BỘ Y T Ế TRƯ Ờ NG Đ Ạ I HỌC Dược HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HUỆ GÓP PHẦN NGHIÊN cứu KHÁNG SINH l i s STREPTOMYCES 318 (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 1997 - 2002) Người hướng dẫn: T.s Cao Văn Thu Th.s V õT h ịT huT huỷ Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược Thời gian thực hiện: 01/02/2001 - 20/5/2002 Hà Nội, 5 - 2002 LỜI CẢM ƠN Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới; Thầy giáo T.s Cao Văn Thu Cô giáo Th.s Võ Thị Thu Thuỷ Những người đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này. Đồng thời tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn tới tất cả các thầy cô trong bộ môn Công nghiệp Dược và các bộ môn khác, cùng các phòng ban đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực nghiệm. Xin cảm ơn tất cả bạn bè và gia đình tôi, những người đã giúp đỡ và động viên tôi trong thời gian qua. Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2002 Sinh viên: Nguyễn Thị Huệ MỤC LỤC Trang Đặt vấn đ ề 1 Phần 1: Tổng quan 3 1.1. Đại cương về Streptomyces 3 1.1.1. Một số đặc điểm chung của Streptomyces 3 1.1.2. Khả năng STH kháng sinh của Streptomyces 4 1.2. Cải tạo chọn giống v s v 5 1.2.1. Đại cương về cải tạo chọn giống v s v sinh kháng sinh 5 1.2.2. Tuyển chọn ngẫu nhiên 5 1.2.3. Đột biến bằng ánh sáng ư v 5 1.3. Lên men STH kháng sinh 7 1.3.1. Lên men bề m ặt 7 1.3.2. Lốn men chìm 7 1.4. Chiết tách-tinh chế 9 1.4.1. Chiết xuất 9 1.4.2. Sắc ký lớp mỏng 11 1.5. Phân loại xạ khuẩn theo ISP (International Streptomyces Project) 11 1.6. Một số nghiên cứu gần đây về kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn 11 1.7. Lên men STH và chiết tách tinh chế một số kháng sinh 12 Phần 2: Thực nghiệm và kết q u ả 2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiêm 15 2.1.1. Nguyên vật liệu 15 2.1.2. Phương pháp thực nghiêm 18 2.2. Kết quả và biện luận 25 2.2.1. Phổ tác dụng của kháng sinh do chủng Streptomyces 318 tạo ra trên MTphân lập(M T l) 25 2.2.2. Kết quả thử khả năng STH kháng sinh của chủng Streptomyces 318 trên các MT nuôi cấy khác nhau 26 2.2.3. Kết quả cải tạo, chọn giống v s v 27 2.2.4. Kết quả lên men STH kháng sinh 30 2.2.5. Kết quả chiết xuất-tinh chế 32 2.2.6. Kết quả phân loại theo ISP 34 Phần 3: Kết luận và đề xuất 36 1. Kết luận 36 2. Đề xuất 36 CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT ADN ; Adenin deoxyribonucleic BC : Bacillus cereus Bp : Bacillus pumilis Bs : Bacillus subtỉlis EC : Escherichia coli Gy : Grey MT : Môi trường Pro : Proteus mirabilis Pseu : Pseudomonas aeruginose Shi : Shigella flexneri SL : Sarcina liitea sm : smooth Sta : Staphylococcus aureus RF ; Rectiflexibiles STH : Sinh tổng hçfp Typhi : Samonelỉa typhi v sv : Vi sinh vật w ; White Y : Yellow ĐẶT VẤN ĐỂ Tình trạng kháng thuốc của vi sinh vật (VSV) đang là một vấn đề nan giải của nghành Y-Dược học Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung. Đặc biệt Việt Nam là một nước đang phát triển do đó tỷ lệ mắc bệnh nhiễm khuẩn cao hơn các nước khác vì vậy nhu cầu tìm ra một số kháng sinh mới có hiệu lực mạnh ngày càng trở nên bức xúc, công nghệ sinh tổng hợp (STH) kháng sinh cũng đang tiếp tục khẳng định vai trò quan trọng của nó với các lĩnh vực khác. Penicillin là kháng sinh đầu tiên được tìm ra vào năm 1928 do nhà bác học Alexander Fleming. Từ đó đến nay đã có khoảng 8000 kháng sinh được biết đến nhờ quá trình STH của v s v trong đó xạ khuẩn chiếm một tỷ lệ cao, hoặc bán tổng hợp và tổng hợp nhờ những thành tựu to lófn của khoa học hiện đại. Trong ngành công nghiệp kháng sinh việc nghiên cứu cải tạo các chủng v s v STH kháng sinh có vai trò rất quan trọng đồng thời việc nghiên cứu phát triển công nghệ lên men STH kháng sinh cũng có ý nghĩa to lớn, đưa lại những ứng dụng thực tế trong các lĩnh vực Y- Dược học. Mặt khác khí hậu Việt Nam là nhiệt đói nóng ẩm nên rất thích hợp cho v s v nói chung và xạ khuẩn nói riêng phát triển mạnh nên công việc nghiên cứu xạ khuẩn đặc biệt là chi Streptomyces đã được tiến hành nhiều năm nay ồ Việt Nam. Công việc này được triển khai từ lâu tại Bộ môn Công nghiệp Dược và Tổ môn Vi nấm - Kháng sinh, trường Đại học Dược Hà Nội. Qua nghiên cứu đã lựa chọn được nhiều chủng có độ ổn định di truyền học tốt và tổng hợp được nhiều kháng sinh có phổ tương đối rộng, đây là nguồn gen quý hiếm giúp cho việc tạo ra các kháng sinh đem lại nhiều ứng dụng trong lĩnh vực phòng bệnh, chữa bệnh cho người và động vật. Với các lý do trên chúng tôi đã chọn khoá luận có tựa đề; “ Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ Streptomyces 318 ” với mục tiêu: - Nâng cao hiệu suất STH kháng sinh. - Nghiên cứu sơ lược về chiết tách và tinh chế. - Phân loại chủng Streptomyces 318. Khoá luận gồm 3 nội dung chính: * Từ chủng Streptomyces 318 phân lập lừ bùn đất Việt Nam tiến hành cải tạo giống và lên men quy mô phòng thí nghiêm để STH kháng sinh. * Nghiên cứu phương pháp chiết tách và tinh chế hoạt chất kháng sinh. * Tiến hành phân loại Streptomyces 318 theo ISP (International Streptomyces Project). PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1. Đại cương về Streptomyces: 1.1.1. Một sô đặc điểm chung của Streptomyces: Streptomyces là một chi thuộc lớp phụ Actỉnomycetales phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên như: đất, nước, bùn, cát Thuộc nhóm vi khuẩn Gram (+), hô hấp hiếu khí. Trong mỗi gam đất nói chung thường có trên 1 triệu xạ khuẩn, theo tác giả Đỗ Thu Hà trong mỗi gam đất ở khu vực Quảng Nam - Đà Nẵng có trung bình từ 4.10'’-5,5.10‘^ xạ khuẩn Streptomyces. Số lượng xạ khuẩn trong 1 gam đất ở các mẫu đất khác nhau là khác nhau, đất giàu dinh dưỡng và có độ ẩm, độ pH thích hợp sô lượng xạ khuẩn trong 1 gam đất sẽ cao hơn còn nếu không thoả mãn các điều kiện trên thì số lượng xạ khuẩn sẽ giảm. Chi Streptomyces tạo ra cả khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất. Màu sắc của khuẩn ty hết sức phong phú có thể gặp các màu: Trắng, vàng, xám, đen, đỏ, lục, lam, tím, nâu, xám đen hay gặp các màu trắng, vàng, xám, đen. Khuẩn ty cơ chất có thể tiết ra môi trường (MT) một số loại sắc tố, có sắc tố tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ, có những sắc tố sẽ bị mất màu khi thay đổi pH. Khuẩn ty cơ chất phát triển một cách đồng đều tạo thành một kết cấu bền. Khuẩn ty cơ chất đang sinh trưởng có tính chất như sụn (xốp), bề mặt nhẵn hoặc xù xì, có xu hướng dính chặt vào môi trường. Khuẩn ty khí sinh có kích thước từ 1,0-1,4 /umvầ. hình thành những chuỗi sinh bào tử, đây là cơ quan sinh sản có tính chất rất đặc trưng, chuỗi sinh bào tử có cấu tạo gồm một sợi trục không có tác dụng sinh sản, trên sợi trục có những sợi ngắn phân nhánh, những đoạn phân nhánh cuối cùng mới có khả năng sinh bào tử. Trong một số trường hợp đặc biệt khuẩn ty khí sinh bị mất khả năng tạo thành bào tử bởi đột biến (Erickson,1948). Theo Waksman chuỗi sinh bào tử có thể thẳng, xoắn hoặc hình làn sóng. Bào tử được hình thành do sự kết đoạn tức là nguyên sinh chất trong khuẩn ty co lại thành từng cụm và được bao bọc bằng một màng đặc biệt hoặc do sợi cắt khúc tức là sự hình thành vách ngăn. Trên mỗi nhánh có từ 10-100 bào tử, bào tử có thể là hình cầu, elip hoặc hình trụ hai đầu tròn, đường kính của bào tử thường tương ứng với đưòfng kính của khuẩn ty, nếu bào tử hình cầu kích thước từ 0,3-0,8 jum còn bào tử hình trụ kích thước là 0,8; 1,0 hoặc 0,7 // m. Khuẩn lạc thường có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp toả ra theo hình phóng xạ. Streptomyces là v sv có thành tế bào kiểu I có chứa L.DAP (diaminopimelat) và glycin. Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng và phát triển là 25”C-35‘*C và pH thích hợp là từ 6,8-7,5. Hình dạng và kích thước bào tử có vai trò quan trọng trong định tên xạ khuẩn. 1.1.2. Khả năng STH kháng sinh của Streptomyces: Streptomyces là một chi có khả năng tạo thành nhiều loại kháng sinh thuộc nhiều nhóm như: Aminosid, chloramphenicol, tetracyclin, macrolid, lincosamid - Kháng sinh nhóm aminosid: + Streptomycin là chất kháng sinh thứ 2 được sử dụng trong lâm sàng sau penicillin được tổng hợp nhờ 5. griseus (Waskman, 1943). + Kanamycin sản xuất từ 5. kanamycetius (Umezawa, 1957). + Tobramycin sản xuất từ s. tenebreus + Neomycin sản xuất i\i s. fradiae (Waksman, Lechevalier, 1949). + Paromomycin sản xuất từ s. rimosus forma paromomycinus + Spectinomycin dihydroclorid sản xuất từS. spectabìỉis - Kháng sinh nhóm chloramphenicol: + Chloramphenicol do s. venezuelae tạo ra. - Kháng sinh nhóm tetracyclin: + Tetracyclin do s. aiireofaciens (1952). + Oxytetracyclin do s. vimosus (Finlay và cộng sự, 1950). + Clotetracyclin do s. aureofaciens (1947). - Kháng sinh nhóm macrolid: + Erythomycin do s. erythteus + Oleandomycin do s. antibioticiis + Spiramycin do s. ambofaciens - Kháng sinh nhóm lincosamid: + Lincomycin do s. lincolnensis (1962). - Kháng sinh chống nấm: + Nystatin do s. noursei (1951). + Amphotericin B do s. nodosus - Một số kháng sinh khác; + Fosfomycin (Fosfocin) chiết xuất ì\i s. fradiae (1980). 1.2. Cải tạo chọn giống VSV: 1.2.1. Đại cương về cải tạo chọn giống v s v sinh kháng sinh: Trong thực tế không thể phân lập được từ tự nhiên một chủng v sv có khả năng tạo chất kháng sinh mong muốn, với một hàm lượng đủ để thoả mãn yêu cầu của sản xuất công nghiệp vì vậy việc cải tạo sàng lọc ra những chủng mới, thoả mãn các yêu cầu của quá trình sản xuất, từ khâu chiết tách-tinh chế sản phẩm là vô cùng quan trọng và cần thiết. 1.2.2. Tuyển chọn ngẫu nhiên: Tuyển chọn ngẫu nhiên hay còn gọi là sàng lọc ngẫu nhiên, là tuyển chọn lấy những biến chủng xuất hiện ngẫu nhiên do sự tác động của các điều kiện ngoại cảnh. Mục đích của tuyển chọn ngẫu nhiên là chọn ra các chủng phát triển tốt, trên cơ sở kế thừa những đặc tính vốn có của loài bố mẹ. 1.2.3. Đột biến bằng ánh sáng u v : Đột biến là quá trình làm thay đổi trình tự sắp xếp các base hoặc thay đổi bản thân các base trong ADN. Sự sinh ra đột biến gọi là phát sinh đột biến. Các yếu tô gây đột biến gọi là các tác nhân gây đột biến, đột biến có thể làm thay đổi một vài nhược điểm của giống như xuất hiện dạng đột biến đề kháng vói các tác nhân bất lợi. Dựa vào nguyên nhân phát sinh đột biến mà người ta chia đột biến ra làm hai loại: ❖ Đột biến tự phát là đột biến mà không có sự tham gia của các tác nhân đột biến, một trong những nguyên nhân của đột biến tự phát có lẽ là do sự sai sót ngẫu nhiên khi liên kết các nucleotid trong quá trình sao chép. *x* Đột biến nhân tạo là đột biến được tạo ra bởi các tác nhân đột biến với mục đích làm nâng cao tần xuất xuất hiện đột biến. [...]... Kháng sinh do chủng Streptomyces 318 tiết ra trong quá trình lên men có tác dụng tốt đối với chủng nấm gây bệnh Candida albicans và nấm mốc đen Aspergillus nỉger nhưng không có tác dụng đối với nấm Saccharomyces cerevisiae □ Kết quả thử kháng sinh nội bào: Với v s v kiểm định là Pseu không có vòng vô khuẩn vậy kháng sinh do chủng Streptomyces 318 tạo ra là kháng sinh ngoại bào, không tạo ra kháng sinh. .. men Nếu là kháng sinh nội bào thì ta lấy sinh khối, còn nếu là kháng sinh ngoại bào thì ta lấy dịch Ịọc sau khi lọc loại bỏ sinh khối của dịch lên men để tiến hành chiết xuất nhằm thu được chất kháng sinh Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự phân bố của chất kháng sinh giữa hai pha không đổng tan với nhau là dung môi chiết với dịch lên men hay sinh khối để tách lấy riêng chất kháng sinh (có thể... có hoạt lực kháng sinh là khá cao (71,3%) và tỷ lệ chủng có hoạt tính kháng sinh nhóm polyen chống nấm cũng chiếm tỷ lệ tương đối cao (15,33%) và trong số đó có nhiều chủng có khả năng sinh các chất kháng sinh có thể có giá trị, những kháng sinh này còn ít được thông báo trên thế giới và ở Việt Nam Đây chính là những nguồn gen quý hiếm từ đó có thể lựa chọn những chủng có hoạt tính kháng sinh cao, hoạt... của kháng sinh do chủng Streptomyces 318 tạo ra trên MT phân lập (MT1): Kết quả thử hoạt tính kháng sinh do Streptomyces 318 tạo ra sau phân lập được giới thiệu ở bảng 1 v s v kiểm định v s v kiểm định Kết quả D [mm] Gram (+) Kết quả Gram (-) D [mmj BC 13,88 EC 12,16 Bp 12,51 Pro 17,18 Bs 15,36 Pseu 17,46 SL 0 Pseu 2 13,62 Sta 14,1 Shi 17,92 Ty phi 14,00 Nhận xét; - Kháng sinh do Streptomyces 318. .. STH kháng sinh của chủng Streptomyces 318 trên các môi trường nuôi cấy khác nhau: Sau thời gian nuôi cấy chủng Streptomyces 318 không phát triển trên các MT5, MT6, MT7 còn trên các MTl, MT2, MT3, MT4 chủng Streptomyces 318 phát triển tốt, tiến hành thử khả năng STH kháng sinh bằng phương pháp khối thạch với v s v kiểm định là Pseu 2 và Bp cho kết quả ở bảng 2 Bảng 2: Kết quả thử khả năng STH kháng sinh. .. bỏ sinh khối đem thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lỗ thạch, v s v kiểm định là Pseu cho kết qủa ở bảng 5: Kết quả Môi trường s D MTĨ* 16,76 0,35 MT2* 16,73 0,64 Nhận xét: Kết hợp bảng 2 và bảng 5 ta thấy: + MTl là MT thích hợp cho chủng Streptomyces 318 STH kháng sinh + Khả năng STH kháng sinh của chủng Streptomyces 318 khi nuôi cấy bề mặt trên một MT nào sẽ tỷ lệ thuận với hoạt lực kháng. .. được tiến hành liên tục và cho hiệu suất khá cao * Chiết kháng sinh nội bào: Với kháng sinh nội bào thì tiến hành chiết rắn - lỏng Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự khuyếch tán của kháng sinh vào dung môi chiết 1.4.2 Sắc ký lớp mỏng: Trong nghiên cứu kháng sinh việc áp dụng các phương pháp sắc ký là rất cần thiết nhằm thu được chất kháng sinh có độ tinh khiết cao Tuỳ theo kỹ thuật và phương... rất nhiều công trinh nghiên cứu song chúng tôi chỉ đưa ra một số nghiên cứu mang tính chất giới thiệu: • Nghiên cứu về sự phân bố của xạ khuẩn sinh các chất kháng sinh nhóm polyen chống nấm trong đất của khu vực Quảng Nam - Đà Nẵng của tác giả Đỗ Thu Hà, Trưcmg đại học sư phạm, Đại học Đà Nẵng đăng trên tạp chí sinh học, số 12/2001 Nghiên cứu này đã cho thấy: Nguồn xạ khuẩn ở Việt Nam rất phong phú, trong... xuất dịch kháng sinh thô dùng trong trồng trọt và chăn nuôi • Nghiên cứu tuyển chọn các chủng xạ khuẩn Streptomyces có hoạt tính cao chống nấm gây bệnh thực vật của các tác giả: Lê Gia Hy, Phạm Kim Dung, Bùi Việt Hà, Viện Công nghệ Sinh học đăng trên tạp chí sinh học, số 9/1997 Nghiên cứu này đã chứng minh: Sự phân bố của các loài xạ khuẩn trong đất ở nước ta khá cao và phong phú, tính đối kháng của... tính STH kháng sinh (tính theo đường kính vòng vô khuẩn trên v s v kiểm định Bp, D100% = 8,16mm) trong đó: x: tần xuất xuất hiện y: % biến đổi hoạt tính STH kháng sinh Nhận xét: - Tần xuất xuất hiện lớn nhất ở % biến đổi hoạt tính từ 155-160%, có 2 biến chủng âm tính - % biến đổi hoạt tính cao chứng tỏ đột biến cho kết quả tốt 2.2.4 Kết quả lên men STH kháng sinh: □ Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của . đề; “ Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ Streptomyces 318 ” với mục tiêu: - Nâng cao hiệu suất STH kháng sinh. - Nghiên cứu sơ lược về chiết tách và tinh chế. - Phân loại chủng Streptomyces 318. Khoá. ngành công nghiệp kháng sinh việc nghiên cứu cải tạo các chủng v s v STH kháng sinh có vai trò rất quan trọng đồng thời việc nghiên cứu phát triển công nghệ lên men STH kháng sinh cũng có ý nghĩa. sâu nghiên cứu về vấn đề này đã có rất nhiều công trinh nghiên cứu song chúng tôi chỉ đưa ra một số nghiên cứu mang tính chất giới thiệu: • Nghiên cứu về sự phân bố của xạ khuẩn sinh các chất kháng