Bộ Y tế TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI ĐỖ PHƯƠNG LOAN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN • • • HOÁ HỌC LOÀI BÌNH VÔI THU HÁI Ở SA PA (STEPHANIA BRACHYANDRA DIELS) (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 1999 - 2004)-^ r f y <0.01% \$4 9 t T / V j - Người hướng dẫn : GS.TS. Phạm ThanftJCy Z s ( ử / ThS. Nguyễn Quốc Huy - Nơi thực hiện : BỘ MÔN DƯỢC LIỆU TRƯỜNG ĐH DƯỢC HÀ NỘI - Thời gian thực hiện : 15/ 02/ 2004 - 15/ 05/ 2004 HÀ NỘI, THÁNG 05 - 2004 \ l l 8 l • \ \ f MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỂ 1 PHẦN 1- TỔNG Q U AN 2 1.1- Đặc điểm thực vật của chi Stephania Lour 2 1.1.1- Vị trí phân loại của chi Stephania Lour 2 1.1.2- Đặc điểm chung của chi Stephania L our 2 1.1.3- Các loài thuộc chi Stephania ở Đông Dương và Việt Nam 2 1.2- Phân bố của chi Stephania Lour 3 1.2.1- Trên thế giới 3 1.2.2-ở Việt Nam 4 1.3- Thành phần hoá học 4 1.3.1- Nghiên cứu về alcaloid trong chi Stephania trên thế giới 4 1.3.2- Những nghiên cứu về alcaloid trong chi Stephania ở Việt Nam 5 1.4- Tác dụng dược lý và độc tính 7 1.5- Công dụng và dạng bào chế 8 PHẦN 2- NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 10 2.1- Nguyên liệu 10 2.2- Phương tiện nghiên cứu 10 2.2.1- Súc vật thí nghiệm 10 »2.2.2- Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 10 2.3- Thử độc tính cấp 11 PHẨN 3- THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 12 * 3.1- Mô tả đặc điểm thực vật 12 14 14 14 15 17 17 17 19 19 19 20 20 20 21 21 21 22 24 26 27 29 32 32 32 32 34 I 3.2- Đặc điểm vi phẫu 3.2.1- Đặc điểm vi phẫu thân 3.2.2- Đặc điểm vi phẫu cuống lá 3.2.3- Đặc điểm vi phẫu gân lá 3.3- Đặc điểm bột dược liệu 3.3.1- Đặc điểm bột củ 3.3.2- Đặc điểm bột thân 3.4- Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thân và củ 3.4.1- Định tính alcaloid 3.4.2- Định tính flavonoid 3.4.3- Định tính antranoid 3.4.4- Định tính coumarin 3.4.5- Định tính glycosid 3.4.6- Định tính saponin 3.4.7- Định tính tanin 3.4.8- Định tính tinh bột 3.4.9- Định tính đường khử tự do 3.5- Định tính alcaloid bằng SKLM 3.6- Định lượng alcalid toàn phần 3.7- Định lượng L-tetrahydropalmatin 3.8- Chiết xuất alcaloid toàn phần từ c ủ 3.9- Phân lập alcaloid 3.9.1- Phân lập alcaloid bằng sắc ký cột 3.9.2- Phân lập alcaloid bằng phương pháp điều chỉnh pH 3.93- Phân lập alcaloid bằng SKLM điều chế 3.10- Nhận dạng alcaloid .34 .34 .34 .35 .36 .39 .39 .40 .40 .42 .42 .43 .43 45 .45 .46 3.10.1- Kiểm tra độ tinh khiết các alcaloid 3.10.2- Nhận dạng các chất T2, Tj, RT, Pj, RLj, V| 3.10.2.1- Nhận dạng chất T2 3.10.2.2- Nhận dạng chất Tt 3.10.2.3- Nhận dạng chất RT 3.10.2.4- Nhận dạng chất Pt 3.10.2.5- Nhận dạng chất R L j . 3.10.2.6- Nhận dạng chất V ! 3.11- Thử độc tính cấp của dịch ép củ tươi 3.12- Khảo sát sơ bộ khả năng nhân giống loài 3.12.1- Nhân giống bằng mảnh c ủ 3.12.2- Nhân giống bằng củ nguyên vẹn 3.12.3- Nhân giống bằng hạt PHẦN 4 - KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 4.1- Kết luận 4.2- Đề xuất TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT Alc : Alcaloid. Dc : Dịch chiết. HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao. SKLM : Sắc ký lớp mỏng. SK : Sắc ký. TP : Toàn phần I ĐẶT VẤN ĐỂ Nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới và đa dạng về địa hình do đó Việt Nam có nguồn tài nguyên cây thuốc rất phong phú. Chi Stephania Lour, là một chi lớn và phức tạp đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Tuy nhiên cho đến nay nhiều loài trong chi này vẫn chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ. Với xu thế sử dụng thuốc hiện nay, ngành Dược đang chú trọng đến các chất có tác dụng chữa bệnh nguồn gốc thảo dược. Hơn nữa, đã có những khuyến cáo chính thức về nhóm thuốc Diazepam do khả năng gây nghiện và một số tác dụng không mong muốn khác nên việc nghiên cứu các dược liệu có tác dụng an thần càng trở nên có ý nghĩa. Loài bình vôi Stephania brachyandra Diels thu hái ở Sa Pa chưa có tài liệu nào ở Việt Nam công bô cụ thể. Với đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hoá học một loài bình vôi thu hái ở Sa Pa (Stephania brachyandra Diels)” em hy vọng góp một phần nhỏ nghiên cứu để có hướng sử dụng và bảo tồn tốt hơn với các nội dung sau: 1- Về thực vật: - Mô tả đặc điểm thực vật, kiểm định tên khoa học của loài nghiên cứu. - Xác định đặc điểm vi phẫu thân, lá và đặc điểm bột dược liệu loài nghiên cứu. 2- Thành phần hoá học: - Định tính các nhóm chất trong dược liệu. - Định lượng alcaloid toàn phần và L-tetrahydropalmatin trong dược liệu. - Chiết xuất và phân lập một số alcaloid. - Nhận dạng các chất phân lập được. 3- Thử tác dụng sinh học: - Thử độc tính cấp dịch ép từ củ bình vôi tươi. 4- Khảo sát sơ bộ khả năng nhân giống của loài bình vôi nghiên cứu. 1 I PHẦN 1- TỔNG QUAN 1.1- Đặc điểm thực vật của chi Stephania Lour. 1.1.1- Vị trí phân loại chi stephania Lour. Theo tài liệu [2], [7], [12], [39], chi Stephania Lour, thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae), phân bộ Tiết dê (Menispermineae), bộ Hoàng liên (Ranunculales), thuộc liên bộ Hoàng liên (Ranunculanae), trong phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae), thuộc lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), trong ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) hay còn gọi là ngành Hạt kín (Angiospermae). 1.1.2- Đặc điểm chung của chi stephania Lour. Theo tài liệu [2], [25], [39], [42], [43], chi Stephania Lour, được mô tả như sau: Dây leo, hầu hết mảnh khảnh. Thân gỗ hay thân cỏ. Rễ đôi khi thành củ. Lá với cuống thường gấp khúc ở gốc, phiến lá hình lọng, thường hình trứng hay gần hình tròn, 8-13 gân lá hình chân vịt. Cụm hoa ở kẽ lá hay mọc trên thân cây già không lá, thường cấu tạo bởi những xim dạng tán có cuống, đơn độc hay xếp theo kiểu chùm, ít nhất ở các nhánh của tán cấp 1, các nhánh cuối cùng đôi khi không đều, hoặc đôi khi có các xim tụ họp thành đầu hình đĩa. Hoa đực 6-8 lá đài rời nhau, xếp thành 2 vòng, bằng nhau hay không bằng nhau, hoặc chỉ có 2-3 lá đài ở loài s. capitata, đài ít nhiều hình trái xoan ngược. Cánh hoa rời nhau, 3 hay 4, hình trứng ngược, mép bên nhiều khi gập vào trong. Nhị hợp thành một trụ, bao phấn 4-8 ô nứt ngang. Hoa cái đối xứng hay bất đối xứng, 1-8 lá đài, 2-4 cánh hoa, 1 lá noãn vòi rất ngắn hoặc không có, núm nhị chia thuỳ ngắn hoặc rách, choãi ra. Quả hạch hình trứng ngược với vết sẹo của núm gần gốc, nhẵn; vỏ quả trong ở phía lưng mang một dải hình móng ngựa gồm 2 hay 4 dãy dọc các bướu hay những gờ ngang. Hạt hình móng ngựa. Giá noãn có các lỗ thủng có hoặc không. Cây mầm có lá mầm bằng rễ mầm, bao quanh bởi nội nhũ. 1.1.3- Các loài thuộc chi Stephania Lour, ở Đông Dương và Việt Nam. Trên thế giới hiện nay thống kê được tên khoảng 107 loài thuộc chi Stephania [39]. 2 Thống kê ở Đông Dương và Việt Nam, theo tác giả Nguyễn Tiến Bân [2] có 9 loài, Võ Văn Chi [12] có 8 loài, Phạm Hoàng Hộ [19] có 7 loài, Trần Công Khánh [6 ] có 9 loài, Sách đỏ Việt Nam [30] có 5 loài. Theo Nguyễn Chiều, Ngô Trại [10], Nguyễn Tiến Vững [11], [39], [40] mô tả 14 loài thuộc chi Stephania có ở Việt Nam (bảng 1). Bảng 1. Một sô loài thuộc chi Stephania Lour, có ở Việt Nam. STT Loài Tên Việt Nam Tài liệu 1 S. brachyandra Diels. Bình vôi 10; 39 2 s. Cambodia Gagnep. Bình vôi 10; 39 3 s. cepharantha Hay. Bình vôi 10; 39; 40 4 s. dielsiana Y.c. Củ dòm 9; 10 ; 23; 36 5 s. excentrica H.S.Lo. 10; 39 6 s. hainanensis H.S.Lo. Bình vôi 10; 39 7 S. hernandifolia (Willd.) Walp. Dây mối 10; 39 8 S. kwangsiensis H.S.Lo. Bình vôi Quảng Tây 10; 39 9 S. longa Lour. Dây lõi tiền rễ dài 10; 39 10 S. pierrei Diels. Bình vôi trắng 10; 39 11 S. sinica Diels. Bình vôi tán ngắn 10; 39 12 Stephania glabra (Roxb.) Miers. Bình vôi (Ninh Bình) 10; 39 13 Stephania kuinanennis H.S.Lo et M.Yang. % Bình vôi (Lạng Sơn) 43; 44 14 Stephania viridiflavens H.S.Lo et M.Yang. Bình vôi (Sơn La) 11; 20 3 I 1.2- Phân bố của chi stephania Lour. 1.2.1- Trên thê giới. Theo tài liệu [39], [42], [43] chi Stephania phân bố ở vùng nhiệt đới, Á nhiệt đới, có ở các nước: Indonexia, Myanma, Malayxia, Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam, Philippin, Ấn Độ, Bangladesh, Srilanca, Trung Quốc, Đài Loan, Papua New Guinea, Nhật Bản, Australia, Nigeria, Ethiopi. về số lượng loài thuộc chi Stephania Lour, trên thế giới các tài liệu không thống nhất. 1.2.2- Ở Việt Nam. Theo tài liệu [5], [10], [21], [39], các loài bình vôi thường mọc hoang ở một số vùng núi đá vôi, núi đất, núi đất lẫn đá, ở đồng bằng, ven biển, có loài mọc ngay trên bãi cát hoặc gò cát hoang vùng ven biển. Các loài bình vôi ở nước ta có diện phân bố rất rộng trên cả 3 miền Bắc, Trung, Nam. + Miền Bắc: Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hải Phòng, Hà Nội, Hà Tây, Hoà Bình, Yên Bái, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Phú Thọ, Lào Cai, Hà Giang, Sơn La, Nam Định, Ninh Bình. + Miền Trung: Thanh Hoá, Nghệ An, Lâm Đồng, Đắc Lắc, Ninh Thuận, Quảng Nam, Đà Nẵng, Thừa Thiên Huế, Bình Định, Phú Yên. + Miền Nam: An Giang, Đồng Nai, Sông Bé, Bà Rịa-Vũng Tàu. 1.3- Thành phần hoá học. 1.3.1- Những nghiên cứu về alcaloid trong chi stephania trên thế giới. Song song việc nghiên cứu về thực vật của chi Stephania, nhiều nhà khoa học đã đi sâu nghiên cứu thành phần hoá học của các loài trong chi này. Thành phần hoá học của chi Stephania gồm có alcaloid, tinh bột, đường khử, acid malic, men oxydase Trong đó alcaloid là thành phần chính và được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất. Theo tài liệu [39], alcaloid có trong chi Stephania Lour, chia làm 8 nhóm chính (bảng 2 ). 4 +■ Bảng 2. Các nhóm chất chính trong chi Stephania Lour. STT Nhóm chất Số lượng alcaloid 1 Benzyl isoquinolin Gồm 3 chất, trong đó có chất Papaverin C20H2| N04 2 Bis benzyl isoquinolin Gồm 40 chất, trong đó có chất Tetrandrin C38H42N204 3 Protoberberin Gồm 22 chất, trong đó có L-tetrahydropalmatin C21H25 N04 và Palmatin C21H25 N(+)0 4 4 Aporphin Gồm 54 chất, trong đó có Roemerin C18H17N 02 5 Proaporphin Gồm 3 chất, trong đó có Stepharin C18H19N 03 6 Hasubanan Gồm 29 chất, trong đó có Cepharamin C19H23N0 4 7 Morphinan Gồm 11 chất, trong đó có Sinoacutin C14H2|N04 8 Dibenzazonin Gồm 1 chất là Protostephanin C21H27N0 4 có trong loài Stephania japonica (Thunb). Miers. 1.3.2- Những nghiên cứu về alcaloid trong chi stephania ở Việt Nam. Theo Đỗ Tất Lợi [25] có trích dẫn các tài liệu khác, năm 1940 Bùi Đình Sang xác định củ bình vôi mọc ở Việt Nam có tinh bột, đường khử, men oxydase, nhiều alcaloid với tỉ lệ 0,12-0,15% (tính trên củ tươi), trong đó chiết được một alcaloid, Bùi Đình Sang đặt tên là Rotundin. Năm 1965, Viện nghiên cứu cây thuốc và cây có tinh dầu toàn bang Xô Viết (Vilar) đã xác định Rotundin của Bùi Đình Sang chiết được từ củ bình vôi ở Việt Nam chính là L-tetrahydropalmatin. Năm 1964, Ngô Vân Thu [33] chiết được một alcaloid ở loài bình vôi khác với tỷ lệ 0,1% và đã xác định đó là Roemetin năm 1971. Bùi Thị Bằng và cộng sự [36] đã khảo sát hàm lượng L-tetrahydropalmatin trên một số mẫu bình vôi mọc hoang ở các bộ phận thân, rễ, củ đi đến kết luận: 5 "P [...]... 3.3- Đặc điểm bột dược liệu 3.3.1- Đặc điểm bột củ Bột màu vàng, vị đắng, sau hơi ngọt Soi kính hiển vi thấy các đặc điểm sau: Tinh bột (1 ); tinh thể calcioxalat (2 ), thể cứng (3 ) (hình 4) 3.3.2- Đặc điểm bột thân Bột màu hơi xanh, vị đắng, sau hơi ngọt Soi kính hiển vi có các đặc điểm sau: Mảnh mạch điểm (1 ); tinh bột (2 ); thể cứng (3 ); tinh thể calcioxalat (4 ), mô mềm (5 ), mảnh bần (6 ) (hình 5) 17... Dược phẩm TW II) - Viên Rotunda 30mg (Xí nghiệp Dược phẩm TW I) - Viên Rosen30 (3 0mg/viên), chè an thần (Xí nghiệp Dược phẩm Hà Nội) - Viên StiluxóO (6 0mg/viên) (Công ty cổ phần Traphaco) - Rotundin sulphat tiêm (6 0mg/2ml) (Học viện Quân Y) 9 PHẦN 2- NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.1- Nguyên liệu Chúng tôi thu hái mẫu tại Sa Pa (Lào Cai) từ tháng 07 năm2002 đến nay, lấy mẫu trồng ở Hà Nội, theo... Loài Stephania brachyandra Diels a Đoạn thân b Tliâiì mang quả c Quả, hạt đ Hạt e Hoa đực f Củ i (ed ) Quả (eM- Hoa ) cái ( e c) I 3.2- Đặc điểm vi phẫu 3.2.1- Đặc điểm vi phẫu thân: Sử dụng đoạn thân bánh tẻ làm mẫu nghiên cứu Lấy lát cắt ngang phần thân cây: Tẩy, nhuộm kép, loại nước, cố định tiêu bằn để khô tự nhiên, soi dưới kính hiển vi, quan sát thấy các đặc điểm sau (hình 2 ): - Biểu bì (1 ): ... tetrahydrocolumbamin) Năm 2001 Nguyễn Quốc Huy [23] đã xác định hàm lượng L-tetrahydropalmatin trong củ Dòm (Stephania dielsiana Y.C.Wu) thu hái ở Hà Tây là 0,41% Đã chiết xuất và phân lập được một chất khác, dự kiến công thức là CiyH 130 3N, có cấu trúc khung Aporphin ở Việt Nam chưa tìm được tài liệu nào nghiên cún cụ thể về thành phần hoá học của loài bình vôi Stephania brachyandra Diels thu hái ở Sa Pa 6... pierrei Dỉels thu hái ở Nghĩa Bình Năm 1999, Nguyễn Tiến Vững [39] đã phân lập và xác định cấu trúc 5 alcaloid: - L-tetrahydropalmatin từ củ cả 3 loài Stephania glabra (Roxb .) Miers., Stephanỉa kuinanensis H.S.Lo et M.Yang., Stephania sp3 - Roemetin từ quả xanh loài Stephania glabra (Roxb .) Miers - Palmatin từ củ loài Stephania sp3 thu hái từ Quảng Ninh - Cycleanin từ củ loài Stephania sp3 thu được từ... gai gồm 12-14 gai nhỏ Giá noãn có lỗ hình trứng đảo ở giữa Sau khi quan sát và phân tích nhiều lần các đặc điểm mẫu cây nghiên cứu ở Sa Pa (Lào Cai), đối chiếu với các tài liệu phân loại và cử nhân Nguyễn Chiều đã định tên loài Stephania chúng tôi nghiên cứu là Stephania brachyandra Diels, họ Tiết dê: Menỉspermaceae Tên Việt Nam: Bình vôi núi cao, bình vôi nhị ngắn 12 I * * • % « V I • > t yy^ r p r-T... Lần phần trong thân (% ) toàn phần trong củ (% ) 1 2,31 10,40 2 2,30 10,27 3 2,36 10,26 4 2,41 10,63 5 2,32 10,34 Trung bình 2,34 10,38 Nhận xét: Hàm lượng alcaloid toàn phần trong củ cao hơn alcaloid toàn phần trong thân loài nghiên cứu 3.7- Định lượng L-tetrahydropalmatin trong dược liệu Định lượng L-tetrahydropalmatin trong thân và củ bình vôi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) + Thu c... nóng, lấy dịch lọc thử phản ứng sau: - Cho 2ml dịch lọc vào một ống nghiệm thêm vào đó 0,5ml thu c thử Fehling A và 0,5ml thu c thử Fehling B Đun sôi cách thu vài phút thấy xuất hiện tủa đỏ gạch (phản ứng dương tính) Nhận xét: Dược liệu có đường khử Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong củ và thân loài bình vôi thu hái ở Sa Pa được tóm tắt ở bảng 3 22 I Bảng 3 Tóm tắt kết quả định tính các nhóm... trong củ bình vôi không phụ thu c vào màu sắc, khối lượng và hình dáng của củ Để bảo đảm chất lượng của dược liệu, kết hợp bảo vệ tái sinh cây, chỉ nên thu những củ có khối lượng từ 800g đến lOOOg trở lên Năm 1981, Văn Thị Sáu [30] phát hiện L-tetrahydropalmatin ở loài Stephania piereỉ Diels thu được ở Nghĩa Bình Năm 1992, Ngô Thị Tâm [31] công bố phát hiện có chất Cepharanthin trong củ bình vôi Stephania. .. cây, thu mẫu cóhoa, quả, hạt để định tên khoa học và lấy củ, thân cây làm nguyên liệu nghiên cứu 2.2- Phương tiện nghiên cứu 2.2.1- Súc vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng (chủng Swiss do viện vệ sinh dịch tễ cung cấp) cả hai giống khoẻ mạnh, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, trọng lượng 20 ± 2 (g) 2.2.2- Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu - Vi phẫu được chụp ảnh trực tiếp trên kính hiển vi tại bộ môn Thực vật . brachyandra Diels thu hái ở Sa Pa chưa có tài liệu nào ở Việt Nam công bô cụ thể. Với đề tài Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hoá học một loài bình vôi thu hái ở Sa Pa (Stephania brachyandra. Bộ Y tế TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI ĐỖ PHƯƠNG LOAN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN • • • HOÁ HỌC LOÀI BÌNH VÔI THU HÁI Ở SA PA (STEPHANIA BRACHYANDRA DIELS) (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP. brachyandra Diels) ” em hy vọng góp một phần nhỏ nghiên cứu để có hướng sử dụng và bảo tồn tốt hơn với các nội dung sau: 1- Về thực vật: - Mô tả đặc điểm thực vật, kiểm định tên khoa học của loài nghiên