BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI CAO TIẾN DŨNG ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG VÀ THẢM DÒ MỘT s ố TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA FLAVONOID TRONG LÁ LỐT (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 1999-2004) -Người hướng dẫn: TS Vũ Văn Điền Dược sĩ Lê Quốc Hùng -Nơi thực hiện:Bộ môn Dược học cổ truyền -Thời gian thực hiện:9/2003-5/2004 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình làm khtìá luận tốt nghiệp, em đã nhận được sự 'hướng dẫn chỉ bảo tận tình của các thầy cô. Với lỏng biết ơn sâu sắc, em xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới: TsVũVăn Điền Dược sĩ Lê Quốc Hùng Đã giúp đỡ em rất nhiều trong thời gian qua. Em cũng xin chân thành cảm ơn, các thầy cô trong bộ môn Dược học cổ truyền, bộ môn Dược lý và các phòng ban, gia đình và bạn bè đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành đề tài này. Hà nội, tháng 5 năm 2004 Sinh viên Cao Tiến Dũng MỤC LỤC Trang Đặt vấn đề 7 Phần 1-tổng quan 8 1. lĐặc điểm thực vật phân bố 8 1.2Đặc điểm cấu tạo giải phẫu 8 1.3 Trồng trọt, thu hái và chế biến 9 1.4 Thành phần hoá học 9 1.5 Tác dụng dược lý 10 1.6 Công năng chủ trị 11 1.7 Một số bài thuốc có vị Lá lốt được dùng trong điều tr ị 11 Phần 2-Thực nghiệm và kết quả 12 2.1-Nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm 12 2.1. lNguyên liệu 12 2.12.Phương pháp thực nghiệm 13 a. Định tính flavonoid 13 b. Định lượng flavonoid 13 c. Thử tác dụng sinh học 13 ❖ Tác dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào gan và não chuột 13 ❖ Xác định hoạt tính dọn gốc tự do 14 ❖ Tác dụng lợi mật 14 2.2Kết quả thực nghiệm và nhận xét 14 2.2.1.Định tính flavonoid 14 2.2.2Định lượng flavonoid 15 2.2.3Thử tác dụng sinh học 20 ❖ Tác dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào gan và não chuột nhắt 20 ❖ Xác định hoạt tính dọn gốc tự d o 23 ❖ Tác dụng lợi mật 26 Phần 3-Kết luận và đề xuất 29 3.1 Kết luận 29 3.2Đề xuất 29 Tài liệu tham khảo 30 Phu luc 32 CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nội dung uv Utra violet M DA Manonyl dialdehyd AST ánh sáng thường EtOAc Ethyl acetat tp toàn phần ĐẬT VẤN ĐỂ • Cây Lá lốt từ lâu đã được nhân dân ta sử dụng làm thuốc và gia v ị. Lá lốt mọc khắp mọi nơi trên đất nước ta và có trữ lượng lớn ở vùng Đông Nam á. Lá lốt thường được nhân dân sử dụng trong các trường hợp :Đau răng, đau xương thấp khớp, tê thấp đổ mồ hôi tay chân, đầy bụng khó tiêu, bệnh đi ngoài lỏng Đã có một số tác giả nghiên cứu về cây Lá lốt, các kết quả cho thấy cây Lá lốt có chứa các nhóm hoạt chất tinh dầu, alcaloid, tanin, Aavonoid.Thành phần flavonoid hầu như chưa có tác giả nghiên cứu. Với mong muốn đóng góp một phần nhỏ vào việc nghiên cứu, đánh giá thực chất vai trò của cây thuốc để định hướng cho việc khai thác sử dụng hợp lý an toàn và hiệu quả.Trong khoá luận này chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số nội dung sau • Định tính, định lượng flavonoid toàn phần trong Lá lốt • Thử tác dụng chống oxy hoá, hoạt tính dọn gốc tự do, tác dụng lợi mật của dịch chiết cồn và flavonoid toàn phần PHẦN 1-TổNG QUAN 1.1.Đặc điểm thực vật,phân bô Cây Lá lốt thuộc bộ Hồ tiêu (Piperales), họ Hồ tiêu (Piperaceae).Trong họ Hồ tiêu có hai chi :Peperomia và piper, trong chi piper có 10 cây làm thuốc trong đó có cây Lá lốt .Cây Lá lốt còn có tên khác là tất bát, phjăc pat(Tày), ana khia táo, lau chuẩy(Dao)[5] ana klùa táo(Buôn Mê Thuột)[l 1] Tên khoa học là :Piper lolot C.DC. họ Hồ tiêu Piperaceae Cây thân thảo, sống dai, cao 30-50 cm .Thân hình trụ, có đốt, phồng lên ở các mấu, thân có rãnh dọc, có lông nhỏ.Thân non màu xanh già chuyển sang màu nâu, toàn cây có mùi thơm Lá đơn nguyên mọc so le, dài khoảng 13cm rộng 8-10cm ,gốc lá hình tim, đầu lá nhọn phiến lá mỏng mặt trên nhẵn màu xanh, mặt dưới có lông nhỏ ở các đường gân, cuống lá dài khoảng 2,5cm có bẹ gốc ôm lấy thân Cụm hoa mọc ở kẽ lá thành bông đơn tính, dài khoảng l,5cm .Trục bông cái có lông, lá bắc có phiến tròn không có cuống .Bầu nhẵn hình trứng, nằm sâu trong trục bông, đầu nhụy hình sợi Quả mọng một hạt màu vàng nâu. Mùa hoa quả tháng 8-10 Lá lốt được coi là loài đặc hữu phổ biến ở các nước Lào, Việt Nam, Campuchia Tại Việt Nam Lá lốt mọc hoang ở khắp mọi nơi trong cả nước, đặc biệt là ở các tỉnh vùng núi thấp (dưới 1000m)[5,l 1,9,4,3] 1.2 Đặc điểm cấu tạo giải phẫu Vi phẫu lá:biếu bì trên và dưới gồm một lớp tế bào xếp đều đặn, biểu bì dưới của gân lá mang lông che chở đơn bào và đa bào ngắn, đầu nhọn có từ 2-3 tế bào xếp thành dãy, lỗ khí ở mặt dưới phiến lá. Đám mô dày xếp sát biểu bì trên và biểu bì dưới. Mô mềm gồm tế bào tròn màng mỏng. Một bó libe gỗ nằm giữa gân lá gồm có vòng mô dày bao bọc xung quanh bó gỗ có nhiều mạch to xếp phía trên , cung libe ở phía dưới .Phiến lá có mô mềm đồng hoá xếp giữa hai lớp hạ bì tê bào nhỏ ,thành mỏng xếp lộn xộn. Rải rác có tế bào tiết tinh dầu trong mô mềm và trong libe Bôt:Màu lục xám mùi thơm vị hơi đắng. Soi kính hiển vi thấy : mảnh biểu bì trên của lá gồm tế bào màng mỏng, hình nhiều cạnh mang tế bào tiết .Mảnh biểu bì dưới là tế bào màng mỏng, nhăn,mang lỗ khí và tế bào tiết .Tế bào tiết màu vàng, xung quanh có khoảng 6 tế bào xếp toả ra.Tế bào biểu bì dưới gân lá hình nhiều cạnh màng mỏng mang lông che chở đơn hay đa bào ngắn đầu nhọn. Mảnh thân cây :tế bào hình nhiều cạnh, mang lỗ vỏ, lông che chở và tế bào tiết, có khi lông đã rụng để lại những vết tròn nhỏ .Sợi mô cứng thành mỏng hay hơi dày, khoang rộng, mảnh mạch xuắn, mạch mạng, mạch điểm [3] 1.3. Thu hái, trồng trọt, chê biến - Thu hái:Lá lốt thu hái quanh năm có thể dùng cả thân lá và rễ, hái về dùng tươi hay phơi khô để dùng, nhưng thường dùng tươi. Nếu dùng rễ thường thu hái vào tháng 8-9[5 ,11] - Trồng trọt: Lá lốt được trồng bằng các đoạn thân dài 20-30cm, các đoạn thân đem giâm vào những nơi ẩm ướt dưới bóng mát như dọc theo hàng rào, tường xây. Cây ít bị sâu bệnh[5,l 1] - Chế biến:Sau khi thu hái rửa sạch loại bỏ tạp chất cắt đoạn 3-5cm có thể dùng tươi hay phơi khô hoặc sấy khô ở nhiệt độ thấp. Nếu có dược liệu khô cần rửa sạch cắt đoạn như trên phơi khô, khi dùng tiến hành vi sao tới khi có mùi thơm là được[ 13] 1.4.Thành phần hoá học -Theo các tài liệu toàn cây Lá lốt có tinh dầu alkaloid, flavonoid, tanin. Hàm lượng tinh dầu trong lá non là 0,17%:0,2% trong lá già và 0,06% trong cọng thân.Các chỉ số tinh dầu:d25:0,9677;nd32: l,5202;aD32:-4, chỉ số acid 0,697, chỉ số este 6,256; chỉ số acetyl 32,820-Thành phần tinh dầu có trên 35 hợp chất trong đó đã xác định được 25 chất bằng sắc ký khí .Chất có hàm lượng cao nhất là P-caryophylline và bomyl acetat.[19] -Theo tài liệu [20,21] trong dịch chiết n_hexan của cây Lá lốt có Ị3-asarone và một chất kết tinh dược xác định cấu trúc bằng phương pháp nhiễu xạ tia X là:3-(4'-Methoxyphenyl)propanoyl pyrrole[21] 1.5 TÉC dụng dược lý Theo các tài liệu Lá lốt có các tác dụng sau: -Tác dụng kháng khuẩn với vi khuẩn :Bacillus pyocyaneus, Staphylococus aureus và Bacillus subtilis.Tác dụng kháng khuẩn của ba dạng bào chế cao lá khô ,cao lá tươi, và nước ép lá tươi gần tương tự như nhau[5] -Tác dụng chống viêm.Cao lỏng Lá lốt dùng ngậm và viên cao Lá lốt dùng uống được thử nghiệm trên lâm sàng tỏ ra có tác dụng giảm đau và và trị các -Theo tài liệu [12]trong Lá lốt có các hợp chất CH, H 1 o nrDíTnono 14-beta pregnane bênh viêm cấp tính về răng miệng , trị viêm răng do răng sâu có biến chứng, túi viêm răng khôn, nhất là ở hàm dưới[5]. Dịch chiết cồn(2:1), flavonoid toàn phần 4% có tác dụng chống viêm tương tự như nhau trên chuột cống qua đường uống[17] -Tác dụng giãn mạch ngoại biên và ức chế hoạt tính gây co thắt cơ trơn ruột của histamin và acetylcholin .[5] l.ổ.Công năng và chủ trị Tính v ị, quy kinh:Lá lốt có vị cay mùi thơm tính ấm, quy kinh tỳ, phế Công năng:ôn trung tán hàn, hạ khí, chỉ thống [3,5,11,18] Chủ trị: Phong hàn thấp chân tay lạnh, tê bại .Rối loạn tiêu hoá, nôn mửa, đầy hơi, đau bụng ỉa chảy .Thận và bàng quang lạnh. Đau răng đau đầu chảy nước mũi hôi Liều dùng:8-12g dạng thuốc sắc 1.7.Một sô bài thuốc có vị Lá lốt đã được dùng trong điều trị -Dược sĩ Triều Đắc (năm 1962) đã dùng nước sắc Lá lốt kết hợp với dầu hạt dọc để điều trị các vết thương thấy có kết quả tốt [7] -Viên Quân y 108,198,354 đã dùng cây Lá lốt để điều trị viêm loét trong khoa Răng hàm mặt -Bệnh viện Thuận Châu(Sơn La) dùng Lá lốt 15g, vả đay 30g, bạch hoa xà lOg, thiên niên kiện 20g, rễ cỏ xước 20g, rễ cây xấu hổ 30g, cốt toái bổ 15g, gừng sắc uống liên tục trong 10 ngày. Dùng đề điều trị đau khớp -Bác sĩ Lò Kim (Bệnh viện Thuận Châu) và Bác sĩ Lò Cam(Bệnh viện 103) đã dùng bài thuốc gia truyền để điều trị cho bệnh nhân bị đau khớp ở bệnh viện Thuận Châu và nhân dân trong vùng có tác dụng tốt Các chế phám từ Lá lố t: Dentoxid [16] Thành phần :Cao cồn Lá lốt 10% (70 ml), methanol 4g, tinh dầu hương nhu 21g, clorophin lg [...]... 2:1 và flavonoid toàn phần cố tác dụng lợi mật yếu PHẦN 3- KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT 3.1.Kết luận 3.1.1 Về hoá học • Đã xác định hàm lượng flavonoid toàn phần là 1,54% • Trên sắc ký lớp mỏng flavonoid cho 6 vết 3.1.2 Về tác dụng sinh học • Dịch chiết cồn 2:1 và flavonoid 5% có tác dụng lợi mật yếu • flavonoid toàn phần và cao của Lá lốt có tác dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào gan và não.Độ ức chế của flavonoid. .. phần và cao của Lá lốt đều đạt gần 50% đối với tế bào gan và não chuột, • flavonoid toàn phần và cao của Lá lốt có khả năng dọn gốc tự do 0 2 ở nồng độ 100|Lig/ml cao của Lá lốt đạt độ ức chế 46,18%, flavonoid toàn phần đạt độ ức chế 46,76% 3.2.Đề xuất Từ kết quả thực nhgiệm trên chúng tôi đề xuất • Tiếp tục thử các tác dụng sinh học của dịch chiết n_Butanol và một số tác dụng mối liên quan đến tác dụng. .. 2.1.2Phương pháp thực nghiệm a Định tính flavonoid trong dược liệu bằng các phản ứng hoá học và sắc ký lớp mỏng theo các tài liệu[ 1,3,4] b Định lượng: Định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp cân[ 1,4] c Thử tác dụng sinh học: ❖ Tác dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào gan và não của flavonoid toàn phần và cao của Lá lố t: Tiến hành tại phòng Đông Y thực nghiệm viện Y Học Cổ Truyền Việt Nam • Phương... lục) Bảng 1 Kết quả sắc ký lớp mỏng flavonoid toàn phần phân đoạn n_Butanol Vết Đậm độ Rị 100 uv3 5 6 A1C13 + 90,0 xanh 2 + 83.3 Nâu Vàng xỉn 3 +++ 69,4 Nâu +++ 57,0 Nâu Vàng ++ 40,9 Nâu uv3 5 AST 6 Vàng + 33,3 xanh xanh uv3 5 6 Vàng xanh sáng Vàng Vàng Vàng Nâu Vàng xanh sáng Vàng Vàng Vàng Nâu Vàng xanh sáng Vàng Vàng Vàng Nâu sáng 6 AST xanh Vàng Vàng Vàng Nâu sáng Vàng SbCl3 xanh sáng xỉn 5 uv3 5... thấy Flavonoid toàn phần thể hiện tác dụng ức chế phản ứng peroxyd hoá lipid dịch đồng thể đối với cả hai tế bào gan và não Độ ức chế đều đạt gần 50% cao flavonoid toan phan nống đõ inâĩi thu(mg/ml) Hình3:Biéu đồ tác dụng chống oxy hoá của cao và flavonoid toàn phần đối với tế bào não chuột Nhận xét:Qua biểu đồ trên ta thấy cao Lá lốt có tác dụng chống oxy hoá với tế bào não chuột mạnh hơn so với flavonoid. .. hoá học cây Lá lốt, khoá luận tốt nghiệp Dược năm 1977,tr 9.Phạm Hoàng Hộ( 1999),Cây có Việt Nưm ,Nhà xuất bản Trẻ ,Quyển I,tr 297 10 Vũ Ngọc Lộ và cộng sự( 1974), Hai dạng bào chế của Lá lốt ,Tạp chí dược học ,số l,tr 9-11 1 l.Đỗ Tất Lợi(1999),jNhững cây thuốc và vị thuốc Việt Nam,Nhà xuất bản Y học, tr 518 12.Nguyễn Thị Hồng Phủc(2003),Tiếp tục góp phần nghiện cứu thành phần Jp htìá học và một sô tác. .. sô tác dụng sinh học của vị thuốc lá lốtf, khoá luận tốt nghiệp Dược sĩkhoá 1998-2003,tr.28 K 13.Phạm Xuân Sinh( 2000),Phương pháp chế biến thuốc cổ truyền ,Nhà xuất bản Y học, tr 154 14.Thạch Thị Thân (1970),Cây lá lốt, khoá luận tốt nghiệp Dược sĩ năml970,tr.23 15.Lê Ngọc Tú ,Tô Kim Anh,Ngô Văn Thông(1995),Nghiên cứu thành phần polyphenol và khả năng kháng khuẩn của Lá lốt ,Tạp chí nông nghiệp và công... bảng 2 Bảng2:Hàm lượng íìavonoid toàn phần Khối lượng dược liệu độ ẩm Khối lượng Hàm lượng m (g) b(%) flavonoid flavonoid toàn phần(g) Lầnl toàn phần(%) 1 15,05 10,20 0,22 1,63 2 15,32 9,34 0,20 1,44 3 15,04 10,44 0,21 1,56 Trung bình 1,54 2.2.4Thử tác dung sinh hoc ❖ Tác dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào gan và não > Chuẩn bị dung dịch nghiên cứu - Cao Lá lốt: lấy 50g bột dược liệu cho vào bình Sohxlet... ,Tạp chí nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm ,số 11, tr 12 ờ ° 16.Nguyễn Tất Tế(1975),ơ/ới thiệu thuốc chữa răng Dentoxit,tap chí Dựơc học, sô 5,tr 22-23 17.Huỳnh Tính(2001 ),Gốp phần nghiên cứu thành phần hoá học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc lá lốt) , khoá luận tốt nghiệp Dược sĩ khoá 19962001,tr.39 18.Nguyễn Bá Tĩnh (1994),Tuệ Tĩnh toàn tập,Hội y học cổ truyền Thành phố Hồ Chí Minh,tr 12 Tài... có thể xác định được nồng độ ức chế 50% X M A ± SD là D hàm lượng MDA trung bình tính theo nmol > Kết quả Bảng 3 1 Ảnh hưởng các nồng độ khác nhau của chế phẩm cao Lá lốt đến phản ứng oxy hoá lipid dịch đồng thể tế bào gan và não chuột nhắt trắng Dung dịch thử có nồng độ c=lmg/ml dung dịch được đưa vào các ống với các liều lượng khác nhau Lượng cao Nồng độ Lá lốt đưa cuối cùng vào phản của cao ứng(mi) . BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI CAO TIẾN DŨNG ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG VÀ THẢM DÒ MỘT s ố TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA FLAVONOID TRONG LÁ LỐT (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ. nghiên cứu một số nội dung sau • Định tính, định lượng flavonoid toàn phần trong Lá lốt • Thử tác dụng chống oxy hoá, hoạt tính dọn gốc tự do, tác dụng lợi mật của dịch chiết cồn và flavonoid. Vàng sáng Nâu Vàng xanh 3 +++ 69,4 Nâu xỉn Vàng Vàng sáng Vàng Vàng sáng Nâu Vàng xanh 4 +++ 57,0 Nâu xỉn Vàng Vàng sáng Vàng Vàng sáng Nâu Vàng xanh 5 ++ 40,9 Nâu Vàng Vàng sáng Vàng Vàng sáng Nâu Vàng xanh 6 +