y học thực hành (762) - số 4/2011 54 Nghiên cứu cặp mồi TH2 trên bệnh phẩm sinh thiết dạ dày để chẩn đoán helicobacter pylori Nguyễn thị hồng hạnh, Nguyễn Thuý Vinh Viện Công Nghệ Sinh học; Bệnh viện Hữu Nghị Tóm tắt Cặp mồi TH2 đã đợc thiết kế nhằm khuếch đại gien HP1125 mã hoá cho một trong số 32 protein màng ngoài của Helicobacter pylori và đợc thử nghiệm trên 113 mẫu ADN tách từ sinh thiết hoặc từ vi khuẩn phân lập từ các bệnh nhân. Độ nhậy và độ đặc hiệu của mồi thiết kế tơng ứng là 99.11% và 100. Các bác sĩ có thể sử dụng trực tiếp các sinh thiết dạ dày để làm PCR không cần nuôi cấy vi khuẩn đòi hỏi thời gian và tốn kém. Trong tơng lai, cặp mồi TH2 có thể đợc sử dụng để chẩn đoán H. pylori. Từ khoá: Helicobacter pylori; gien HP1125; cặp mồi TH2; PCR; độ nhạy; độ đặc hiệu. SUMMARY A set of PCR primers named TH2 was designed and tested on ADN samples of 113 Vietnamese patients to monitor Helicobacter pylori. As shown by the results, the domain located on HP1125 gene appears to be highly conserved. It is amplified successfully in almost all cases. The sensitivity as well as the specificity of PCR method are 99. 11% and 100% respectively. In sum, TH2 primers can be used to detect Helicobacter pylori. Keywords: Helicobacter pylori; gene HP1125; TH2 primers; PCR; Sensitivity; Specificity. Đặt vấn đề Vi khuẩn Helicobacter pylori (H. pylori ) là căn nguyên của các bệnh về dạ dày ở ngời và một số động vật. Trên thế giới cũng nh ở Việt nam, có hơn một nửa số dân c bị nhiễm vi khuẩn HP. Do HP là các vi sinh vật siêu đột biến, nên các dấu ấn phân tử của chúng đợc lựa chọn khác nhau ở các vùng dân c khác nhau trên thế giới. Chẳng hạn, nếu ở phơng Tây, các vi khuẩn HP mang cagA+ status dờng nh liên quan đến các biểu hiện bệnh dạ dày rất nặng nh ung th, thì ở các nớc phơng Đông nh Nhật, Hàn quốc, Trung Quốc, qui luật đó không đợc xem xét [1, 2].Hiện nay, các nhà khoa học ớc tính, H. pylori có thể có đến 32 gien mã hoá cho protein màng ngoài [3]. Các gien của các protein này đợc quan tâm nghiên cứu ở nhiều khía cạnh, trong đó có việc sử dụng chúng làm dấu ấn phân tử để phát hiện vi khuẩn HP [4,5]. Trong bài báo này, chúng tôi thông báo các kết quả khảo nghiệm cặp mồi TH2 để phát hiện vi khuẩn HP. Chúng tôi sử dụng phơng pháp PCR để khuếch đại một vùng bảo thủ trên gien HP1125 của vi khuẩn H. pylori. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân : các bệnh nhân có nhiễm H. pylori theo tiêu chuẩn vàng (hoặc nuôi cấy dơng tính, hoặc cả hai phơng pháp Clotest và mô bệnh học dơng tính) đợc lựa chọn cho nghiên cứu. Tiêu chuẩn loại bệnh nhân: Dừng kháng sinh cha đợc 1 tháng và ức chế bơm proton cha đợc 1 tuần. Tổng số 113 bệnh nhân trong đó có 35 nữ và 78 nam. Tuổi của các bệnh nhân từ 20 đến 82, tuổi trung bình là 47,1. Các bệnh nhân đợc chẩn đoán loét dạ dày và hành tá tràng, đáp ứng các tiêu chuẩn chọn lựa và loại trừ đợc chọn vào nghiên cứu. Lấy sinh thiết: sinh thiết đợc lấy từ 113 bệnh nhân, trong đó 38 mẫu đợc sử dụng trực tiếp để tách chiết ADN trong vòng một vài tiếng sau khi lấy, còn 75 mẫu đợc sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn theo phơng pháp đã công bố [6]. Tách ADN từ sinh thiết: ADN đợc tách từ sinh thiết và từ vi khuẩn theo các phơng pháp đã miêu tả. Phản ứng PCR: Cặp mồi TH2 đợc thiết kế dựa trên trình tự đã biết của gien HP1125 của chủng vi khuẩn chuẩn J99 và 26295. Cặp mồi khuếch đại gien HP1125: Sơ đồ hình 1 chỉ vị trí của mồi trên gien HP1125 của chủng chuẩn J99. Hình 1. Vị trí của cặp mồi TH2 ( F+R) trên gien HP1125 của chủng J99 Cặp mồi TH2 có trình tự nh sau: Th2F: 5- acttgaattccttgatcggattctttgatttc- 3 TH2R: 5-tttaggatccccatggataataagactgtggcc-3 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 94 o C 1 phút 55 o C 50 giây 72 o C 50 giây Lặp lạị 35 chu kỳ Xác định độ nhậy của phản ứng PCR Độ nhậy = số các mẫu dơng tính thật / số các mẫu dơng tính thật + âm tính giả. Độ đặc thù= số mẫu âm tính thật/ số mẫu âm tính thật + dơng tính giả. Kết quả và bàn luận Giới thiệu về bệnh nhân 113 mẫu ADN đợc tách từ sinh thiết và từ vi khuẩn Helicobacter pylori, trong đó số phụ nữ bị nhiễm H. pylori là 35 ngời chiếm 30.97% và nam giới là 78 ngời chiếm 69.03%. Kết quả thống kê cho thấy, bệnh dạ dày do vi khuẩn H. pylori có liên quan chặt chẽ đến độ tuổi và giới tính của các bệnh nhân. ở độ tuổi dới 40 số bệnh nhân bị nhiễm H. pylori chiếm tỷ lệ thấp, sau đó tăng dần ở độ tuổi 41 đến 50, ở độ tuổi trên 50 tuổi số bệnh nhân bị nhiễm H. pylori tăng một cách đột biến chiếm 59.29%. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, ở y học thực hành (762) - số 4/2011 55 bất cứ độ tuổi nào thì số lợng bệnh nhân nam bị nhiễm H. pylori cũng cao số lợng bệnh nhân nữ. Sự liên quan bệnh dạ dày đến độ tuổi, giới tính đợc chỉ ra ở hình 2 và bảng 1 dới đây. Bảng 1. Bệnh dạ dày do vi khuẩn H. pylori theo tuổi và giới Tuổi Giới tính < 30 31- 40 41 - 50 > 50 Tổng Tuổi trung bình % theo giới tính Nam 10 6 12 50 78 55.21 68.75 Nữ 6 7 5 17 35 48.93 31.25 % theo độ tuổi 14.3 11.6 15.2 58.9 Khảo sát cặp mồi TH2 trên 113 mẫu bệnh phẩm Tất cả 113 mẫu ADN sinh thiết đợc tách và làm sạch theo phơng pháp cải tiến đơn giản và dễ áp dụng trong các bệnh viện. Tất cả ADN đều đạt tiêu chuẩn về chất lợng ( hình 3). Chúng đã đợc sử dụng có kết quả trong các phản ứng PCR nhằm phát hiện vi khuẩn H. pylori. Cặp mồi TH2 đợc sử dụng để khuếch đại đầu 5của gien HP1125 trên 113 mẫu ADN. Trên điện di đồ (hình 3), sản phẩm PCR là một băng duy nhất có kích thớc nh mong đợi từ thiết kế là 220 cặp bazơ. Qua khảo sát PCR trên 113 mẫu ADN, cặp mồi TH2 đã tỏ ra có khả năng nhận biết gien HP1125 rất cao, trong đó 112 mẫu ADN cho kết quả PCR dơng tính trên tổng số 113 mẫu ADN nghiên cứu, chiếm tỷ lệ 99,11%. Điều này cũng gián tiếp cho thấy, đoạn gien đợc khuếch đại có tính bảo thủ cao 1 2 3 4 5 6 8 7 9 10 11 12 13 14 15 16 M Hình 3. Điện di đồ một số mẫu ADN tổng số tách từ các chủng vi khuẩn H. pylori. Giếng: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 có một băng ADN tổng số. M là bậc thang ADN chuẩn 100 cặp bazơ. Hình 4. Đầu 5 của gien HP1125 đợc khuếch đại trên mẫu ADN của các bệnh nhân nhiễm khuẩn H. pylori. Giếng: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 có một băng ADN kích thớc 220bp M: Thang chuẩn ADN 100 cặp bazơ. Các kết quả PCR trên 113 mẫu ADN, đợc xử lý bằng chơng trình Excel và thống kê sinh học cho thấy độ nhậy của cặp mồi TH2 thiết kế > 99.11% và độ đặc thù của phản ứng PCR đạt 100%. Bảng 2 dới đây là kết quả PCR của các mẫu ADN nghiên cứu. Bảng 2 : Kết quả PCR nhận đợc khi khảo sát 113 mẫu ADN Chỉ tiêu nghiên cứu Kết quả PCR Số mẫu ADN cho sản phẩm PCR dơng tính thật 112/ 113 Số mẫu AND cho sản phẩm PCR dơng tính giả 0/113 Số mẫu AND cho sản phẩm PCR âm tính thật 1/113 Số mẫu ADN cho sản phẩm PCR âm tính giả 0/113 Độ nhậy của cặp mồi TH2 99,11% Độ đặc thù của cặp mồi TH2 100% Việc phát hiện các nguồn bệnh bằng khuếch đại một số gien đặc trng của vi khuẩn bằng phản ứngPCR là một phơng pháp nhanh, nhậy, chính xác và tơng đối dễ thao tác. Tuy nhiên, vấn đề sẽ khó khăn hơn, nếu các nguồn bệnh có một hệ gienom linh hoạt và luôn thay đổi nh virus HIV, nguyên sinh động vật Trypanosoma, vi khuẩn Helicobacter pyloriTrong những trờng hợp nh vậy, các nhà khoa học bắt buộc phải tìm kiếm các vùng bảo thủ nhất trên hệ gien nhằm đạt một độ nhậy cũng nh độ đặc thù cao cho phải ứng PCR. Trong nghiên cứu của mình, chúng tôi đã may mắn tìm thấy một trong những vùng nh vậy trên gien HP1125 của vi khuẩn. Điều đó giải thích độ nhậy đạt 99,11% cũng nh độ đặc thù cao 100% của phơng pháp. Chúng tôi cho rằng, cặp mồi TH2 có thể sử dụng nhằm chẩn đóan vi khuẩn H. pylori ở Việt Nam. Kết luận: Cặp mồi TH2 đã đợc thiết kế nhằm khuếch đại gien HP1125 mã hoá cho một trong số 32 protein màng ngoài của Helicobacter pylori và đợc thử nghiệm trên 113 mẫu ADN tách từ mảnh sinh thiết dạ dày của bệnh nhân. Độ nhậy và độ đặc hiệu của mồi thiết kế tơng ứng là 99.11% và 100. Cặp mồi TH2 có thể đợc sử dụng để chẩn đoán H. pylori trực tiếp từ các mảnh sinh thiết dạ dày bằng phơng pháp PCR mà không cần nuôi cấy vi khuẩn đòi hỏi thời gian và tốn kém. Tài liệu tham khảo 1. Warburton, V.J., Everett, S., Mapstone, N.P., Axon, A.T and HawkeyP., Dixon, M. F (1998). Clinical and Histological associations of cagA and vacA genotypes in Helicobacter pylori. J. Clin. Pathol. 51{1): 55-61. 2 .Shimoyama, T., Yoshimura, T., Mikami, T., Fukuda, S., Crabtree, J.E., Munakata, A (1998). Evaluation of Helicobacter pylori in Japanese patients with gastric cancer. J. Clin. Pathol. 51(4) : 299- 301. 3 Richard, Alm et al (2000). Comparative Genomic of Helicobacter pylori :Analysis of the outer membrane protein families. Infect and Immu. Vol 68 (7) : 4155- 4167. 4. Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2001). Sử dụng protein màng ngoài HP1125 của vi khuẩn Helicobacter pylori làm kháng nguyên đặc hiệu trong các phân tích 220bp y học thực hành (762) - số 4/2011 56 Western. Đại hội lần thứ 2 Hội nghị khoa học Sinh Y Dợc năm 2001, trang 125-129 . 5. Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2003). Sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp HP1125 để chẩn đoán nhiễm khuẩn Helicobacter pylori. Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống. Báo cáo khoa học. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. Hà Nội 2003. Tr. 889-991. 6. Trần Công Tớc., Trần Quỳnh Hoa., Nguyễn Thị Hồng Hạnh., Nguyễn Vân Phủng và Bùi Phơng Thuân (2000). Sự có mặt của vi khuẩn Helicobacter pylori mang CagA+ trong các sinh thiết dạ dày của ngời Việt Nam. Tạp chí Sinh học 23 (2) : 51-54. 7. Nguyễn Thị Hồng Hạnh và Nguyễn Thị Thanh Lợi (2001). Sự tồn tại của các chủng Helicobacter pylori khiếm khuyết gene urease B ở các bệnh nhân viêm loét và ung th dạ dày Việt Nam. Đại hội lần thứ hai hội nghị khoa học hoá sinh y dợc năm 2001- Các báo cáo khoa học. Trang106 -113. KếT QUả BƯớC ĐầU SINH THIếT XUYÊN THàNH NGựC TRONG CHẩN ĐOáN ĐáM Mờ ở PHổI DƯớI HƯớNG DẫN CủA CHụP CắT LớP VI TíNH TạI BệNH VIệN HữU NGHị TRịNH MạNH HùNG Đặt vấn đề Ung th phi l mt trong nhng bnh thng gp, cú t l mc v t vong ng u trong cỏc bnh v ung th. Vic chn oỏn mụ bnh hc cú ngha vụ cựng quan trng trong vic iu tr v tiờn lng bnh. Soi ph qun (SPQ) l mt phng phỏp hu ớch khi nhỡn thy c tn thng ly bnh phm lm xột nghim. Tuy nhiờn rt nhiu trng hp SPQ khụng gúp phn vo vic chn oỏn bnh, lỳc ny sinh thit xuyờn thnh ngc (STXTN) l mt bin phỏp lớ tng trong vic tip cn khi u. STXTN ó c tin hnh nhiu nc trờn th gii v th hin c nhiu u im. Ti bnh vin Hu ngh H Ni, k thut ny c trin khai t nm 2006 bng kim Chiba, sau ú t nm 2008 bng kim Tro-cut cú kh nng ly mnh t chc rt tt. Sau 1 nm nghiờn cu chỳng tụi thc hin ti ny vi mc tiờu sau: - ỏnh giỏ kt qu bc u ca STXTN trong chn oỏn ỏm m phi di hng dn ca chp ct lp vi tớnh (CLVT). - Xõy dng quy trỡnh k thut. I TNG, PHNG PHP NGHIấN CU: 1. i tng nghiờn cu: 30 ngi bnh c iu tr ti Bnh vin Hu ngh cú chn oỏn ỏm m phi trờn ct lp vi tớnh. 1.1. Tiờu chun chn ngi bnh : - Cú tn thng hỡnh ỏm m ngoi vi trờn phim chp CLVT. - Tt c tn thng hỡnh ỏm m khỏc trờn CLVT m SPQ khụng thy khi u trong lũng ph qun, xột nghim gii phu bnh qua SPQ khụng giỳp ớch cho chn oỏn. - Ngi khụng cú chng ch nh vi STXTN. 1.2. Tiờu chun loi tr bnh nhõn: Ri lon ụng cm mỏu. iu tr chng ụng.Tng ỏp lc ng mch phi nng. Suy hụ hp, suy tim, ang th mỏy. Kộn khớ ln cnh khi u. Ct thựy phi bờn i din khi u. Nghi tn thng u mch. Nghi ng nang nc. Ngi bnh khụng kt hp. 2. Thit k nghiờn cu: Nghiờn cu mụ t, tin cu 3. Phng phỏp tiờn hnh: 3.1. Chun b ngi bnh : - Gii thớch cho ngi bnh v gia ỡnh ngi bnh v s cn thit tin hnh k thut ng thi kớ vo giy ng ý lm th thut. - Trc khi tin hnh k thut phi cú phim chp phi thng nghiờng, phim chp CLVT, xột nghim cụng thc mỏu, ụng mỏu c bn. - K thut c tin hnh ti phũng chp CLVT. - Ngi bnh c nm sp, nghiờng hay nga tựy thuc vo v trớ khi u hay l s thun li i vi th thut viờn. 3.2. Chun b dng c: - Kim sinh thit. - Dao phu thut. - Kim tiờm cỏc loi, bm tiờm 50ml. - L ng bnh phm, lam kớnh. - Sng cú l v khụng l, bong cn, gc, ỏo th thut, m, khu trang. - Thuc gõy tờ ti ch: Lidocain hoc Novocain. 3.3. Phng phỏp tin hnh: nh v v trớ chc trờn CLVT, o khong cỏch t khi u n mt da, o gúc to bi gia mt phng ngang v hng kim. Sỏt khun v trớ chc khong 20 cm. Tri sng cú l lờn v trớ sinh thit. Gõy tờ ti ch. Tin hnh sinh thit: Chc kim sinh thit vo v trớ ó c nh v: sõu, gúc. Chp CLVT li xỏc nh v trớ u kim sinh thit. Khi u kim sinh thit vo v trớ khi u, tin hnh sinh thit ly 1-2 mnh t chc. Hỡnh nh tin hnh sinh thit 3.4. Theo dừi v x trớ tai bin: - Khi sinh thit xong chp CLVT li mt ln na kim tra tai bin sau quỏ trỡnh sinh thit: chy mỏu, trn khớ mng phi. - Sau 4h cn chp phim X quang thng kim tra li tai bin mt ln na. - Ngi bnh cn thit phi c theo dừi trong 24h phỏt hin kp thi nhng tai bin mun cú th xy ra. KT QU NGHIấN CU V BN LUN: - Phõn b ngi bnh theo tui: Bng 1 Tui S lng T l % 50 59 5 16,6 60 69 8 26,6 70 79 15 50 80 2 6,8 Tng s 30 100 Tui cao nht: 82, tui thp nht: 54 Trong 30 trng hp cú ỏm m trờn CLVT, la tui chỳng tụi hay gp nht tui t 60-79, õy l im c trng ca Bnh vin Hu ngh a phn iu tr cho ngời bnh cao tui. 1. Phõn b ngi bnh theo gii: . 54 Nghiên cứu cặp mồi TH2 trên bệnh phẩm sinh thiết dạ dày để chẩn đoán helicobacter pylori Nguyễn thị hồng hạnh, Nguyễn Thuý Vinh Viện Công Nghệ Sinh học; Bệnh viện Hữu Nghị Tóm tắt Cặp. tơng lai, cặp mồi TH2 có thể đợc sử dụng để chẩn đoán H. pylori. Từ khoá: Helicobacter pylori; gien HP1125; cặp mồi TH2; PCR; độ nhạy; độ đặc hiệu. SUMMARY A set of PCR primers named TH2 was. ngoài của Helicobacter pylori và đợc thử nghiệm trên 113 mẫu ADN tách từ mảnh sinh thiết dạ dày của bệnh nhân. Độ nhậy và độ đặc hiệu của mồi thiết kế tơng ứng là 99.11% và 100. Cặp mồi TH2 có