. findlayamum) thu thập từ hai miền khác nhau. Xét hình thái chúng giống y hệt thân, lá, hoa khác chỗ Long tu Bắc (D2) môi hoa đốm. Khi so sánh trình tự chúng chúng có số bootstrap 100% so với trình tự mẫu KF143246.1, HQ114257.1 JN388589.1 thuộc loài D.findlayamum nên khẳng định hai mẫu D2 D18 thuộc loài D. findlayamum. 17 79 70 68 76 56 64 70 71 D. parishii voucher NCHU-D89331201-1012|HM590378.1| 64 D. parishii|AB593630.1| 90 D. parishii voucher SBB-0528 |HM054736.1| 79D. parishii voucher SBB-0527 HM054735.1| 82 D. anosmum |EU477499.1| 99 D. parishi - D6 D.parishi.var alba - D5 D. anosmum - D4 99 99 D. anosmum isolate D4 |JN388570.1| 100 D. primulinum voucher Jin X-H 10793 |KF143499.1| D. primulinum |AB593641.1| D. primulinum TBG 118293|AB593521.1| 97 87 99 D. primulinum -D9 90 D. primulinum - D29 D. aphyllum voucher NCHU-D89331201-1018 HM590384.1| D. aphyllum voucher PS2523MT01 |HQ114247.1| D. aphyllum voucher PS2523MT02 |HQ114248.1| 100 D.aphyllum -D23 D. aphyllum voucher Jin X-H 10798 |KF143430.1| D. tortile - D11 96 D. nobile |EU477507.1| 98 D. friedricksianum |EU477505.1| D. sp. Jin X-H s.n. |KF143518.1| 77 62 D. tortile |EU477511.1| D. nobile |KC205193.1| D. nobile - D28 85 59 D. nobile |JN388579.1| D. aduncum - D27 75 100 D. aduncum voucher SBB-0309 |JF713083.1| 99 D. aduncum voucher Jin X-H 9522 |KF143428.1| D. aduncum |JN388580.1| D. findlayanum -D2 75 D. findlayanum - D18 D. findlayanum voucher Jin X-H 11875|KF143462.1| 100 D. findlayanum voucher PS2531MT01 |HQ114257.1| D. findlayanum isolate D23 |JN388589.1| D. chysanthum - D7 D. chrysanthum |JN388584.1| D. chrysanthum |FJ384738.1| 77 D. chysanthum- D8 D. chrysanthum voucher Jin X-H 11430 |KF143443.1| D. chrysanthum voucher SBB-0617 |JF713093.1| 99 D. chrysanthum voucher SBB-0504 |JF713091.1| 80 D. brymerianum - D30 D. brymerianum voucher PS2510MT01|HQ114233.1| 100 D. brymerianum voucher Jin X-H10782 |KF143432.1| D. brymerianum |JN388581.1| D. brymerianum |EU477500.1| D. pulchellum voucher Jin X-H 11878 |KF143503.1| D. moschatum -D3 100 D. moschatum voucher Jin X-H 11886 |KF143492.1| D. daoense - D15 86 D. fimbriatum isolate D22 |JN388588.1| 100 D. fimbriatum - D1 D. fimbriatum voucher PS2507MT01 |HQ114229.1| D. fimbriatum voucher Jin X-H s.n. 16 (KF143461.1) D. chrysotoxum - D20 95 97 D. chrysotoxum - D21 D. chrysotoxum |EU477501.1| D. capillipes voucher NCHU-D89331201 |HM590379.1| 100 D. chrysotoxum voucher PS2501MT03 |HQ114223.1| 99 D. chrysotoxum -D16 74 D. chrysotoxum voucher PS2501MT01 |HQ114221.1| D. chrysotoxum isolate D19 |JN388585.1| D. hancockii voucher Jin X-H 13492 |KF143467.1| 88 D. hancockii isolate D25 |JN388591.1| D. hancockii voucher PS2533MT01 |HQ114259.1| 76 D. hancockii |AB593575.1| D. hancockii - D10 88 D. capillipes - D17 D. capillipes |AF362035.1| 100 D. capillipes voucher Jin X-H 10757 |KF143433.1| D. capillipes voucher PS2502MT01 |HQ114224.1| D. capillipes |JN388582.1| 91 D. amabile - D12 D. thyrsiflorum - D13 100 D. farmeri -D14 D. farmeri -D19 D. haveyanum -D26 100 D. thyrsiflorum |KC205200.1| D. thyrsiflorum voucher Jin X-H 10755 |KF143519.1| D. lindleyi - D24 96 D. lindleyi -D25 D. jenkinsii voucher Jin X-H 10709 |KF143478.1| 100 D. jenkinsii voucher PS2525MT01 |HQ114251.1| D. jenkinsii voucher Jin X-H s.n. |KF143479.1| 99 D. jenkinsii isolate D29 |JN388595.1| D. draconis Rchb.f - D31 75 D. draconis |HM054628.1| 100 D. draconis voucher SBB-0545 |JF713101.1| D. draconis |EU477503.1| 73 D. wattii - D22 99 D. wattii voucher Jin X-H 11817 |KF143525.1| 99 D. longicornu voucher Kurzweil H Lwin S 2647 |KF143484.1| 74 D. longicornu voucher Jin X-H 11663 |KF143485.1| D. christyanum -D32 90 D. christyanum voucher Jin X-H s.n. |KF143442.1| D. christyanum voucher Jin X-H 11045 |KF143441.1| 98 D. christyanum |GU339106.1| D. christyanum |EF629325.1| 0.02 Hình 3.25. Sơ đồ phát sinh loài dựa trình tự vùng ITS 18 Nhóm VI: gồm mẫu D7 D8, hai giống thuộc loài D.chrysanthum nằm chung với trình tự loài D.chrysanthum đối chứng. Trong hai mẫu này, D8 trùng khớp 100% với mẫu D.chrysanthum khác JN388584.1 FJ384738.1. Còn mẫu D8 nằm nhóm khoảng cách di truyền xa so với D7 mẫu lại. Tuy nhiên, trình ITS chúng thuộc loài D.chrysanthum. Vì kết luận hai mẫu D7 D8 thuộc loài D.chrysanthum. Nhóm thứ VII: gồm trình tự mẫu D30 (Hoàng Thảo Môi tơ D.brymerianum) nằm chung với trình tự mẫu gồm mẫu thuộc loài D.brymerianum: KF143432.1, HQ114233.1, JN388581.1 EU477500.1 với số bootstrap 80%. Mẫu D30 Việt Nam nằm chung nhóm với mẫu lại khoảng cách di truyền lớn với mẫu giới. Nhóm thứ VIII gồm trình tự mẫu D3 (Hoàng Thảo Thái Bình D.moschatum) xác định xác thuộc loài D. moschatum (KF143492.1) với số bootstrap 100%. Tuy nhiên nhóm có mẫu D.puchellum (KF1435031.1) với tỷ lệ giống D.moschatum (KF143492.1). Xét hình thái chúng giống hệt thân, lá, hoa. Tuy nhiên mẫu (KF1435031.1) lại xác định D.puchellum. Điều giải thích có sai xót xác định tên latinh mẫu (KF1435031.1). Xét hình thái, mẫu D3 nhận dạng D.moschatum, qua khẳng định mẫu D3 D.moschatum sau giải trình tự vùng ITS. Nhóm IX gồm trình tự mẫu D1 (HT Long nhãn Điện Biên) D15 (Hoàng Thảo Tam Đảo) trình tự mẫu giới thuộc loài (D. fimbriatum). Trong nhóm này, mẫu D1 (D. fimbriatum) D15 (D.daoense) có số bootstrap từ 86100 % với mẫu thuộc loài D. fimbriatum mẫu HQ114229.1, JN388588.1, KF143461.1. Tuy nhiên mẫu D15 có số bootstrap nhận dạng qua hình thái dịnh danh tên lại D.daoense. Chính mà khẳng định mẫu D15 qua trình thu thập mẫu bị lẫn tạp, mẫu D15 phải loài D. fimbriatum D.daoense. Nhóm X gồm trình tự mẫu giống Việt Nam D16, D20, D21 mẫu trình tự giới mẫu thuộc loài Dendrobum chynsotoxum mẫu HQ114221.1, JN388585.1, HQ114223.1, EU477501.1 mẫu thuộc loài D.cappillies (HM590379.1). Ở mẫu giới khẳng định mẫu HM590379.1 giải trình tự sai mẫu loài D.cappillies bắt buộc phải nằm nhóm thứ XII nằm nhóm với trình tự thuộc loài D. chynsotoxum. Các mẫu D16, D20 D21 tách thành nhóm riêng biệt gồm D16 (Hoàng Thảo Hoàng Lạp Tây Bắc) thành nhóm nằm chung với trình tự D20 (Hoàng Thảo Tiểu Hoàng Lạp), D21 (Hoàng Thảo Tiểu Hoàng Lạp) nằm chung mộ nhóm với mẫu EU477501.1 với số bootstrap cao (98%). Xét hình thái, mẫu HT Hoàng Lạp có thân hình suốt, hình mác màu sắc hoa giống nhau, chúng khác kích cỡ hoa chút phân bố vùng khác nhau. Qua nhận thấy rằng, mẫu D16, D20 D21 có phân tách mặt di 19 truyền. Tuy nhiên chúng loài D.chynsotoxum. Nhóm XI: gồm trình tự mẫu giống D10 (D. hancokii) với mẫu trình tự thuộc loài D. hancokii tạo thành nhóm với số bootstrap 76-88%. Tuy nhiên mẫu D10 tách hẳn nằm riêng rẽ có khoảng cách di truyền xa với mẫu D. hancokii giới. Nhóm XII gồm mẫu D17 (D.capillipes) với mẫu trình tự thuộc loài D.capillipes: AF362035.1, KF143433.1, JN388582.1 HQ114224.1 chia thành nhánh gồm mẫu D17 với AF362035.1 với số bootstrap (88%) mẫu lại tạo thành nhánh với nhau. Chỉ số bootstrap nhánh 100%. Về hình thái, mẫu D17 (Hoàng Thảo Kim Điệp) nhận dạng D.capillipes, qua khẳng định mẫu D17 D.capillipes sau giải trình tự vùng ITS. Nhóm XIII bao gồm trình tự bao gồm mẫu giống thu thập D12 (D.amabile), D13 (D.thyrsiflorum), D14 (D.farmeri), D19 (D.farmeri), D26 (D.haveyanum) trình tự mẫu giới KF143519.1 KC205200.1 thuộc loài D.thyrsiflorum tạo thành nhóm chia thành nhánh bao gồm: mẫu Việt Nam mẫu KC205200.1 vào nhánh với số bootstrap 100% mẫu KF143519.1 đứng riêng biệt. Trong mẫu Việt Nam, hai mẫu D12 D13 tách nằm chung nhóm với số bootstrap 91% D14, D19 D26 nằm chung nhánh với mẫu KC205200.1 với số bootstrap 100%. Xét hình thái, mẫu lan Hoàng Thảo Kiều D12, D13, D14, D19 Hoàng Thảo Thủy Tiên mỡ gà (D26) giống hình thái thân, lá, chúng khác màu sắc hoa vùng phân bố. Tuy nhiên nhìn vào phát sinh loài cho thấy, mẫu thu thập có số bootstrap cao từ 96100% nhận dạng hình thái tên la tinh khác nhau. Vậy kết luận rằng, mẫu thu thập chưa có độ xác nhận dạng hình thái chúng có quan hệ di truyền cực gần nên sử dụng ITS chưa đủ xác định xác loài chúng. Chỉ xác định D13 (Hoàng Thảo Kiều vàng) nhận dạng loài D.thyrsiflorum. Nhóm thứ XIV bao gồm trình tự mẫu giống D24 D25 (đều thuộc loài D.lindleyi) mẫu trình tự thu thập KF143479.1, JN388595.1, KF143478.1 HQ114251.1 với số bootstrap cao từ 94-100% mẫu Trung Quốc KF143479.1, KF143478.1 mẫu nước khác thuộc loài thuộc loài D.jenkinsii. Mẫu D24 D25 nhận dạng tên Hoàng Thảo vảy rồng nhỏ HT vảy rồng trung. Xét hình thái, mẫu dễ nhận nhầm với Hoàng Thảo Vảy cá Hoàng Thảo Vảy rắn (D.jenkinsii). Lan Hoàng Thảo Vảy rồng thường bị nhầm lẫn với Vảy rắn hay Vảy cá, so sánh thân cành hoa, thân Hoàng Thảo vảy rồng lớn Vảy Rắn, hoa Vảy rồng thành cuống dài - 15 Vảy Rắn cành hơn. Chính vậy, qua kết giải trình tự vùng ITS so sánh phát sinh loài cho thấy, hai mẫu giống Hoàng Thảo Vảy rồng nhỏ (D24) Hoàng Thảo Vảy rồng trung (D25) loài HT Vảy rắn hay gọi Hoàng Thảo Vảy cá (D.jenkinsii) Hoàng 20 Thảo Vảy rồng (D.lindleyi). Nhóm thứ XV bao gồm trình tự Hoàng Thảo Nhất điểm hồng (D. draconis Rchb.f - D31) trình tự mẫu trình tự HM054628.1, EU477503.1, JF713101.1 với số boostrap 100%. Chứng tỏ mẫu D31 thu thập xác thuộc loài D.draconis. Nhóm thứ XVI bao gồm trình tự lan Hoàng Thảo Bạch hạc langbiang (D22D.wattii) trình tự khác KF143525.1, KF143481.1, KF143485.1. Trong nhóm này, trình tự mẫu D22 nằm riêng biệt với D.wattii voucher Jin X-H 11817 (KF143525.1) với số bootstrap 73%. Tuy nhiên nhóm D. wattii lại có quan hệ di truyền gần với nhóm D.longicomu (KF143481.1, KF143485.1) với số bootstrap từ 74-99%. Xét mặt hình thái, D.wattii D.longicomu có hình thái tương đối giống nên dễ nhầm lẫn phân biệt. Vì vậy, mẫu D22 (Hoàng Thảo Bạch hạc langbiang -D.wattii ) khẳng định xác loài D.wattii. Nhóm thứ XVII gồm trình tự mẫu Hoàng Thảo Đại bạch hạc (D. christyanum-D32) với trình tự F143442.1, KF143441, GU339106.1 EF629325.1 thuộc loài D.christyanum với số bootstrap nhóm cao lên đến 98%. Điều cho thấy mẫu D32 thu thập xác thuộc loài D. christyanum. Những thông tin qua giải trình tự vùng ITS cho thấy, đa số mẫu giống thu thập nghiên cứu nhận dạng tương thích với nhận dạng hình thái. Trong 32 mẫu giống có 23 mẫu giống nhận dạng tương thức hình thái với phân tử mẫu giống D1, D2, D3, D4, D5, D7, D8, D9, D10, D13, D16, D17, D18, D20, D21, D22, D23, D27, D28, D29, D30, D31 D32 (Bảng 3.14). Tuy nhiên trình nghiên cứu, mẫu giống nhận dạng dạng dựa hình thái, sau giải trình tự vùng ITS có so sánh mẫu giống giải trình tự với mẫu giống công bố ngân hàng GenBank có 9/32 hình thái chưa thích ứng phân tử mẫu giống D6, D11, D12, D14, D15, D19, D24, D25 D26. Trong số mẫu giống có mẫu giống đính lại tên la tinh mẫu giống D6 (Hoàng Thảo Trầm trắng); D15 (Hoàng Thảo Tam đảo); D24 (Hoàng Thảo vảy rồng nhỏ) D25 (Hoàng Thảo Vảy rồng trung). mẫu giống chưa nhận dạng mẫu giống D11 (Hoàng Thảo xoắn), D12 (Hoàng Thảo Kiều tím), D14 (Hoàng Thảo Kiều trắng), D19 (Hoàng Thảo Kiều trắng Đồng nai) D26 (Hoàng Thảo Thủy tiên mỡ gà). Giải thích cho tượng có nhiều nguyên nhân khác như: Các mẫu giống thu thập có nhầm lẫn tên la tinh khác nhau; Quá trình bảo quản mẫu giống có nhầm lẫn liệu ngân hàng gen Bank chưa có đủ thông tin với mẫu giống tên latinh vùng ITS không giống nhau. 21 Bảng 3.14. Các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo đƣợc nhận dạng trình tự vùng ITS Ký hiệu D1 D2 Nhận dạng dựa hình thái Tên tiếng Việt HT Long nhãn Lai Châu HT chuỗi ngọc Điện Biên Nhận dạng theo trình tự ITS Ký hiệu D. fimbriatum D. fimbriatum D17 D. findlayanum D. findlayanum D18 Tên tiếng Việt HT Kim Điệp Hoàng Thảo Chuỗi Ngọc Kiều trắng Đồng Nai HT Tiểu hoàng lạp HT Đại hoàng lạp HT bạch hạc langbiang HT Hạc vĩ HT Vảy rồng nhỏ HT Vảy rồng trung Thủy tiên mỡ gà HT Vani Nhận dạng dựa hình thái Nhận dạng theo trình tự ITS D. capillipes D. capillipes D. findlayanum D. findlayanum D. farmeri Chưa xác định D. chrysotoxum D. chrysotoxum D. chrysotoxum D. chrysotoxum D. wattii D. wattii D. aphylum D. aphylum D. lindleyi D. jenkinsii D. lindleyi D. jenkinsii D. haveyanum Chưa xác định D. aduncum D. aduncum D. nobile D. nobile D. primulinum D.brymerianum D. primulinum D.brymerianum D3 HT Thái Bình D. moschatum D. moschatum D19 D4 D5 Phi Điệp tím HT Trầm tím D. anosmum D.parishii D20 D21 D6 HT trầm trắng D.anosmum.var alba D22 D7 HT Ngọc Vạn Vàng D. anosmum D.parishii D.parishi .var alba D. chrysanthum D. chrysanthum D23 D8 HT Phi điệp vàng D. chrysanthum D. chrysanthum D24 D9 HT Long tu Bắc D. primulinum D. primulinum D25 D10 HT Trúc D. hancockii D. hancockii D26 D11 HT Xoắn D. tortile Chưa xác định D27 D12 HT D. amabile Chưa xác định D28 D13 D14 HT Kiều vàng HT Kiều trắng D. thyrsiflorum D. farmeri D. thyrsiflorum Chưa xác định D29 D30 Hoàng Thảo Đùi gà Long tu đá HT Môi tơ D15 HT Tam Đảo D. daoense D. fimbriatum D31 Nhất Điểm Hồng D. draconis Rchb.f D. draconis Rchb.f D16 HT Hoàng lạp Tây Bắc D. chrysotoxum D. chrysotoxum D32 HT Đại bạch hạc D. christyanum D. christyanum Ghi chú: HT- Hoàng Thảo 22 Tóm lại, số mẫu giống thu thập hạn chế trình tự vùng ITS lần cho thấy chúng phát huy sức mạnh mã vạch ADN phổ quát việc phân định loài mức loài cho nhóm thực vật có hoa. Qua kết cho thấy, đa số mẫu giống nhận dạng xác tên loài chúng. Vài mẫu giống vật có khác biệt tên gọi theo hình thái theo trình tự vùng ITS. Qua phép phân tích cho thấy vị trí mẫu giống vật phát sinh loài dựa giải trình tự vùng ITS giúp khẳng định xác tên khoa học mẫu giống vật bị nhầm lẫn. Thành công kết nghiên cứu tạo tiền đề quan trọng cho mở rộng cỡ mẫu giống (số mẫu giống loài), số loài nghiên cứu (nhiều loài Dendrobium, nhiều loài họ Orchideacea), chọn lựa thêm thị khác (gen 16 rRNA, gen matK, .) để hướng đến xây dựng mã vạch ADN cho loài lan có giá trị Việt Nam. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN: 1. Các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo đa dạng thân, lá, hoa. Dựa kết phân tích đa dạng di truyền 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo thị hình thái cho thấy hệ số tương đồng di truyền dao động từ 37-100% chúng chia làm nhóm khác nhau. Một số mẫu có hệ số tương đồng di truyền cao 100% mẫu giống D5 (Hoàng Thảo Trầm tím) D6 (Hoàng Thảo Trầm trắng); D2 (Hoàng Thảo chuỗi ngọc Điện Biên D18 (Hoàng Thảo chuỗi ngọc). 2. Kết phân tích đa dạng di truyền 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo thị phân tử RAPD cho thấy hệ số tương đồng di truyền giống lan Hoàng Thảo nghiên cứu dao động khoảng từ 23 - 100%. Một số mẫu giống hoa như: D5 (Hoàng Thảo Trầm tím) D6 (Hoàng Thảo Trầm trắng); D24 (Hoàng Thảo Vảy rồng nhỏ) D25 (HT Vảy rồng trung) có hệ số tương đồng di truyền cao 100%. 3. Qua so sánh kết đánh giá đa dạng di truyền đặc điểm hình thái thị phân tử RAPD cho thấy 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo chia làm nhóm khác nhau. Các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo có quan hệ gần mặt di truyền xếp chung vào nhóm. Trong số mẫu giống có mẫu giống có hệ số di truyền như mẫu giống D5 (Hoàng Thảo Trầm tím) D6 (Hoàng Thảo Trầm trắng); D24 (Hoàng Thảo Vảy rồng nhỏ) D25 (Hoàng Thảo vảy rồng trung). 4. Dựa thị phân tử RAPD, số cặp mồi OPN7, OPN20, OPN16, OPN11 nhận dạng số mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo như: mẫu giống D9 (Hoàng Thảo Long tu Bắc với mồi OPN16, OPN20; Hoàng Thảo Chuỗi ngọc Điện Biên (D2) mồi OPN7, OPN20. 5. Dựa kết giải trình tự vùng ITS, qua so sánh trình tự mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo Việt Nam giới, xác định xác 23/32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo. Trong mẫu giống lại mẫu giống hiệu 23 đính lại tên latinh mẫu giống D6 (Hoàng Thảo trầm trắng), D15 (Hoàng Thảo Tam Đảo), D24 (Hoàng Thảo Vảy rồng nhỏ), D25 (Hoàng Thảo Vảy rồng trung); mẫu giống chưa xác định xác mẫu giống D11 (Hoàng Thảo Xoắn), D12 (Hoàng Thảo Kiều tím), D14 (Hoàng Thảo Kiều trắng), D19 (Hoàng Thảo Kiều trắng Đồng Nai), D26 (Hoàng Thảo Thủy tiên mỡ gà). ĐỀ NGHỊ: Cần tiếp tục điều tra, thu thập thêm mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo. Bên cạnh cần chọn lựa thêm thị khác (gen 16 rRNA, gen matK, vùng rbcL, vùng trnH-psbA ) để nhận dạng loài có quan hệ gần chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium). 24 DANH MỤC CÁC BÀI BÁO, CÔNG TRÌNH 1. Trịnh Thị Hương, Vũ Lan Phương, Trần Duy Dƣơng (2011), “Đánh giá tập đoàn chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium sp.) địa phía Bắc Việt Nam”, Tạp chí Nông nghiệp phát triển Nông thôn, số 23, trang 23-29. 2. Trần Duy Dƣơng, Khuất Hữu Trung, Lã Tuấn Nghĩa (2012), “Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn lan Hoàng thảo (Dendrobium sp.) địa phía Nam Việt Nam”, Tạp chí Khoa học phát triển Nông thôn Việt Nam, số 1, tr. 34-39. 3. Trần Hoàng Dũng, Trần Lệ Trúc Hà, Vũ Thị Huyền Trang, Đỗ Thành Trí, Trần Duy Dƣơng (2012), “Ứng Dụng Công nghệ AND để phân loại nhận diện lan Hoàng Thảo Trầm rừng (Dendrobium parishi) Phi điệp (Dendrobium anosmum) Việt Nam”, Tạp chí Nông nghiệp phát triển Nông thôn, số 18, tr. 3-9. 4. Trần Duy Dƣơng, Khuất Hữu Trung, Trần Duy Vương, Lã Tuấn Nghĩa, Nguyễn Thị Thanh Thủy(2013), “Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn hoa lan Hoàng Thảo (Dendrobium.sw) địa thị phân tử PCRRAPD”, Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc, trang 756-760. 25 [...]... D6 (Hoàng Thảo Trầm trắng); D2 (Hoàng Thảo chuỗi ngọc Điện Biên và D18 (Hoàng Thảo chuỗi ngọc) 2 Kết quả phân tích đa dạng di truyền của 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo bằng chỉ thị phân tử RAPD cho thấy hệ số tương đồng di truyền của các giống lan Hoàng Thảo nghiên cứu dao động trong khoảng từ 23 - 100% Một số mẫu giống hoa như: D5 (Hoàng Thảo Trầm tím) và D6 (Hoàng Thảo Trầm trắng); D24 (Hoàng Thảo. .. Việt Nam KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN: 1 Các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo rất đa dạng về thân, lá, và hoa Dựa trên kết quả phân tích đa dạng di truyền của 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo bằng chỉ thị hình thái cho thấy hệ số tương đồng di truyền dao động từ 37-100% và chúng chia làm 5 nhóm khác nhau Một số mẫu có hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 100% như các mẫu giống D5 (Hoàng Thảo Trầm tím) và. .. của các mẫu lan Hoàng Thảo của Việt nam và thế giới dựa trên sự phân tích sắp cột thẳng hàng Dưới đây là một số kết quả so sánh trình tự vùng ITS của một số mẫu hoa lan Hoàng Thảo của Việt Nam và thế giới * Kết quả so sánh trình tự mẫu D2 (Hoàng Thảo Chuỗi Ngọc Điện Biên) và D18 (Hoàng Thảo Chuỗi Ngọc) Qua kết quả phân tích sắp cột thẳng hàng (alignments) trình tự ITS của mẫu D2, D18 của Việt Nam và. .. D24 (Hoàng Thảo vảy rồng lá nhỏ) và D25 (Hoàng Thảo vảy rồng lá trung) đồng d 100% 13 3.1.3 Kết hợp chỉ thị hình thái và chỉ thị RAPD trong phân tích đa dạng di truyền các giống hoa lan Hoàng Thảo 32 mẫu Qua kết quả so sánh giữa sơ đồ hình cây bằng chỉ thị hình thái và sơ đồ hình cây bằng chỉ thị RAPD cho thấy 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo đều được chia làm 5 nhóm khác nhau Các mẫu giống hoa lan Hoàng. .. giống hoa lan Hoàng Thảo của Việt Nam và thế giới, đã xác định chính xác được 23/32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo Trong 9 mẫu giống còn lại thì 4 mẫu giống được hiệu 23 đính lại tên latinh là các mẫu giống D6 (Hoàng Thảo trầm trắng), D15 (Hoàng Thảo Tam Đảo), D24 (Hoàng Thảo Vảy rồng lá nhỏ), và D25 (Hoàng Thảo Vảy rồng lá trung); 5 mẫu giống chưa xác định chính xác được là các mẫu giống D11 (Hoàng Thảo. .. nucleotide Tỉ lệ % trung bình của T(U)= 22,4%; C = 24,3%; A = 23,7 %; và G =29,6% Kết quả này cũng khá cũng khá phù hợp với nhận định của Xu và cs., 2005; Sigh và cs., 2012; Liu và cs., 2014 3.3.2.2 Kết quả so sánh trình tự đoạn ITS một số mẫu hoa lan Hoàng Thảo bản địa Việt Nam và thế giới Để so sánh sự khác biệt các trình tự của các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo của Việt nam và thế giới, chúng tôi tiến... Thị Hương, Vũ Lan Phương, Trần Duy Dƣơng (2011), “Đánh giá tập đoàn chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium sp.) bản địa ở phía Bắc Việt Nam , Tạp chí Nông nghiệp và phát triển Nông thôn, số 23, trang 23-29 2 Trần Duy Dƣơng, Khuất Hữu Trung, Lã Tuấn Nghĩa (2012), “Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn lan Hoàng thảo (Dendrobium sp.) bản địa ở phía Nam Việt Nam , Tạp chí Khoa học và phát triển Nông thôn Việt Nam, ... nhỏ) và D25 (HT Vảy rồng lá trung) có hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 100% 3 Qua so sánh kết quả đánh giá đa dạng di truyền bằng đặc điểm hình thái và chỉ thị phân tử RAPD cho thấy 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo đều được chia làm 5 nhóm khác nhau Các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo có quan hệ gần nhau về mặt di truyền đều xếp chung vào một nhóm Trong số các mẫu giống đó có các mẫu giống có hệ số di. .. mẫu giống có hệ số di truyền như nhau như các mẫu giống D5 (Hoàng Thảo Trầm tím) và D6 (Hoàng Thảo Trầm trắng); D24 (Hoàng Thảo Vảy rồng lá nhỏ) và D25 (Hoàng Thảo vảy rồng lá trung) 4 Dựa trên chỉ thị phân tử RAPD, một số cặp mồi như OPN7, OPN20, OPN16, OPN11 nhận dạng được một số mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo như: mẫu giống D9 (Hoàng Thảo Long tu Bắc với mồi OPN16, OPN20; Hoàng Thảo Chuỗi ngọc Điện... giống hoa lan Hoàng Thảo có quan hệ gần nhau về mặt di truyền đều xếp chung vào một nhóm Trong số các mẫu giống đó có các mẫu giống có hệ số di truyền như nhau như các mẫu giống D5 (Hoàng Thảo Trầm tím) và D6 (Hoàng Thảo Trầm trắng); D24 (Hoàng Thảo Vảy rồng lá nhỏ) và D25 (Hoàng Thảo vảy rồng lá trung) Bên cạnh đó các mẫu giống khác như D2 (Hoàng Thảo Chuỗi Ngọc Điện Biên) và D18 (Hoàng Thảo Chuỗi Ngọc); . giá đa dạng di truyền nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo bản địa của Việt Nam 2.2.1.1. Đánh giá đa dạng di truyền các nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo ở mức hình thái 2.2.1.2. Đánh giá đa dạng di truyền. VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN DUY DƢƠNG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ NHẬN DẠNG MỘT SỐ NGUỒN GEN HOA LAN HOÀNG THẢO. giống/loài hoa lan Hoàng Thảo bản địa phục vụ cho công tác phân loại, chọn và lai tạo giống mới. - Sử dụng chỉ thị ITS để để nhận dạng một số nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo bản địa quý của Việt Nam