ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN oOo QCH NGƠ DIỄM PHƯƠNG KHẢO SÁT QUY TRÌNH THU NHẬN CÁC HP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ VIỆC NUÔI CẤY TẾ BÀO HAI LOÀI DROSERA Chuyên ngành: Sinh hóa Mã số: 62 42 30 15 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2011 LỜI CAM ĐOAN Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Những kết quả trong nghiên cứu này hoàn toàn chưa được công bố bởi bất kỳ tác giả nào khác. NCS. Quách Ngô Diễm Phương LỜI CẢM ƠN Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang ii Lời cảm ơn Công trình này là kết quả hơn 3 năm học tập và nghiên cứu của tôi tại Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật và Chuyển hoá Sinh học thuộc Khoa Sinh, trường Đại học Khoa học Tự nhiên với rất nhiều sự dạy bảo, quan tâm và giúp đỡ. Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Bùi Văn Lệ, người đã đề ra hướng nghiên cứu thu nhận hợp chất thứ cấp trên đối tượng cây bắt ruồi ở Việt Nam bằng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật và tận tình chỉ dạy cũng như đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi được thực hiện, hoàn thành luận án này. Đồng thời, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến GS. TS. Nguyễn Kim Phi Phụng – Khoa Hóa, trường ĐH Khoa học Tự nhiên. Cô là người đã đặt nền móng đầu tiên cho khối kiến thức Hóa học mà tôi có được để ứng dụng trong luận án này. Mặc dù không là người hướng dẫn, nhưng Cô luôn ở bên cạnh, đốc thúc, hỗ trợ tinh thần cho tôi trong lúc thực hiện luận án. Thời gian làm thực tập sinh ở nước ngoài đã giúp tôi trưởng thành hơn trong chuyên môn, trong tác phong học tập và nghiên cứu. Xin chân thành cám ơn Bộ Giáo dục Đào tạo và Chương trình trao đổi hợp tác Danida (ENREKA). Bên cạnh đó, cho phép tôi được đặc biệt bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS. TS. Ole LỜI CẢM ƠN Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang iii Vang , người đã hướng dẫn, dạy bảo tôi, luôn tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu trong suốt quãng thời gian tôi ở Đan Mạch. Cho tôi được nói lời cám ơn đến tất cả Thầy Cô, bạn bè ở Lab Molecular Mechanisms of Dietary Components; Khoa Science, Systems and Models; Trường ĐH Roskilde, Đan Mạch đã hướng dẫn những thao tác đầu tiên khi tôi vàoLab cũng như đã tạo nên những tình cảm ấm áp, thân thiện. Tôi cũng xin gửi lời cám ơn đến các bạn du học sinh Việt Nam ở Roskilde; đặc biệt là chị Thảo Trân, Tuyết Phương, Thu An, Như Ngọc, Thành Tâm đã chia sẽ cuộc sống và giúp đỡ tôi như gia đình ở nơi xa xứ. Cho tôi được gửi lời cám ơn đến Thầy Cơ GS. Trần Thanh Vân và học bổng Odon Vallet. Cám ơn các Thầy Cơ Bộ mơn Sinh hóa đã quan tâm tìm hiểu và xét duyệt ngay khi ý tưởng của luận án được hình thành. Trân trọng cám ơn các Thầy Cơ tham gia Hội đồng, Thầy Cơ tham gia phản biện kín đã dành thời gian xem xét, đánh giá cũng như góp ý để luận án được chỉnh chu, hoàn thiện hơn. Cám ơn toàn thể Thầy Cơ đồng nghiệp của tôi tại Khoa Sinh, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, TP. HCM đã dạy dỗ từ những ngày tôi mới chập chững bước vào giảng đường đại học cho đến ngày hôm nay cũng như đã cổ vũ tinh thần và hỗ trợ khi cần thiết để tôi hoàn thành luận án. Đặc biệt xin được cám ơn Cơ Phượng, anh Huy, KPNam đã góp ý và sữa chữa bài vở giúp tôi. LỜI CẢM ƠN Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang iv Cám ơn toàn thể các em đang học tập và làm việc tại phòng Công nghệ Sinh học Thực vật B23. Cho tôi được đặc biệt cám ơn: Lan Anh, Cẩm Tú, Vòng BínhLong, Lưu Ly, Xuân Sơn, Hữu Hoàng, Minh Tuấn, Thanh Minh, Hiền đã hỗ trợ bất cứ lúc nào tôi cần. Gửi lời cám ơn đến: Bích Chiêu, Bích Tuyền, Hoàng Thò Thu, Phương Thy, Thanh Minh, Bích Thùy, Phi Yến, những “người bạn học trò” của Cô đã dốc hết tâm huyết để cùng Cô nghiên cứu luận án này. Gửi lời cám ơn đến các bạn cùng khóa Cao học Sinh hóa K13 đã thường xuyên quan tâm và động viên tôi cho đến giờ phút này. Đặc biệt, cho tôi nói lời cám ơn đến Thiên Hoàng, chò Như, anh Nhứt. Cuối cùng, tôi xin phép được dâng tặng thành quả của công trình này cho gia đình tôi, chỗ dựa vững chắc nhất của tôi trong những năm qua. Cám ơn Ba Mẹ đã tạo mọi điều kiện tốt nhất về vật chất và tinh thần để tôi có thể học tập, nghiên cứu khoa học và đạt được kết quả này. Cám ơn anh chò hai và vợ chồng út đã luôn ở bên cạnh, giúp đỡ, cổ vũ. Gia đình thực sự đã giúp tôi có thể toàn tâm toàn ý với luận án này. Chân thành cám ơn. Quách Ngô Diễm Phương. DANH MỤC Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang v MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i Lôøi caûm ôn ii MỤC LỤC v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU x DANH MỤC BẢNG xiii DANH MỤC HÌNH xvi MỞ ĐẦU 1 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Đặc điểm giống thực vật Drosera 3 1.1.1 Đặc điểm phân loại 3 1.1.2 Đặc điểm phân bố 5 1.1.3 Đặc điểm hình thái 6 1.1.4 Đặc tính sinh học 11 1.1.5 Hiện trạng của Drosera trên thế giới [112] 13 1.1.6 Thành phần hóa học 14 1.1.7 Giá trị và tầm quan trọng 17 1.1.8 Tình hình nghiên cứu 20 1.2 Tăng năng suất thu nhận hợp chất trong nuôi cấy tế bào thực vật 22 1.2.1 Nuôi cấy tế bào thực vật (plant cell cultures) 22 1.2.2 Tối ưu khả năng tích lũy hợp chất của tế bào thực vật 24 DANH MỤC Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang vi 1.2.3 Can thiệp vào con đường sinh tổng hợp hoạt chất 29 2 VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 35 2.1 Nuôi cấy in vitro hai loài Drosera để tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu 35 2.1.1 Vật liệu 35 2.1.2 Phương pháp 35 2.2 Sàng lọc và thu nhận một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn nguyên liệu in vitro của Drosera 38 2.2.1 Các phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học được sử dụng để sàng lọc phân đoạn cao chứa hoạt chất 38 2.2.2 Các bước tiến hành sàng lọc để cô lập hoạt chất từ nguồn nguyên liệu in vitro của hai loài Drosera 41 2.2.3 Kiểm tra hoạt tính sinh học của hợp chất cô lập được 42 2.2.4 Xác định cấu trúc và hàm lượng hợp chất 49 2.2.5 Lựa chọn hợp chất có tiềm năng làm hợp chất đích cho mục tiêu nghiên cứu tăng năng suất thu nhận trên đối tượng này 51 2.3 Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy cây con tái sinh 51 Vật liệu 51 Phương pháp 52 2.3.1 Khảo sát vòng đời in vitro để xác định các giai đoạn tăng trưởng ở Drosera 52 2.3.2 Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất của cây con 52 2.3.3 Khảo sát tác động của NAA lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất của cây con 53 DANH MỤC Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang vii 2.3.4 Khảo sát tác động của việc bổ sung tiền chất lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất của cây con 54 2.3.5 Khảo sát tác động của việc sử dụng chất cảm ứng (elicitor) lên sự tăng trưởng và sự tích lũy hoạt chất 54 2.3.6 Khảo sát tác động cảm ứng của việc gây stress nitrogen lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất 55 2.3.7 Kiểm chứng hiệu quả làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy cây con tái sinh của các kỹ thuật đã khảo sát 55 2.4 Khảo sát ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào 56 Vật liệu 56 Phương pháp 56 2.4.1 Tạo dịch huyền phù tế bào 56 2.4.2 Ứng dụng một số kỹ thuật tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào 59 2.5 Xử lý thống kê 62 3 KẾT QUẢ -THẢO LUẬN 63 3.1 Nuôi cấy in vitro hai loài Drosera để tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu 63 3.1.1 Khử trùng nguyên liệu nuôi cấy 63 3.1.2 Nhân giống bằng chồi bên 63 3.1.3 Nhân giống bằng tạo chồi bất định từ lớp mỏng tế bào 66 3.1.4 Thử nghiệm quy trình nuôi cấy hai bước (Improved 2-step Liquid Culture System) trong việc cải thiện khả năng nhân chồi và phát triển thành cây con hoàn chỉnh [24] 69 3.1.5 Tạo rễ và phát triển cây con hoàn chỉnh 72 DANH MỤC Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang viii 3.2 Sàng lọc và thu nhận một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn nguyên liệu in vitro của Drosera 72 3.2.1 Xử lý mẫu và điều chế các loại cao chiết 72 3.2.2 Sàng lọc và cô lập hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa 74 3.2.3 Sàng lọc và cô lập hợp chất có khả năng ức chế tăng sinh tế bào in vitro 84 3.2.4 Lựa chọn hợp chất có tiềm năng làm hợp chất đích cho mục tiêu nghiên cứu tăng năng suất thu nhận trên đối tượng này 100 3.3 Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy cây con tái sinh 101 3.3.1 Khảo sát vòng đời in vitro để xác định các giai đoạn tăng trưởng của D. burmanii 102 3.3.2 Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin trong cây con tái sinh 104 3.3.3 Khảo sát tác động của NAA lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất 109 3.3.4 Khảo sát tác động của việc bổ sung tiền chất (phenylalanine và tyrosine) lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin 111 3.3.5 Khảo sát tác động của việc sử dụng chất cảm ứng (elicitor) lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất 113 3.3.6 Khảo sát tác động cảm ứng của việc gây stress nitrogen lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất 120 3.3.7 Kiểm chứng hiệu quả làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy cây con tái sinh của các kỹ thuật đã khảo sát 122 3.4 Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào 123 3.4.1 Tạo dịch huyền phù tế bào 123 DANH MỤC Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang ix 3.4.2 Ứng dụng một số kỹ thuật tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào 134 4 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 14 4.1 Kết luận 14 4.2 Đề nghị 1 DANH MỤC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN 15 TÀI LIỆU THAM KHẢO 15 PHỤ LỤC a [...]... cấp hoạt chất có giá trị trị liệu cho ngành dược, luận án: KHẢO SÁT QUY TRÌNH THU NHẬN CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ VIỆC NUÔI CẤY TẾ BÀO HAI LOÀI DROSERA Đã được hình thành với 3 nội dung chính: Thiết lập quy trình vi nhân giống 2 loài Drosera thu hái ở Việt Nam Sàng lọc, thu nhận và xác định một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn nguyên liệu nuôi cấy in vitro của hai loài Drosera Khảo. .. hai loài Drosera Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thu t làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất có tiềm năng trên hệ thống nuôi cấy tế bào in vitro Drosera: Lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp Bổ sung tiền chất Sử dụng những nhân tố cảm ứng con đường sinh tổng hợp (elicitor, stress) Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm giống thực vật Drosera 1.1.1 Đặc điểm... burmanii 19 Bảng 1.6 Những nghiên cứu về nhân giống in vitro giống Drosera .20 Bảng 1.7 Những nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật trong thu nhận hoạt chất từ các loài thực vật cùng họ với Drosera .21 Bảng 2.1 Thử nghiệm quy trình nuôi cấy 2 bước với 2 kiểu nuôi cấy rắn và lỏng 37 Bảng 2.2 Các nghiệm thức được bố trí việc bổ sung hay không bổ sung 2,4-D .61 Bảng 3.1 Ảnh hưởng của... 700nm của các phân đoạn theo phương pháp Yen và Duh (1993) 77 Bảng 3.9 Hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất theo phương pháp FTC 80 Bảng 3.10 Hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất theo phương pháp TBA 81 Bảng 3.11 Tỷ lệ % hoạt tính kháng oxy hóa AI (%) của các hoạt chất khảo sát 82 Bảng 3.12 Tỷ lệ (%) ức chế sự tăng sinh dòng tế bào ung thư ruột kết DLD-1 sau khi cảm ứng 48 giờ của các cao chiết... Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xii DANH MỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các loài Drosera thiên nhiên chứa plumbagin và 7-methyljuglone .15 Bảng 1.2 Các loài Drosera in vitro chứa plumbagin và 7-methyljuglone .15 Bảng 1.3 Các naphthoquinone vi lượng được tách chiết từ Drosera .15 Bảng 1.4 Dược tính và các hoạt tính ứng dụng khác của dịch chiết Drosera 18 Bảng 1.5 Hoạt tính chống thụ thai công bố gần đây... tác động kết hợp của 3 loại hormone 129 Hình 3.50 Dịch huyền phù tế bào được tạo thành từ mô sẹo 131 Hình 3.51 Dịch huyền phù tế bào được tạo thành trực tiếp từ lớp mỏng tế bào 132 Hình 3.52 Tế bào D burmanii bắt màu hồng khi nhuộm TTC .133 Hình 3.53 Đường cong tăng trưởng của các dịch huyền phù tế bào D burmanii có mật độ tế bào ban đầu khác nhau 135 Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xix... cả hai phương pháp FTC và TBA 82 Hình 3.17 Biều đồ thể hiện tỷ lệ % ức chế tăng sinh tế bào DLD-1 của các loại cao chiết 85 Hình 3.18 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ (%) ức chế tăng sinh dòng tế bào DLD-1sau khi cảm ứng 48 giờ của các phân đoạn .86 Hình 3.19 Cô lập và thu nhận hoạt chất B 88 Hình 3.20 Đường cong tăng sinh tế bào DLD-1 theo thời gian dưới ảnh hưởng của hợp chất. .. dược phẩm tổng hợp thường gây ra không ít những tác dụng phụ như giảm khả năng trị liệu, gây độc tố…Do đó, việc nghiên cứu cây cỏ thiên nhiên nhằm tìm ra các hợp chất có giá trị trị liệu để cung cấp thêm nguồn khai thác dược liệu là việc làm hết sức cần thiết Hơn nữa, nghiên cứu áp dụng các kỹ thu t công nghệ sinh học dựa trên các phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro nhằm đảm bảo được một cách chủ động... hợp chất B ở các nồng độ khác nhau .89 Hình 3.21 Biểu đồ thể hiện tỷ lệ ức chế tăng sinh tế bào của hợp chất ở các nồng độ khác nhau (trái: sau 24 giờ cảm ứng, phải: sau 48 giờ cảm ứng) 89 Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xvii DANH MỤC Hình 3.22 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hoạt chất lên kích thước của tế bào DLD-1 92 Hình 3.23 Tế bào DLD-1 dưới ảnh hưởng của hợp chất B sau 48... thiết các hợp chất có giá trị trị liệu là điều mà các nhà khoa học luôn đề cao hàng đầu và đang tích cực hướng đến Drosera, một loài thực vật bắt mồi mang nhiều đặc điểm khác lạ so với các loài thực vật khác: có khả năng cảm ứng; có khả năng tiết ra nhiều loại hợp chất thơm, ngọt ngào để thu hút côn trùng; có nhiều loại enzyme thủy phân để tiêu hóa côn trùng làm nguồn dinh dưỡng…Đặc biệt, chúng có một . HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN oOo QCH NGƠ DIỄM PHƯƠNG KHẢO SÁT QUY TRÌNH THU NHẬN CÁC HP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ VIỆC NUÔI CẤY TẾ. thống nuôi cấy cây con tái sinh của các kỹ thu t đã khảo sát 122 3.4 Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thu t làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào. và thu nhận một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn nguyên liệu in vitro của Drosera 72 3.2.1 Xử lý mẫu và điều chế các loại cao chiết 72 3.2.2 Sàng lọc và cô lập hợp chất có hoạt tính