Phần I: Đặt vấn đề Nitơ hay gọi đạm nguyên tố đợc ngời ta quan tâm nhiều từ trớc tới Nitơ chiếm khoảng 16%trong prôtêin Nitơ thành phần quan trọng axit Nuclêic Không có nitơ sống Nitơ có mặt chất diệp lục, nhiều loại vitamin, nhiều loại kích tố nhiều hoạt chất quan trọng khác Ngời ta nhận thấy muốn có thu hoạch 12 tạ hạt hecta,cây trồng cần lấy khỏi đất khoảng 30kg nitơ Số lợng nitơ nằm hạt rơm rạ thân Hiệu suất sử dụng phân hóa học vào khoảng 75% Nh có nghĩa dựa vào nguồn nitơ phân hoá học muốn có hạt phải bón vào hecta khoảng 116,6kg nitơ (tơng đơng với 833kg amôn sunphát) Số lợng nitơ thật khó thỏa mÃn nớc có công nghiệp phân nitơ hóa học phát triển Dự trữ nitơ tự nhiên lớn, không khí có đến 78,16% nitơ Ngời ta tính bầu không khí xung quanh trái đất chứa 4x10 15tấn nitơ, khoảng không khí bên km2 đất đai có khoảng 80.000 nitơ Số lợng nitơ để thoả mÃn nhu cầu nitơ trồng sống mảnh đất đó(với thu hoạch 20 tạ/ha)trong khoảng 80 triệu năm Trong thực tế trồng( nh ngời động vật) khả đồng hoá trực tiếp nguồn nitơ lớn lao Sở dĩ nh không khí, phân tử nitơ tồn trạng thái liên kết nguyên tử nitơ lại với nhờ dây nối bền vững(N=N) [3] Trên toàn trái đất năm trồng sử dụng khoảng 100-110 triệu nitơ, phân đạm hoá học tất nớc giới bổ sung đợc khoảng 30% số lợng nitơ bị lấy Trong ngời muốn phá vỡ liên kết phân tử nitơ (N=N)để dễ tạo loại phân hoá học, cần phải sử dụng điều kiện kỹ thuật phức tạp: nhiệt độ cao(6000 C ), áp suất cao(1000atm), chất xúc tác đắt tiền(Os,Ru) có số vi sinh vật có khả đồng hoá dễ dàng thờng xuyên nitơ không khí điêù kiện bình thờng , ngời ta gọi chúng vi sinh vật cố định nitơ.[2] Vi sinh vật cố định nitơ gåm cã nhiỊu loµi vi sinh vËt sèng tù đất nớc Các loài thuộc giống Clostridium, Azotobacter, Pseudomonas ,Bacillus, Azotobacter,vi khuẩn dinh dỡng quang năng, vi khuẩn sinh mêtan Trong số vi sinh vật sống t đất Azotobacter ,Clostridium vi khuẩn có khả cố định nitơ cao nhất.Khả cố đinh nitơ tự có vi khuẩn nốt sần(Rhizobium) sống cộng sinh rễ họ đậu Tuy nhiên loài sống cộng sinh chúng có tính chọn lọc loại vi khuẩn nốt sần xâm nhiễm lên loài định chúng cố định đợc nitơ nốt sần vi sinh vật sống tự khả cố định nitơ tự không khí cho đất cho có ứng dụng lớn lao sản xuất phân bón vi sinh Ngời ta đà dành cố gắng lớn mặt sâu nghiên cứu đặc điểm sinh học nhóm vi sinh vật cố định nitơ tìm cách phát huy cao tác dụng lớn lao chúng, mặt khác tìm cách khám phá bí mật chế cố định nitơ sinh học với hy vọng bớc dẫn đến cải tiến quan trọng ngành công nghiệp sản xuất loại phân nitơ hoá học.[3] Trong điều kiện nớc ta nay, việc nghiên cứu đặc điểm sinh học vi khuẩn cố định nitơ tự có ý nghĩa lớn nhằm để phát huy hết khả cố định nitơ chúng, từ ứng dụng công nghiệp sản xuất phân bón vi sinh Trong chiến lợc phát triển kinh tế năm gần đây, nhà nớc đà trọng phát triển công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao có lạc.ở Nghệ An, lạc có giá trị kinh tế đà đợc tỉnh quan tâm đầu t phát triển Từ lý với khuôn khổ đề tài tốt nghiệp cử nhân sinh học mà vào tìm hiểu khả cố định nitơ tự vi khuẩn kị khí Clostridium đất trồng lạc xà Nghi Liên- Nghi Lộc-Nghệ An Mục tiêu đề tài 1.Tìm chủng Clostridium có khả cố định nitơ tự 2.Chọn chủng có khả cố định nitơ tự lớn để nghiên cứu đặc điểm hình thái yếu tố ảnh hởng đến sinh trởng:nhiệt độ, độ ẩm, pH, tìm trị số tối u để chủng sinh trởng phát triển tốt 3.Rèn luyện cho thân số kĩ thực hành, thí nghiệm, phơng pháp nghiên cứu khoa học Phần II: Tổng luận I Sự phân bè cđa vi sinh vËt ®Êt: Khu hƯ vi sinh vật đất phức tạp, có đặc điểm sinh lý sinh thái khác Riêng vi khn ®· rÊt phong phó Chóng bao gåm vi khn háo khí, vi khuẩn kị khí, vi khuẩn tự dỡng, vi khuẩn dinh dỡng cacbon, vi khuẩn cố định đạm Vi sinh vật sống thành quần thể, loài loài khác có tác động qua lại lẫn nhau, chúng tác nhân chủ yếu trình chuyển hoá vật chất đất Vi sinh vật có mặt tất loài vật nhng chân đất có đầy đủ chất dinh dỡng, kết cấu thành phần giới tốt, có độ ẩm phản ứng môi trờng thích hợp vi sinh vật phát triển nhiều phong phú thành phần Trên chân đất khô hạn, lầy thụt phát triển vi sinh vật bị hạn chế rõ rệt tạo thành khu hệ vi sinh vật đặc biệt: khu hƯ vi sinh vËt chÞu chua, khu hƯ vi sinh vật kị khí vi hiếu khí, khu hệ vi sinh vật phát triển môi trờng nhiều H2, CH4 Đất trồng lúa nớc vi sinh vật kị khí chiếm u Các loài vi khuẩn sống tự do, có khả cố định đạm nh : Azotobacter , Clostridium pasteurianum có nhiều đất lúa Hai loại có đặc điểm khác :Azotobacter đòi hỏi có ô xi phân tử, có phản ứng với môi trờng trung tính, có đầy đủ lân, Ca, Mg chất hữu Vì đất lúa có nhiều vùng không tìm thấy Azotobacter vi khuẩn kị khí Clostridium pasteurianum phân bố nhiều đất lúa, số lợng chúng có nhiều gam đất, Chúng đà góp phần tích cực làm giàu đạm cho đất lúa đất chuyên trồng màu luân canh vụ lúa, vụ màu có điều kiện thông khí tốt, vi sinh vật háo khí phát triển mạnh Quần thể vi sinh vËt ®Êt thêng tËp trung nhiỊu ë ®Êt canh tác, nơi tập trung nhiều rễ đợc bố sung nhờ chất dinh dỡng có chế độ nhiệt , chế độ không khí thích hợp cho vi sinh vật phát triển Các loài vi sinh vật háo khí giảm xuống theo chiều sâu tầng đất, vi khuẩn kị khí phát triển mạnh tầng đất sâu 40-60cm điều kiện đất thoát nớc mạnh, giàu chất dinh dìng Thêi tiÕt khÝ hËu cịng chi phèi m¹nh mÏ đến quần thể vi sinh vật đất Những tháng nóng ẩm có ma rào, ma phùn, cối phát triển tốt thời gian vi sinh vật phát triển mạnh mẽ Vi sinh vật đất đặc biệt vi sinh vËt vïng rƠ cã mèi quan hƯ mËt thiÕt với trồng Thời kì hoa, rễ hoạt động mạnh tiết nhiều chất dinh dỡng có t¸c dơng kÝch thÝch vi sinh vËt ph¸t triĨn Vi khuẩn kị khí có khuynh hớng phân bố xa vùng rễ Điều kiện địa hình , khu vực địa lý ảnh hởng không nhỏ vi sinh vật đất Khi điều kiện sinh thái thích hợp với trồng thích hợp với phát triển vi sinh vật đất Sự tác động ngời thông qua việc khai phá đất đai, thâm canh tăng suất trồng làm chi phối mạnh mẽ tới khu hệ vi sinh vật đất Việc cày bừa, xới xáo đất, bón phân làm ải, tới tiêu hợp lý đà xúc tiến mạnh mẽ phát triển vi sinh vật đất, làm tăng độ phì nhiêu đất tăng suất trồng.[2] II Sơ lợc vi khuẩn Clostridium Năm 1893 lần X.N.Vinogradxki phát đợc loại vi khuẩn kị khí sống tự có khả cố định nitơ phân tử, lµ Clostridium pasteurianum TÕ bµo cđa Clostridium µ pasteurianum cã kích thớc khoảng 2,5- 7,5x0,7-1,3 đứng riêng rẽ, xếp thành đôi hay xếp thành chuỗi ngắn Khi non có tế bào chất đồng đều, có khả di động Khi già, tế bào chất có cấu tạo hạt, tế bào khả di động Bào tử thờng có hình bầu dục hay hình kéo dài nằm hay gần đầu tế bào Bào tư cã kÝch thíc lín h¬n bỊ réng cđa tÕ bào dinh dỡng, mang bào tử tế bào thờng có hình thoi Kích thớc bào tử khoảng 1,3à.x1,6.à Hiên loài Clostridium pasteurianum ngời ta nhận thấynhiều loài Clostridium khác có khả cố định nitơ phân tử loài: C.butyricum, C butylicum, C beijerinckia, C aceticum, C multifermentans, C Acetobutylicum, C felsineum, C kluyveri, C lactoacetafilum, C.madisonii Sù kh¸c đặc điểm hình thái sinh lý loài đợc thấy rõ khoá phân loại Bergey(1965) Vi khuẩn thuộc loài Clostridium pasteurianum thờng có hoạt tính cố định cao loài Clostridium khác Khi đồng hoá hết 1g thức ăn bon, chúng thờng tích luỹ đợc khoảng 5-10mg nitơ Khả cố định nitơ loài chi Clostridium phụ thuộc nhiều vào điều kiện nuôi cấy Clostridium có khả đồng hoá monosaccarit, disaccarit vµ mét sè polisaccarit(nh tinh bét, dextrin) Chóng cã thĨ đồng hoá nhiều rợu bậc cao số hợp chất chứa bon khác Khi lên men hidratcacbon, Clostridium thờng làm tích luỹ axit hữu butanol, etanol, axeton, CO 2, H2 Thành phần tỷ lệ sản phẩm lên men phụ thuộc vào loại vi khuẩn nh phụ thuộc vào hai pha khác trình lên men Chẳng hạn Clostridium axetobutylicum thờng làm tích luỹ pha đầu axit axetic, axitbutiric vµ pha sau butanol, axeton vµ etanol Clostridium pasteurianum nh nhiều loài Clostridium có khả cố đinh nitơ khác phát triển đợc phạm vi pH rộng (pH =4,7-8,5) Tuỳ nghiên cứu mà pH thích hợp phát triển Clostridium 5,9-8,3,hay 6,9-7,3 Các nghiên cứu Việt Nam cho biết vùng đất chua, không tìm thấy phát triển Azotobacter Clostridium có mặt với số lợng đáng kể Nói chung gam đất trồng lúa, miền bắc nớc ta, số lợng vi khuẩn nhóm có từ hàng vạn đến từ hàng triệu tế bào Số lợng chóng vïng rƠ c©y trång bao giê cịng nhiỊu vùng rễ Clostridium thờng tập trung nhiều lớp đất cày nhng độ sâu 75cm thấy có hàng ngàn tế bào gam đất (Nguyễn Lân Dũng, 1960, 1969) Bào tử Clostridium có sức đề kháng cao nhiệt độ cao khô hạn Một số nghiên cứu cho biÕt bµo tư cđa loµi vi khn nµy cã thể sống đợc đến nhiệt độ 750C nhiệt độ 80 0C Bao tử cđa mét sè chđng Clostridium chÞu nhiƯt ë nhiƯt ®é 1000 C vÉn cã thĨ sèng ®ỵc 30phót Các loài Clostridium diện đất ,một số loài nhóm gây bệnh cho ngời động vật, số loại khác gây h hỏng thực phẩm khử sunphur tạo nên màu đen gây mùi khó chịu Các loài gây ngộ độc thực phẩm quan trọng C botulinum C perfringens.[14] III Vòng tuần hoàn Nitơ tự nhiên Cây không đồng hoá trực tiếp nitơ hữu Trong thực tế trồng nhận đợc nguồn nitơ lớn nhờ trình phân giải vi sinh vật chất hữu có mặt đất đa vào đất (phân rác, phân xanh, phân chuồng) Quá trình gọi trình a môn hoá trình thối rữa Nếu đất bị ngập nớc không đủ ôxi muối amôn đợc tạo thành tích luỹ lại đất, nhng đất có đầy đủ ôxi NH đợc oxi hoá thành nitrit tiếp ôxi hoá thành nitrat (Quá trình nitrat hoá) Nitrat dạng hợp chất nitơ đợc trồng hấp thụ cách dễ dàng Ngợc lại với trình nitrat hoá trình phản nitrat hoá, tức trình khử nitrat thành nitơ phân tử Bên cạnh trình phản nitrat hoá vi sinh vật có trình phản nitrat hoá hoàn toàn hoá học (Phản ứng HNO 2với axit amin amit) Sau trình phản nitrat hoá, nitrat chuyển thành nitơ phân tử bay vào không khí Những tổn thất nitơ trình phản nitrat hoá gây nên đợc bù đắp lại nhờ trình sinh học đặc biệt gọi trình cố định nitơ, tức trình chuyển hoá nitơ phân tử thành hợp chất chứa nitơ Nhóm vi sinh vật có khả thực trình đợc gọi vi sinh vật ccố định nitơ, chúng có tác dụng làm giàu thêm nguồn dự trữ thức ăn nitơ đất _ _ n_ n n2 Tự không khí Sự phân giải Động vật thực vật Protein xác hữu Thực vật n2 o Nấm vi khuẩn phân giải xác hữu Cây họ đậu Amon nh3 Đồng hoá amon hoá Nitrit no Khö nitrat Nitri - Nitrat no no2 Nitrat hoá Hình 1: Chu trình nitơ tự nhiên IV Cơ chế trình cố định Nitơ phân tử Trong công nghiệp sản xuất phân hoá học việc chuyển hoá N thành dạng hợp chất nitơ (muối amôn, urê, nitrat) cần tiêu tốn nhiều lợng Số lợng để tổng hợp NH3 tơng đơng với số lợng sinh đốt cháy than đá Trong vi sinh vật cố định nitơ chế đà thờng xuyên chuyển hoá đợc N2 thành hợp chất chứa nitơ điều kiện bình thờng áp suất nhiệt độ Nếu khám phá đợc chế trình cố định nitơ vi sinh vật rõ ràng mở triển vọng to lớn việc cải tiến toàn trình sản xuất phân nitơ hoá học Đa số nghiên cứu cho thấy rằng:Quá trình cố định nitơ sinh học trình khử N2 thành NH3 dới tác dụng men nitrogenaza sinh vi sinh vật Nitrogenaza thu đợc từ dịch chiết vô bào lấy từ tế bào vi sinh vật cố định nitơ Nitrogenaza hệ phức enzim Chúng cấu tạo thành phần prôtêin có phân tử nhỏ Một thành phần gọi prôtêin sắt gọi nitrogenaza khử hay thành phần II Một thành phần khác gọi prôtêin sắt-Molipden hay gọi thành phần I Thành phần II đợc nghiên cứu Clostridium pasteurianum gồm tiểu phần đồng nhất, tiểu phần có khối lơng 29.000, có trung tâm chứa nguyên tử Fe nguyên tử S không ổn định với axit Thành phần I(Mo-Fe prôtêin ) Clostridium pasteurianum phức tạp có khối lợng phân tử chung 220.000 gồm nguyên tử Mo, khoảng 30 nguyên tử Fe nhiều nguyên tử S không ổn định với axit Chúng có cấu tạo tiểu phần gồm loại, loại có khối l ợng phân tử 50 loại có khối lợng phân tử 60.000 Dalton Mỗi loại gồm hai tiểu phần Nitrogenaza không xúc tác việc khử N2 thành NH3 mà cã thĨ xóc t¸c viƯc khư CH3 CN, HCN, NH3,N2 O, C2H2 thành sản phẩm tơng ứng Phản ứng khư N2 díi sù xóc t¸c cđa nitrogenaza cã thĨ biểu thị vắn tắt nh sau: - Kỹ thuật làm đất: Làm lần : Cày vỡ, cày trở, cày vọc, sau chia luống, luống 1-1,5m Bón phân: Phân chuồng -4tạ phân/sào Phân NPK 15-20kg/sào Tỷ lệ N:P:K 10:8:5 Bón vôi: 20 - 30kg/sào Rắc tung phân sau tiến hành xới xáo để trộn phân vào đất - Kỹ thuật trỉa lạc: Giống lạc L14, l¹c Trung Qc Víi kü tht trång l¹c phđ ni lông ,phun thuốc trừ cỏ Mỗi mét chia hàng, hàng cách 20 - 25cm, khóm(cây)cách 10 - 15cm - Kỹ thuật chăm sóc: Lạc khoảng bón thêm đạm: 2kg/sào Khi lạc 4-5 làm cỏ Khi lạc hoa bón thêm 4-5kg kali/sào, 2kg đạm/sào, làm sơ cỏ vun gốc Khi lạc hoa nhiều phun chất kích thích bón 10kg vôi/sào Năng suất: Bình quân 1,5tạ/sào II Phân lập vi khuẩn Clostridium 1.Đặc điểm Clostridium Giống Clostridium vi khuẩn gram dơng, hình que, kị khí, sinh bào tử phần lớn di động, thuỷ giải sacchoride prôtêin Trong hoạt động thu nhận lợng, loài thuỷ giải sacchoride lên men loại đờng polisacchoride tạo thành axetic acid, butiric rợu Nhiều loài thuỷ giải prôtêin chuyển hoá không hoàn toàn axit amin tạo thành mùi khó chịu sản phẩm Hầu hết giống Clostridium thuộc nhóm a nhiệt vừa, nhiên có số loài thuộc nhóm a nhiệt số loài khác thuộc nhóm a lạnh [12].Có nhiều loài Clostridium đà đợc chứng minh có khả cố định nitơ phân tử Trong loài có hoạt tính cố định nitơ cao Clostridium pasteurianum Tế bào Clostridium pasteurianum có kích thớc khoảng 0,71,3x2,5-7,5à Chúng đứng riêng, xếp thành đôi hay chuỗi ngắn Khi non chúng có chu mao có khả di động, tế bào có cấu tạo đồng Khi già tế bào có cấu tạo lổn nhổn(chứa hạt trữ loại tinh bột) Tế bào khả di động Bào tử có kích thứơc 1,3x1,6à, thờng có hình bầu dục hay hình kéo dài nằm đầu tế bào Bào tử có kích thớc lớn rộng tế bào dinh dỡng, mang bào tử tế bào có hình thoi Khuẩn lạc trắng, phẳng sáng.[10] H.2- vi sinh vât cố định ni tơ tự thuộc giống clostridium Clostridium đồng hoá nguồn thức ăn nitơ vô hữu thức ăn cacbon, chúng sử dụng nhiều loại hợp chất khác So với Azotobacter chúng mẫn cảm K, P, Ca có tính ổn định cao pH thấp cao môi trờng Clostridium phát triển thích hợp đất có độ ẩm vào khoảng 60-80% so với độ ẩm tuyệt đối Chúng phát triển tốt lớp đất cày có chất hữu phong phú Chỉ có loại Clostridium a ẩm có khả đồng cố định nitơ phân tử, chúng tốt nhiệt độ 25-300C Quy trình phân lập Để có chủng vi khuẩn tiến hành phân lập theo quy trình sau: Cân xác thành phần môi trờng Đun sôi, điều chỉnh pH=7 Cho vào 1/3 bình tam giác Cho vào petri Cấy dịch đà pha loÃng nồng độ khác Dùng trang thuỷ tinh trang Nuôi tủ ấm 300C 5-7 ngày (Khi có khuẩn lạc) Quan sát chụp ảnh Kết Với phơng pháp theo dõi sau 48 lần thời gian xuất khuẩn lạc đợc trình bày bảng nh sau: Bảng 1.1: Số khuẩn lạc xuất hiƯn Ngµy cÊy 13/10/2006 Sè thÝ nghiƯm Ngày số khuẩn lạc (CFU) 14/10 16/10 18/10 20/10 108 289 342 297 93 246 364 285 11 105 181 120 18 162 223 167 10 76 112 94 NhËn xÐt : Qua b¶ng 1.1 ta thÊy: Sau thời gian ngày khuẩn lạc xuất hiện, số khuẩn lạc tăng nhanh sau ngày nuôi cấy Sau số lợng giảm dần số chủng bị chết Nh số khuẩn lạc đạt đợc nhiều sau ngày nuôi cấy môi trờng thạch Sau chọn khuẩn lạc đứng riêng rẽ cấy chủng vào ống nghiệm chứa môi trờng thạch để có đợc chủng khiết ảnh 3: Chủng C1, C2 đà phân lập Với nhóm vi sinh vật thuộc nhóm kị khí có mặt ô xi phân tử có hại Chúng không sinh trởng đợc môi trờng đặc bán đặc ®Ĩ kh«ng khÝ hay kh«ng khÝ cã chøa 10% CO2 Chúng sinh trởng đợc nơi ô xi, trình lên men, trình phôt phoril hoá quang hợp trình mê tan.[3] Để miêu tả vi sinh vật để sau định tên chúng, ta cần qua sát sinh trởng vi sinh vật cần nghiên cứu dọc theo dấu vết cấy chích sâu môi trờng thạch đứng sau cấy vào môi trờng thạch lúc cha đông lại Vi sinh vật hiếu khí bắt buộc sinh trởng bề mặt lớp môi trờng, vi sinh vËt vi hiÕu khÝ sinh trëng c¸ch bỊ mặt chút.Vi sinh vật kị khí không bắt buộc phát triển dọc theo chiều dày môi trờng Vi sinh vật kị khí bắt buộc phát triển đáy môi trờng[11] ảnh 5: Các chủng phát triển môi trờng thạch sâu II Đặc điểm khuẩn lạc Khi nuôi cấy môi trờng đặc có khuẩn lạc đặc trng xuất hiện, đặc điểm khuẩn lạc nh sau: Bảng 1.2: Đặc điểm khuẩn lạc Đặc điểm - Màu sắc C1 - Trắng đục Các khuẩn lạc C3 C2 - Trắng đục, C4 C5 - Trắng, đục - Vàng - Trắng đục nhạt - Tròn, đều, - Tròn, đều, lồi - Mỏng, sát mặt nhạt -Hình dạng - Tròn, đều, lồi - Tròn,đều,lồi låi - Bê khuÈn - MÐp b»ng - MÐp h¬i - Mép lạc phẳng viền - cấu trúc - §ång nhÊt - §ång nhÊt th¹ch - MÐp b»ng - Mép không phẳng phẳng phẳng - Đồng - Đồng - Không đồng ảnh 2: khuẩn lạc chủng C1đà phân lập ảnh 6: khuẩn lạc chủng C4 đà phân lập Chơng II: Sinh trởng hoạt tính cổ định nitơ chủng I Sinh trởng chủng Sinh trởng tiêu vô quan trọng Việc xác định tốc độ sinh trởng vi khuẩn cần thiết, biết đợc tốc ®é sinh trëng ta cã thĨ tÝnh ®ỵc sè thÕ hệ dự đoán đợc số lợng tế bào sau thời gian nuôi cấy định từ đa vào ứng dụng sản xuất Sinh trởng phát triển thuộc tính sở sinh vật Theo Blachman, sinh trởng tăng trởng kích thớc, thể tích, số lợng phát triển biến đổi đặc tính sinh lý, sinh hoá qua giai đoạn sinh trởng Rõ ràng việc nghiên cứu cá thể tế bào vi khuẩn nhỏ khó Do nói đến sinh trởng phát triển vi khuẩn tức đề cập đến sinh trởng phát triển quần thể Quần thể vi khuẩn nuôi cấy klhông liên tơc sinh trëng theo mét ®êng cong gåm pha : Số lượng tế bào Pha luỹ thừa Pha tiềm phát Pha cân Pha tử vong thời gian H Đờng cong sinh trởng quần thể thể vi khuẩn nuôi cấy không liên tục - Pha tiềm phát(pha lag): Pha tính từ lúc bắt đầu cấy đến vi khuẩn đạt đợc tốc độ cực đại Trong pha lag vi khuẩn cha phân chia(nghĩa cha có khả sinh sản) nhng thể tích khối lợng tế bào tăng lên rõ rệt trình tổng hợp chất trớc hết cao phân tử(prôtêin ,ezim, axitnuclêic )diễn mạnh mẽ Độ dài pha lag phơ thc vµo ti cđa èng gng vµ thành phần môi trờng -Pha luỹ thừa(pha log): Vi khuẩn sinh trởng phát triển theo luỹ thừa nghĩa sinh khối số lợng tế bào tăng theo phơng trìnhN=N0x2ct , kích thớc tế bào, thành phần hoá học, hoạt tính sinh lý nói chung không thay đổi theo thời gian tế bào trạng thái động học xem nh tế bào tiêu chuẩn - Pha ổn định :quần thể vi khuẩn trạng thái cân động học, số tế bào sinh số tế bào cũ chết Kết số tế bào sinh khối không tăng không giảm Nguyên nhân tồn pha ổn định tích luỹ sản phẩm độc trao đổi chất(các loại rợu, axit hữu cơ) việc cạn chất dinh dỡng(thờng chất dinh dỡng có nồng độ thấp) - Pha tử vong số lợng tế bào sống giảm theo luỹ thừa(mặc dù số lợng tế bào tổng cộng không giảm) Vi sinh vật phát triển môi trờng đặc hình thành khuẩn lạc đặc trng cho loài Ta đo kích thứơc loài khuẩn lạc riêng biệt để tốc ®é sinh trëng cđa tõng loµi ®ã nhanh hay chËm Theo dâi sù sinh trëng cđa c¸c chn vi khn cách xác định kích thớc đờng kính khuẩn lạc(sau ngày lần) Bảng 2.1: Sự sinh trởng chủng Ngày 14/10/06 15/10/06 16/10/06 17/10/06 18/10/06 19/10/06 20/10/06 P(%) C1 1,5 Đờng kính khuẩn lạc (mm) C2 C3 C4 1,2 C5 1,0 0,6 2,8 1,3 1,5 0,9 86% 66% 50% 50% Qua b¶ng ta thÊy sù sinh trởng chủng sau ngày là: 1,9 46% Chủng C1 đạt 86% có tốc độ sinh trởng mạnh Sau đến chủng C đạt tốc ®é sinh trëng 66%, chđng C3 vµ chđng C4 cã tèc ®é sinh trëng b»ng 50% Chđng C5 cã tèc ®é sinh trëng yÕu nhÊt 46% Tõ ®ã ta phân lập chủng C sử dụng để làm thí nghiệm II Hoạt tính cố định nitơ chủng Đánh giá định tính Từ chủng đà phân lập đợc, dùng que cấy lấy Ýt chđng vi sinh vËt cho vµo èng nghiƯm chøa 2ml nớc cất Cho thuốc thử Nessle vào , lắc nhẹ, quan sát, kết thu đợc nh sau: Bảng 2.2: Hoạt tính cố định nitơ chủng Ngày 26/10/2006 C1 + C2 + C3 + C4 + NhËn xét: Các chủng có phản ứng dơng tính (+) víi thc thư Nessle cho mµu vµng cam Chøng tá chủng có khả cố định nitơ phân tử Xác định số lợng vi sinh vật Để xác định số lợng vi sinh vật dùng phơng pháp CFU(Colony Forming unit) tính kết theo tiªu chuÈn quèc tÕ FDA(Food and Drug Asminisstration) đề xuất Tiến hành - mẫu ban đầu pha loÃng theo thập phân - Cấy 0,1ml nồng độ pha loÃng vào hai đĩa - Nuôi 300C 3-5 ngày - Xác định số lợng khuẩn lạc đĩa petri Kết thu đợc nh sau : Bảng 2.3: Vi sinh vật độ pha lo·ng §é pha lo·ng 10-2 10-3 §Üa 342 189 §Üa Sè lỵng vi sinh vËt 365 223 5.086 x 105 (CFU/ml) Khả cố định nitơ chủng Tiến hành: Dùng que cấy lấy chủng vi sinh vật với số lợng nh Sauđó cấy vào ống nghiệm chứa ml môi trờng lỏng Sau khoảng ngày xác định hàm lợng NH4+ phơng pháp so màu quang phổ bớc sóng =415nm theo Sapiro(1972) Kết thu đợc nh sau : Bảng 2.4: Hàm lợng amôn chủng Hàm lợng amôn (mg/l) Chñng Xi X δ X 1,8 C1 1,91 1,86 ±0,075 1,86±0,075 C2 1,82 1,75 1,76 ±0,037 1,76±0,037 1,72 1,81 1,71 C3 1,68 1,66 ±0,05 1,66±0,05 1,7 ±0,03 1,7±0,03 1,59 1,74 C4 1,72 1,65 Qua b¶ng ta thÊy :trong cïng ®iỊu kiƯn m«i trêng, sè vi sinh vËt, pH,nhiƯt ®é ,độ ẩm ,thời gian ta thấy hàm lợng NH4+ chủng sau ngày nuôi cấy: chủng C cao đạt 1,86 mg/l sau đến chủng C đạt 1,76 mg/l, chủng C4 đạt 1,7mg/l chủng C3 yếu đạt 1,66mg/l Từ ta chọn chủng C có khả cố định nitơ mạnh giữ lại để nghiên cứu, tìm ®iỊu kiƯn pH, nhiƯt ®é, ®é Èm thÝch hỵp cho vi khuẩn phát triển mạnh để áp dụng vào thực tiễn Và qua biểu đồ sau thấy rõ hơn: NH4+ (mg/l) chủng C1 C2 C3 C4 Biểu đồ 1.1: So sánh khả cố định nitơ chủng qua biểu đồ cho thấy: Chủng C1 có khả cố định nitơ lín nhÊt(1,86 mg/ml), thø hai lµ chđng C (1,76 mg/ml), thø ba lµ chđng C4 (1,7 mg/ml), thÊp nhÊt chủng C (1,66mg/ml) Do chọn chủng C1 tốt để thực nghiên cứu Chơng III: Các yếu tố ảnh hởng đến khả cố định Nitơ I ảnh hởng pH pH môi trờng có ý nghĩa quan trọng sinh trởng phát triển nhiều vi sinh vËt Sù thay ®ỉi nång ®é ion H + môi trờng làm ảnh hởng đến trạng thái ion hoá bề mặt tế bào vi sinh vật, ảnh hởng đến trạng thái ion hoá enzim ảnh hởng đến trình trao đổi chất lợng chúng Do cần phải tìm hiểu ảnh hởng độ pH hi vọng qua tìm pH thích hợp cho hoạt động cố định nitơ vi sinh vật Các giá trị pH (cực tiểu, tối thích, cực đại) cần cho sinh trởng sinh sản vi khuẩn tơng ứng với giá trị pH cần cho hoạt động nhiều enzim Giới hạn pH hoạt động vi sinh vật khoảng - 10 Đa số vi khuẩn sinh trởng tốt giá trị pH trung tính(7,0) Đờng biểu diễn ảnh hởng pH đến vận tốc phản ứng nhiều ezim có dạng 100 % Hoạt độ cực đại 50 H.4 Đờng biểu diễn minh hoạ ảnh hởng pH đến tốc độ phản ứng enzim pH thích hợp cho hoạt động ezim vào khoảng Tuy nhiên có số ezim có pH thích hợp thấp (pepxin, prôtêinaza axit vi sinh vật ) cao (subtilizin, pH thích hợp >10).[1] pH thích hợp ezim liên quan đến cấu trúc di truyền chúng nên tìm hay xác định đợc pH tối thích cần thiết để điều chỉnh hoạt tính enzim cho có hiệu Với phơng pháp đà nêu, công thức thí nghiệm có pH khác nhau, hàm lợng amon thu đợc nh sau: B¶ng 3.1: ¶nh hëng cđa pH Thêi gian 24 48 72 X CT1 1,65 1,66 1,66 1,65 Độ pH hàm lợng NH4+ (mg/ l) CT2 CT3 CT4 1,68 1,70 1,67 1,70 1,77 1,70 1,73 1,82 1,72 1,70 1,76 1,69 CT5 1,66 1,66 1,67 1,66 đây: CT1: pH = 5; CT2: pH = 6; CT3: pH = 7; CT4: pH = 8; CT5: pH = Và xác định hàm lợng amon sau 24h lần Qua bảng 3.1 cđa pH ta thÊy: ë pH = cã hµm lỵng amon lín nhÊt (1,76 mg/l) ë pH = 6, pH = cho kết tơng tự (1,7 mg/l 1,69 mg/l) Từ cho thấy pH trung tính thích hợp cho vi sinh vật hoạt tính cố định nitơ lớn nhÊt, vïng pH = - > ®Ịu có kết cao pH = kết thấp Chứng tỏ vi sinh vËt thÝch øng pH réng tõ 5->9 Nh vËy khả sử dụng vi sinh vật lớn Biểu đồ sau thấy rõ điều đó: NH4+ (mg/l) pH Biểu đồ 3.1: So sánh ảnh hởng pH Qua biểu đồ cho thấy hàm lợng amon đợc tích luỹ theo hớng tăng dần từ pH = -> sau giảm dần tõ pH = ®Õn pH = Nh vËy pH = tối u biến thiên hàm lợng amon theo pH tăng giảm quanh pH trung tính II ảnh hởng nhiệt độ Nhiệt độ ¶nh hëng rÊt lín ®Õn ®êi sèng cđa vi sinh vật chúng mẫn cảm với nhiệt độ Thông thờng nhiệt độ ảnh hởng đến hoạt tính ezim vi sinh vật Teo định luật Vanhop điều kiện tiêu chuẩn nhiệt độ tăng 10 0c tốc độ phản ứng tăng hai lần Kt +10 Q10= ... [6] V Sử dụng vi sinh vật có khả cố định Nitơ nông nghi? ??p Vi sinh vật cố định nitơ đóng vai trò quan trọng vi? ??c thực vòng tuần hoàn nitơ nông nghi? ??p Các vi khuẩn cố định nitơ sống tự do( háo khí... sâu II Đặc điểm khuẩn lạc Khi nuôi cấy môi trờng đặc có khuẩn lạc đặc trng xuất hiện, đặc điểm khuẩn lạc nh sau: Bảng 1.2: Đặc điểm khuẩn lạc Đặc điểm - Màu sắc C1 - Trắng đục Các khuẩn lạc C3... đợc tỉnh quan tâm đầu t phát triển Từ lý với khuôn khổ đề tài tốt nghi? ??p cử nhân sinh học mà vào tìm hiểu khả cố định nitơ tự vi khuẩn kị khí Clostridium đất trồng lạc xà Nghi Liên- Nghi Lộc- Nghệ