BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI TRẦN VIỆT DŨNG KIÊN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI, SALMONELLA CHẾ TẠO VACXIN ðA GIÁ PHÒNG BỆNH TIÊU CHẢY, PHÙ ðẦU VÀ BẠI HUYẾT Ở LỢN TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI, NĂM 2013 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… i BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI TRẦN VIỆT DŨNG KIÊN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI, SALMONELLA CHẾ TẠO VACXIN ðA GIÁ PH ÒNG BỆNH TIÊU CHẢY, PHÙ ðẦU VÀ BẠI HUYẾT Ở LỢN TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NGÀNH THÚ Y Mà SỐ 60.64.01.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. CÙ HỮU PHÚ 2.PGS.TS. NGUYỄN HỮU NAM HÀ NỘI, NĂM 2013 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, Ngày 31 tháng 9 năm 2013 Tác giả Trần Việt Dũng Kiên Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành luận văn này, cùng với sự nỗ lực cố gắng của bản thân, tôi xin ñược ñặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy: PGS.TS. Cù Hữu Phú, người ñã trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin ñược chân thành cảm ơn tới thầy: TS. Nguyễn Hữu Nam, các thầy cô trong bộ môn Bệnh lý cùng toàn thể các thầy cô giáo Khoa Thú y, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tận tình giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin cảm ơn Ban lãnh ñạo Viện Thú y, các anh, chị, em Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y, các bạn ñồng nghiệp ñặc biệt là gia ñình ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi nhất giúp ñỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này. Hà Nội, ngày 31 tháng 9 năm 2013 Trần Việt Dũng Kiên Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii MỤC LỤC MỞ ðẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 I. VI KHUẨN E. COLI VÀ BỆNH PHÙ ðẦU TIÊU CHẢY Ở LỢN DO E. COLI 3 II. VI KHUẨN SALMONELLA VÀ BỆNH TIÊU CHẢY, BẠI HUYẾT DO SALMONELLA Ở LỢN 16 III. VACXIN PHÒNG PHÙ ðẦU, TIÊU CHẢY, BẠI HUYẾT TRÊN LỢN 28 CHƯƠNG 2. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 I. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: 31 II. ðỐI TƯỢNG ðỊA ðIỂM : 31 III. NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 31 IV. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Kết quả thu thập các chủng vi khuẩn E. coli, Salmonella phân lập ñược dùng cho nghiên cứu38 3.2 Kết quả giám ñịnh, xác ñịnh serotype và một số yếu tố gây bệnh của các chủng E. coli nghiên cứu 38 3.3. Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính nuôi cấy và sinh hóa của các chủng Salmonella phân lập. 44 3.4 Kết quả kiểm tra ñộc lực của các chủng vi khuẩn E. coli và Salmonella nghiên cứu trên chuột nhắt trắng 51 3.5 Kết quả gây bệnh thực nghiệm một số chủng vi khuẩn E. coli và Salmonella nghiên cứu trên lợn 55 3.6. Kết quả chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh phù ñầu, tiêu chảy và bại huyết cho lợn 63 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 66 I. Kết luận 66 II. ðề nghị 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các chủng E. coli gây bệnh trên lợn mang các yếu tố gây bệnh Bảng 2.1 Các cặp primer ñể xác ñịnh các yếu tố ñộc lực và bám dính của vi khuẩn E. coli Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi và kích cỡ sản phẩm dùng ñể xác ñịnh một số yếu tố gây bệnh của các chủng Salmonella phân lập ñược Bảng 3.1: Kết quả lựa chọn các chủng vi khuẩn dùng cho nghiên cứu Bảng 3.2: Kết quả kiểm tra một số ñặc tính nuôi cấy của các chủng vi khuẩn E. coli Bảng 3.3: Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính sinh hoá của vi khuẩn E. coli Bảng 3.4: Kết quả xác ñịnh serotyp kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập ñược Bảng 3.5: Tỷ lệ các chủng vi khuẩn E. coli mang các gen quy ñịnh sinh tổng hợp các yếu tố gây bệnh Bảng 3.6: Kết quả kiểm tra một số ñặc tính nuôi cấy của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược Bảng 3.7: Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược Bảng 3.8: Kết quả xác ñịnh serotyp của cácchủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược Bảng 3.9: Kết quả kiểm tra một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược Bảng 3.10: Kết quả kiểm tra ñộc lực một số chủng E. coli trên chuột nhắt trắng Bảng 3.11: Kết quả kiểm tra ñộc lực các chủng Salmonella phân lập ñược Bảng 3.12 Các chủng vi khuẩn E. coli chọn gây bệnh Bảng 3.13: Kết quả gây bệnh thực nghiệm E. coli trên lợn Bảng 3.14: Các chủng vi khuẩn Salmonella chọn gây bệnh Bảng 3.15: Kết quả gây bệnh thực nghiệm Salmonella trên lợn 35 ngày tuổi Bảng 3.16: Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu các lô vacxin Bảng 3.17: Kết quả thử hiệu lực của vacxin trên chuột nhắt trắng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Quy trình phân lập vi khuẩn ñường ruột Hình 2.2. Quy trình sản xuất vacxin vô hoạt bổ trợ keo phèn Hình 3.1. Tỷ lệ kháng nguyên O của các chủng E. coli phân lập ñược Hình 3.2. Sản phẩm PCR xác ñịnh yếu tố gây bệnh của E. coli Hình 3.3. Kết quả của phản ứng PCR xác ñịnh yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Salmonella Hình 3.4 Gây bệnh thực nghiệm cho lợn Hình 3.5 Lợn Gây bệnh với E. coli dung huyết: viêm giác mạc mắt, phù ñầu Hình 3.6 Lợn Gây bệnh với E. coli dung huyết: viêm giác mạc mắt, phù ñầu Hình 3.7 Lợn Gây bệnh với Salmonella: lách sưng, nhồi huyết Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ADP Adenosine DiPhosphate ATP Adenosine TriPhosphate BHI Brain Heart Infusion BPW Buffered Pepton Water BG Brillian Green CHO Chinese Hamster Ovary Cell CIRAD Centre de Cooperation Internationale en Recherche Agronomique pour le Developpement DHL Deoxycholate Hydrogen sulfide Lactose DNA DeoxyriboNucleic Acid DPF Delayer Permebility Factor EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid ETEC EnteroToxigenic E. coli GDP Guanin DiPhosphate GTP Guanin TriPhosphate InvA Invasion A KL Khuẩn lạc LIM Lysine Indole Motility LPS LipoPolySaccharide LT Heat- Labile Toxin mARN Messenger Acide RiboNucleotide RPF Rapid Permebility Factor ST Heat- stabile Toxin Stn Salmonella toxin TSI Triple- Sugar- Iron PCR Polymerase Chain Reaction RV Rappaports Vassiliadis Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 1 MỞ ðẦU Trong những năm gần ñây, cùng với sự phát triển của nền kinh tế, ngành chăn nuôi nói chung và chăn nuôi lợn nói riêng của nước ta ñã có những bước phát triển mạnh mẽ, trở thành ngành sản xuất quan trọng, chiếm tỷ trọng ñáng kể trong xuất khẩu các sản phẩm chăn nuôi và góp phần xóa ñói giảm nghèo. Theo số liệu tổng hợp của Tổng Cục Thống kê thì tính sơ bộ ñến năm 2011, cả nước có trên 27 triệu ñầu lợn. Còn theo ñịnh hướng ñược Thủ tướng Chính phủ phê duyệt trong quyết ñịnh số 10/2008/Qð-TTg ngày 16 tháng 01 năm 2008 về chiến lược phát triển chăn nuôi ñến năm 2020, thì ñến năm 2020 mục tiêu là phát triển nhanh quy mô ñàn lợn ngoại theo hướng trang trại, duy trì quy mô nhất ñịnh ñối với chăn nuôi lợn lai, lợn ñặc sản phù hợp với ñiều kiện chăn nuôi của nông hộ và của một số vùng. Tăng tổng ñàn lợn bình quân 2% năm, ñạt 35 triệu con trong ñó ñàn lợn ngoại nuôi trang trại công nghiệp chiếm 37%. Tuy nhiên, ngành chăn nuôi lợn ở nước ta luôn phải ñối mặt với nhiều khó khăn như về chất lượng con giống, thức ăn, giá cả thị trường,… ñặc biệt là bệnh dịch vẫn thường xuyên xảy ra trên ñàn lợn gây thiệt hại lớn về kinh tế. Một số bệnh thường xuyên xảy ra không những ảnh hưởng ñến mục tiêu phát triển chăn nuôi mà còn ñe dọa ảnh hưởng ñến sức khỏe của con người. Bệnh phù ñầu do vi khuẩn E. coli, bệnh do vi khuẩn Salmonella vẫn gây tổn thất nặng nề cho ngành chăn nuôi lợn trong toàn quốc. Bệnh do Salmonella gây ra thường ở dạng nhiễm trùng máu cấp tính hoặc viêm ruột non kết. Tuy nhiên hai thể bệnh này thường ít khi xảy ra ñồng thời với nhau. Salmonella cholerasuis thường gây nhiểm trùng máu cấp tính, trong khi ñó Salmonella typhimurium thường gây ra viêm ruột kết. Vi khuẩn Salmonella và E. coli gây tiêu chảy cho lợn ở các lứa tuổi, ñặc biệt ở lợn trước và sau cai sữa trong cả chăn nuôi trang trại quy mô lớn hay chăn nuôi nông hộ với quy mô nhỏ. ðể hạn chế thấp nhất thiệt hại cho người chăn nuôi, thuận lợi cho việc sử dụng biện pháp phòng bệnh bằng vacxin và ñảm bảo an toàn thực phẩm không lây nhiễm vi khuẩn gây ngộ ñộc cho người tiêu dùng, việc chế tạo vacxin ña giá, tiêm một mũi phòng ba bệnh: phù ñầu, tiêu chảy, bại huyết do vi khuẩn E. coli và Salmonella sp. gây ra là ñòi hỏi cấp thiết của thực tế nước ta hiện nay. Vì vậy ñể có cở sở khoa học cho Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 2 việc nghiên cứu, xây dựng biện pháp phòng và trị bệnh bằng vacxin, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Chọn chủng vi khuẩn Escherichia coli, Salmonella chế tạo vacxin ña giá phòng bệnh tiêu chảy, phù ñầu và bại huyết ở lợn tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Xác ñịnh yếu tố ñộc lực, yếu tố kháng nguyên các chủng vi khuẩn và E. coli, Salmonella gây bệnh tiêu chảy, phù ñầu và bại huyết ở lợn nuôi tại một số tỉnh phía Bắc. - Chọn chủng vi khuẩn E. coli, Salmonella chế tạo thử nghiệm vacxin ña giá phòng bệnh cho lợn. Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ðỀ TÀI Kết quả nghiên cứu bước ñầu sẽ là cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm chọn ra ñược một bộ giống vi khuẩn phù hợp, có kháng nguyên tính cao, ổn ñịnh ñể chế tạo vacxin vô hoạt ña giá phòng bệnh phù ñầu, tiêu chảy và bại huyết do E. coli và Salmonella gây ra cho lợn có hiệu lực phòng bệnh cao, giá thành vừa phải, phù hợp với ñiều kiện thực tế ở nước ta. [...]... do Salmonella gây ra l n v i các b nh do E coli và b nh d ch t l n có ý nghĩa r t quan tr ng trong th c ti n III VACXIN PHÒNG PHÙ ð U, TIÊU CH Y, B I HUY T TRÊN L N ði u ki n c n c a m t vacxin: m t vacxin ph i có ñ 3 ñi u ki n chính là an toàn, vô trùng và có hi u l c Hi n nay ñã có nhi u lo i vacxin ñ phòng b nh Phó thương hàn như vacxin như c ñ c ch ng TS – 177 và vacxin như c ñ c có b tr như vacxin. .. s khoa h c Nông nghi p ……………………… 15 Vacxin tiêm cho lơn con vào lúc 3 tu n tu i v i li u 1ml/con, l n có mi n d ch sau 14 ngày, b o h 90% l n con không m c b nh phù ñ u II VI KHU N SALMONELLA VÀ B NH TIÊU CH Y, B I HUY T DO SALMONELLA L N 1 Vi khu n Salmonella Tr c khu n Salmonella thu c b Eubacteriales, h Enterobacteriaceae Gi ng Salmonella g m 2 loài: S enterica và S bongori ñã ñư c phân chia thành... ñ ch ng tiêu ch y trư c và sau cai s a Hi n nay trên th trư ng Vi t Nam, ngoài vacxin trong nư c s n xu t ñang lưu hành các lo i vacxin do nư c ngoài s n xu t như: Neocolipor c a Nissan Chemical Indutries, vacxin Litter Guard LT-C c a Embrex INC s n xu t phòng tiêu ch y do E coli và Clostridium perfringens, Rokovac c a hãng Bioveta, A.S phòng b nh tiêu ch y do E coli và rotavirus suis l n, Porcili... l ; Ch ng vi m ru t do Campylobacter (PHE); Vi m ru t ho i t ; b nh vi m d dày ru t (Transmission Gasto Enteritis- TGE); tiêu ch y l n do E coli M t s tác nhân gây tiêu ch y do vi rút như Rotavirus và Coronavirus gây vi m ru t, b nh d ch t l n, các lo i ký sinh trùng như c u trùng Coccidia… ð có th phân bi t rõ các lo i b nh này thư ng ph i ti n hành các xét nghi m ki m tra vi khu n trong phòng thí... ru t c a Salmonella M m b nh sau khi nhi m vào ñư ng tiêu hoá, nhanh chóng ñi vào h lâm ba c a ru t gây vi m sưng h ch, t ñó vào h tu n hoàn, gây b i huy t, làm cho lá lách sưng to, lúc ñ u do t máu, v sau do tăng sinh, s n sinh n i ñ c t , gây vi m ho i t gan và h ch B nh do vi khu n Salmonella gây ra l n có 2 d ng ch y u: Th nhi m trùng huy t do S choleraesuis var kunzendorf gây ra và th vi m ru t... I VI KHU N E COLI VÀ B NH PHÙ ð U TIÊU CH Y L N DO E COLI 1 Vi khu n E coli Vi khu n Escherichia coli (E coli) trư c ñây ñư c g i là Bacterium coli commune hay Bacilus coli communis, l n ñ u tiên phân l p ñư c t phân tr em b tiêu ch y năm 1885 và ñư c ñ t theo tên c a ngư i bác sĩ nhi khoa ð c Theodor Escherich (1857 –1911) (Nguy n Vĩnh Phư c, 1974, Nguy n Lân Dũng và cs (1976), Nguy n Như Thanh và. .. s c quan tr ng trong quá trình sinh b nh c a vi khu n Salmonella Vì v y, vi c nghiên c u các y u t này là h t s c c n thi t, góp ph n quan tr ng trong vi c phòng ch ng b nh do vi khu n Salmonella gây nên 1.6.2 Các y u t là ñ c t N u như các y u t gây b nh không ph i là ñ c t là nh ng tác nhân gián ti p, quan tr ng trong quá trình sinh b nh c a vi khu n Salmonella, thì các y u t gây b nh là ñ c t l... và gia súc v i t l m và ch t cao (Krause và Fang, 1995) 2 B nh tiêu ch y b i huy t l n do Salmonella 2.1 ð c tính sinh b nh Theo Quinn và cs (2002), s lây truy n Salmonella thư ng qua con ñư ng phân-mi ng, nhưng nhi m trùng qua niêm m c c a k t m c m t và ñư ng hô h p trên cũng có kh năng x y ra Cũng theo Quinn và cs (2002), Salmonella c n xâm nh p vào ru t non và k t tràng ñ gây b nh ñư ng ru t Tuy... nh tích vi th th y l n trong l p t bào lông nhung là vi khu n E coli L p t bào lông nhung b phá h y n ng 2.3 Phòng b nh tiêu ch y do E coli l n Vi khu n E coli gây b nh tiêu ch y l n là vi khu n t n t i trong môi sinh, nơi ñư ng tiêu hóa v t ch Vì v y khâu v sinh chăm sóc có m t ý nghĩa to l n trong phòng b nh Chu ng tr i, th c ăn, nư c u ng ph i ñ m b o v sinh, ch ñư c nhi m E coli trong tiêu chu... tây th n và ph i vi m (Trương Văn Dung và Yoshihara Shinobu, 2002) 2.2.2 B nh tích vi th : Lư i n i mô và h ch b ch huy t tăng trư ng; ho i t ñi m tr ng huy t và ho i t gan; xu t h ch b ch huy t c a màng treo ru t, màng ph i, màng b ng, màng bao tim, th n và màng não l m t m xu t huy t (Trương Văn Dung và Yoshihara Shinobu, 2002) Theo Wilcock (1995), d u hi u bi n ñ i b nh tích vi th là do Salmonella . Salmonella gây bệnh tiêu chảy, phù ñầu và bại huyết ở lợn nuôi tại một số tỉnh phía Bắc. - Chọn chủng vi khuẩn E. coli, Salmonella chế tạo thử nghiệm vacxin ña giá phòng bệnh cho lợn. Ý NGHĨA. phòng bệnh tiêu chảy, phù ñầu và bại huyết ở lợn tại một số tỉnh phía Bắc Vi t Nam MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Xác ñịnh yếu tố ñộc lực, yếu tố kháng nguyên các chủng vi khuẩn và E. coli, Salmonella. VÀ BỆNH PHÙ ðẦU TIÊU CHẢY Ở LỢN DO E. COLI 3 II. VI KHUẨN SALMONELLA VÀ BỆNH TIÊU CHẢY, BẠI HUYẾT DO SALMONELLA Ở LỢN 16 III. VACXIN PHÒNG PHÙ ðẦU, TIÊU CHẢY, BẠI HUYẾT TRÊN LỢN 28 CHƯƠNG