Y học thực hành (807) - số 2/2012 41 ứNG DụNG Kỹ THUậT SINH THIếT Và CHẩN ĐOáN MộT Số BấT THƯờNG Số LƯợNG NHIễM SắC THể CủA PHÔI SAU Rã ĐÔNG TRONG QUY TRìNH THụ TINH TRONG ốNG NGHIệM Vũ Bích Thụy, Hoàng thị Diễm Tuyết, Nguyễn Khắc Hân Hoan, Phạm Việt Thanh, Dơng Quốc Trọng Tóm tắt Mục tiêu: Xác định tỉ lệ phôi sống sau sinh thiết và tỉ lệ bất thờng số lợng nhiễm sắc thể ở phôi sau rã đông tạo ra từ phơng pháp bơm tinh trùng vào bào tơng trứng, chủ yếu là các bất thờng NST 13, 18, 21, X, Y. Thiết lập quy trình hoàn chỉnh về chẩn đoán bất thờng số lợng nhiễm sắc thể của phôi TTTON tại Khoa Hiếm Muộn và Khoa Di truyền Bệnh viện Từ Dũ. Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu tiền cứu Địa điểm nghiên cứu: Khoa Hiếm muộn và khoa Di truyền Bệnh Viện Từ Dũ Đối tợng nghiên cứu: Các phôi thụ tinh trong ống nghiệm bằng phơng pháp ICSI và đợc trữ bằng phơng pháp trữ chậm vào ngày 2 của giai đoạn phát triển tại BV Từ Dũ (Phôi đợc bệnh nhân đồng ý tham gia vào nghiên cứu). Kết quả: Có 48/155 (31%) phôi sau rã đông thỏa điều kiện chọn vào mẫu nghiên cứu. Sau khi sinh thiết, có 91% (41/44) phôi bào đợc thực hiện lai huỳnh quang tại chỗ FISH. Phôi sau sinh thiết đợc nuôi cấy và đánh giá hình thái sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Có 95.83% (46/48) phôi sống sau sinh thiết và 56,52% (26/46) phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang và thoát màng. Kết quả lai huỳnh quang tại chỗ (Fluorescence in situ hybridization, FISH) cho thấy có 21,05% (4/19) phôi bình thờng về 5 NST 13, 18, 21, X, Y. Tỉ lệ phôi có số lợng bình thờng NST 13, 18, 21 lần lợt là 74,29% (26/35), 81,08% (30/37) và 80% (28/35). Kết luận:Quy trình thực hiện chẩn đoán di truyền phôi trớc làm tổ tại BV Từ Dũ bớc đầu mang lại kết quả. Tỉ lệ phôi sau rã đông có số lợng NST 13, 18, 21, X, Y đợc ghi nhận là 21.05%. Mặc dù một số khâu trong quy trình cần đợc hoàn thiện để nâng cao hiệu quả chẩn đoán, bớc đầu quy trình thực hiện PGD ở phôi giai đoạn phân cắt (ngày 3) đợc thiết lập và mang lại giá trị chẩn đoán bất thờng di truyền cho phôi TTTON. Từ khóa: phôi sống sau sinh thiết, bất thờng số lợng nhiễm sắc thể, phôi sau rã đông summary Objective: To evaluate survival rate of biopsied embryos and aneuploidy rate of the chromosome 13, 18, 21, X, Y of the blastomeres of the frozen embryos, which were created by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). And to establish preimplantation genetic diagnosis process in IVF Department and Genetics Department of TuDu Hospital. Design: Prospective study. Materials and Methods: Frozen day-2-embryos using a slow cooling procedure were consent to research. Following thawing, embryos were cultured for 24 hours. The embryos which further divided and had more than 6 blastomeres with less than 20% of fragmentation were selected to the study. One blastomere of each selected embryo was biopsied for FISH analysis. Laser was used to open an approximately 30 m window on the zona pellucida. Biopsied embryos were further cultured to the blastocyst stage (72h later). The quality of embryos post biopsy was monitored by standard morphological observations. The blastomeres were fixed by Carnoys fixative, then MultiVysion PGT and Vysis HYBrite denaturation/hybridization system (ABBOTT, Germany) were uses in FISH examinations. Results:Of 155 frozen-thawed embryos, 48 embryos met the selection criteria for further analysis. There were 95.83% (46/48) embryos survived after the biopsy procedure, of these 46 embryos, 56.52% (26/46) embryos developed to hatching/hatched embryos. Of the 91% (41/44) blastomeres were examined by FISH, 21.05% (4/19) embryos were euploid of all chromosome 13, 18, 21, X, Y. The percentage of euploid embryos of each pair of the chromosome 13, 18, 21, X, Y were 74.29% (26/35), 81.08% (30/37) and 80% (28/35) respectively. Conclusion:Freezing and thawing of embryos followed by blastomere biopsy did not appear to affect subsequent embryo development or embryo quality. The percentage of frozen-thawed euploid embryos of all chromosomes 13, 18, 21, X, Y were 21.05%. Further optimisation of the FISH technique on a larger number of embryos is necessary before clinical implementation of preimplantation genetic screening into our IVF program can be approved. Đặt vấn đề Chơng trình thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON) đợc triển khai tại Việt Nam từ năm 1998 đến nay cả nớc đã có hơn 9.000 đứa trẻ ra đời với tỉ lệ thành công dao động từ 26,9% đến 45% (Khoa Hiếm Muộn, BV Từ Dũ 2009-2011). Có nhiều yếu tố ảnh hởng đến sự thành công trong TTTON nh chất lợng của môi trờng và các thành phần trong tử cung ngời phụ nữ, hay chất lợng của phôi đợc tạo nên trong môi trờng TTTON. Đánh giá chất lợng phôi TTTON qua hình thái phôi là phơng pháp đợc sử dụng nhiều nhất trong quy trình này nhằm chọn lựa phôi đạt chất lợng tốt để chuyển vào buồng tử cung của ngời phụ nữ. Tuy nhiên, nếu chỉ dựa vào các tiêu chuẩn đánh giá hình thái thì không thể phát hiện phôi mang bất thờng về số lợng hay cấu trúc nhiễm sắc thể. Do vậy, làm sao để tối u hóa việc chọn lọc phôi TTTON là một trong những chiến lợc đợc quan tâm nhiều nhất hiện nay. Kỹ thuật chẩn đoán di truyền phôi trớc làm tổ (Preimplantation Genetic Diagnosis, PGD) lần đầu tiên Y học thực hành (807) - số 2/2012 42 đợc thực hiện vào năm 1988 bởi Handyside va cộng sự bằng cách dùng phản ứng kéo dài chuỗi DNA (Polymerase Chain Reaction, PCR) để khuếch đại một trình tự nucleotide trên nhiễm sắc thể Y để phân biệt giới tính phôi thai cho bệnh nhân mang bệnh liên kết với NST X. PGD giúp xác định tình trạng bất thờng NST hoặc đột biến gen của phôi trớc khi quyết định chuyển phôi vào buồng tử cung. Bệnh nhân cần đợc thực hiện quy trình TTTON để có phôi sử dụng trong chẩn đoán di truyền. Mẫu sinh thiết có thể là thể cực của trứng, phôi bào của phôi ở giai đoạn phân cắt hay các tế bào nuôi của phôi nang. Mẫu vật đợc lai huỳnh quang tại chỗ (Fluorescence in situ hybridization, FISH) để phân tích số lợng và cấu trúc NST hay mẫu vật có thể đợc phản ứng kéo dài chuỗi DNA (Polymerase Chain Reaction, PCR) để phát hiện các bất thờng đơn gen. Phôi mang kết quả di truyền bình thờng sau đó sẽ đợc chuyển vào buồng tử cung của bệnh nhân. PGD thờng đợc áp dụng trên nhóm bệnh nhân lớn tuổi, điều trị TTTON thất bại nhiều lần, sẩy thai liên tiếp, BN mang bất thờng cấu trúc NST dạng khảm hay chuyển đoạn, hay mang đột biến đơn gen. Các bất thờng di truyền này có thể làm cho phôi không làm tổ đợc, sẩy thai hoặc hình thành thai mang bệnh di truyền hoặc dị tật bẩm sinh. Ngày nay, việc chọn phôi có số lợng NST bình thờng bằng PGD để chuyển vào buồng tử cung đã trở nên phổ biến tại nhiều trung tâm trên thế giới giúp cải thiện tỉ lệ làm tổ, tăng tỉ lệ có thai, và giảm số lợng phôi cần phải chuyển dẫn đến giảm tỉ lệ đa thai. Tuy nhiên, đến nay quy trình thực hiện PGD vẫn cha đợc triển khai tại Việt Nam. ứng dụng PGD để tầm soát các bất thờng di truyền là một trong những trọng tâm phát triển của Bệnh viện Từ Dũ. Đây là đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ, do Tổng Cục Dân Số- Kế Hoạch hóa gia đình quản lý và đợc thực hiện bởi Khoa hiếm Muộn và Khoa Di truyền Bệnh viện Từ Dũ. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm đánh giá ảnh hởng của PGD trong khảo sát bất thờng số lợng NST 13, 18, 21, X, Y lên khả năng phát triển phôi và góp phần hoàn chỉnh qui trình PGD tại Việt Nam. Mục tiêu nghiên cứu: Xác định tỉ lệ phôi sống sau sinh thiết và tỉ lệ bất thờng số lợng nhiễm sắc thể ở phôi sau rã đông tạo ra từ phơng pháp bơm tinh trùng vào bào tơng trứng, chủ yếu là các bất thờng NST 13, 18, 21, X, Y. đối tợng và Phơng pháp nghiên cứu Phơng pháp nghiên cứu: Đây là nghiên cứu tiền cứu nhằm đánh giá hiệu quả của việc ứng dụng kỹ thuật mới trong quy trình TTTON, đợc thực hiện từ tháng 02/2010 đến tháng 06/2011 Đối tợng nghiên cứu: Nghiên cứu đợc thực hiện trên các phôi trữ lạnh của các cặp vợ chồng tiến hành thụ tinh trong ống nghiệm bằng phơng pháp bơm tinh trùng vào bào tơng trứng tại Khoa Hiếm Muộn Từ Dũ (2002-2010) và đồng ý hiến phôi cho mục đích nghiên cứu khoa học. Cỡ mẫu: Tỉ lệ bất thờng số lợng NST ở phôi dao động từ 32.1-70.7%. Do vậy, ớc tính tỷ lệ bất thờng NST của phôi ớc tính tối đa là 71%. Chọn tỷ lệ bất thờng NST của phôi mong muốn là 50%. Độ tin cậy 95% và độ chính xác mong muốn không quá 10%. áp dụng công thức tính cỡ mẫu và xác định đợc n = 45. Phơng pháp tiến hành Đối tợng nghiên cứu đợc chọn là các phôi trữ lạnh của các cặp vợ chồng điều trị bằng phơng pháp TTTON IVF/ICSI trong khoảng thời gian từ năm 2002 đến năm 2010 tại BV Từ Dũ. Toàn bộ số phôi này đã đợc trữ bằng phơng pháp trữ chậm với môi trờng 1,2-propanediol ở giai đoạn phôi phân cắt ngày 2 (4-6 phôi bào). Sau khi rã đông, phôi sống đợc xác định khi có trên 75% phôi bào sống. Sau đó các phôi này đợc cấy trong môi trờng nuôi cấy phôi G-1 Plus (Vitrolife, Sweden) ở 37 o C, 6% CO 2 , 5% O 2 . Sau 24 giờ nuôi cấy, hình thái phôi đợc đánh giá lại dựa theo tiêu chuẩn của Gerris et al trong đánh giá phôi giai đoạn phân cắt vào ngày 3. Phôi đợc chọn vào nghiên cứu khi thỏa điều kiện tăng ít nhất 1 phôi bào sau 24 giờ nuôi cấy, có 6 phôi bào và tỉ lệ phân mảnh dới 20%. Trớc khi sinh thiết, phôi đợc ủ trong môi trờng không có canxi/magné (G-PGD TM , Vitrolife Sweden) trong 10 phút ở 37 o C. Quy trình sinh thiết đợc thực hiện trên kính hiển vi đảo ngợc (Nikon, US) và hệ thống vi thao tác. Hệ thống laser ZILOS-tk (Hamilton Thorne, UK) và phần mềm ZILOS-tk đợc sử dụng để mở cửa sổ màng zona có kích thớc 30-40m. Kim sinh thiết (Conception Technologies-CA) đợc dung để lấy 1 phôi bào ra từ mỗi phôi. Phôi sau sinh thiết sẽ đợc nuôi cấy trong môi trờng G-2 Plus (Vitrolife, Sweden) ở 37 o C, 6% CO 2 , 5% O 2 và đợc đánh giá hình thái sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ (ngày 4, 5, 6) dựa trên tiêu chuẩn của Gardner và Schoolcraft. Phôi bào sau đó đợc cố định trên lam bằng dung dịch Carnoys (3 methanol:1 acid acetic). Lam sau đó đợc thực hiện lai huỳnh quang tại chỗ (Fluorescence in situ hybridization, Vysis MultiVysion PGT, Abbott, Đức) để chẩn đoán bất thờng di truyền về số lợng NST 13, 18, 21, X, Y. Quy trình thực hiện gồm các bớc chính sau: (1) Xử lý lam trớc khi lai bằng dung dịch ethanol 70%, 90% và 100% trong 2 phút, (2) xử lý đoạn dò (probe) và lai ở 37 o C trong tối thiều 4 giờ, (3) Rửa lai trong dung dịch SSC và quan sát dới kính hiển vi Carl Zeiss, Meta system (UK). Số lợng NST của phôi bào đợc xác định bởi số lợng tín hiệu màu sắc sau: NST 13, cho tín hiệu màu đỏ, NST 18 cho tín hiệu màu xanh biển, NST 21 cho tín hiệu màu xanh lục, NST X cho tín hiệu màu xanh dơng, NST Y cho tín hiệu màu vàng. Hiệu quả của quy trình lai đợc kiểm chứng bởi lam chứng (MultiVysion, CEP probes (Abbott). ở mỗi chu kỳ lai huỳnh quang tại chỗ. Kết quả Có 24 cặp vợ chồng đồng ý hiến 155 phôi trữ lạnh cho nghiên cứu. Sau khi rã đông, có 85/155 (54.83%) phôi sống và đợc nuôi cấy trong 24 giờ. Trong đó chỉ có 48/85 (56.47%) phôi đợc chọn vào nghiên cứu vì thỏa điều kiện chọn vào mẫu nghiên cứu Kết quả sinh thiết phôi và nuôi cấy phôi Y học thực hành (807) - số 2/2012 43 Đặc điểm phôi sinh thiết đợc tóm tắt ở Bảng 1. Trong đó có 12.50% (6/48) phôi có trên 8 phôi bào và 29.17% (14/48) phôi đợc sinh thiết có tỉ lệ phân mảnh < 5%. Sau khi sinh thiết, có 91% (41/44) phôi bào đợc thực hiện lai FISH, do có 1 phôi bào vỡ sau sinh thiết và 3 phôi bào mất trong quá trình cố định. Thời gian sinh thiết 1 phôi trung bình là 192 giây trung bình là 139.30 giây/phôi (R 101-182, SD 25.50). Đờng kính trong của cửa sổ màng zona trung bình là 25.25m (R20.50-30, SD 6.71) và đờng kính ngoài trung bình là 29.53m (R21.36-37.7 SD 11.55). Sau sinh thiết, toàn bộ số phôi đợc nuôi cấy và đánh giá hình thái sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Kết quả đợc tóm tắt trong Bảng 3. Kết quả cho thấy 95.83% (46/48) phôi sống sau sinh thiết (phôi sống khi 24 giờ sau sinh thiết, phôi tăng ít nhất 1 phôi bào), trong đó 56.52% (26/46) phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang và thoát màng. Bảng 1: Đặc điểm phôi sinh thiết Số lợng Tỉ lệ % 6 pb 32/48 66.67 7 pb 10/48 20.83 8 pb 6/48 12.50 Số phôi bào (pb) Tổng 48 100.00 Số lợng Tỉ lệ % < 5 14/48 29.17 5 10 22/48 45.83 15-20 12/48 25.00 Tỉ lệ phân mảnh của phôi (%) Tổng 48 100.00 Bảng 2: Đặc điểm nhân phôi bào sau cố định Số lợng Tỉ lệ % Rõ Cô đặc Rõ Cô đặc Nhân pb quan sát đợc 31/44 13/44 70.45 29.55 Rõ Không rõ Rõ Không rõ Quan sát nhân phôi bào (pb) trớc lai Viền pb quan sát đợc 20/44 24/44 45.45 54.55 Có Không Có Không Quan sát nhân phôi bào sau lai Tín hiệu quan sát đợc 41/44 3/44 85.42 6.25 Bảng 3: Đánh giá phôi phát triển sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ sau sinh thiết Số lợng Tỉ lệ % Phôi sống 46/48 95.83 Phôi nang thoát màng zona 26/46 56.52 Phôi ngừng phát triển ở giai đoạn phân cắt 9/46 19.57 Phôi ngừng phát triển ở giai đoạn nén 6/46 13.04 Phôi ngừng phát triển ở giai đoạn phôi nang 5/46 10.87 Kết quả lai huỳnh quang và chẩn đoán di truyền Hiệu quả của quy trình lai đợc kiểm chứng bởi lam chứng (MultiVysion, CEP probes (Abbott). Kết quả cho thấy 100% chu trình lai cho kết quả tín hiệu với toàn bộ 5 NST 13, 18, 21, X, Y. Tổng hợp kết quả cho thấy có 53.66% (19/41) phôi không có kết quả di truyền ít nhất 1 cặp NST 13, 18, 21, hay X, Y, còn lại là 21.05% (4/19) phôi bình thờng về 5 NST 13, 18, 21, X, Y (Bảng 4). Bảng 4: Kết quả phân tích di truyền về số lợng NST Số lợng Tỉ lệ % Không có kết quả (-,-) Jun-41 14.63 Đơn bội (13,-) Mar-35 8.57 Tam bội (13, 2x 13) Apr-35 11.43 NST 13 Bình thờng (13,13) 28/35 80 Không có kết quả (-,-) Apr-41 9.76 Đơn bội (18,-) Apr-37 10.81 Tam bội (18, 2x18) Mar-37 8.11 NST 18 Bình thờng(18,18) 30/37 81.08 Không có kết quả (-,-) Jun-41 14.63 Đơn bội (21,-) May- 35 14.29 Tam bội (21, 2x 21) Apr-35 11.43 NST 21 Bình thờng (21,21) 26/35 74.29 Không có kết quả (-,-) 19/41 46.34 Có 2 NST giới tính (X,X) (X,Y) 16/22 72.73 Có 1 NST giới tính (X,-) (Y,-) 22- May 22.73 NST giới tính (X, Y) Có 3 NST giới tính (XXY) (XYY) (XXX) (YYY) 22-Jan 4.55 Bàn luận Quy trình sinh thiết và nuôi cấy phôi Quá trình sinh thiết để chẩn đoán di truyền trớc làm tổ trong nghiên cứu này đợc thực hiện ở giai đoạn phân cắt của phôi (ngày thứ 3 sau thụ tinh) Quy trình sinh thiết chung bao gồm việc sử dụng kính hiển vi đảo ngợc đợc gắn hệ thống vi thao tác để cố định mẫu vật, mở cửa sổ màng zona pellucida, dùng kim sinh thiết để lấy mẫu vật ra khỏi trứng hay phôi. Sau đó trứng hay phôi sẽ tiếp tục đợc nuôi cấy, mẫu vật đợc cố định để chẩn đoán di truyền. Trớc khi sinh thiết, phôi đợc ủ trong môi trờng không có canxi/magné (G-PGD TM , Vitrolife Sweden) trong 10 phút ở 37 o C. Kết quả nghiên cứu của Dumoulin và cs (1998) cho thấy thời gian ủ phôi trong môi trờng này quá lâu sẽ làm ảnh hởng đến sự phát triển tiếp theo của phôi. Thời gian ủ phôi trong nghiên cứu này đợc giới hạn (dới 10 phút) và phôi đợc rửa sạch nhiều lần trớc sinh thiết. Sau đó phôi đợc chuyển qua đĩa sinh thiết để mở cửa sổ màn zona pellucida. Đây là phơng pháp tạo một lỗ ở màng bao ngoài của phôi (zona pellucida) và từ vị trí ấy, kim sinh thiết đợc đa vào bên trong phôi để lấy mẫu vật ra ngoài. Nghiên cứu này dùng tia laser để mở cửa sổ màng zona, đây đợc xem là phơng pháp đơn giản. dễ sử dụng nhất. Tuy nhiên, hiệu quả lâm sàng cũng nh ảnh hởng đến sự phát triển của phôi khi dùng tia laser so với dùng phơng pháp cơ học hay acid tyrode phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm, kỹ năng cũng nh sự khéo léo của ngời thực hiện. Đờng kính trong trung bình và đờng kính ngoài trung bình của cửa sổ màng zona trong nghiên cứu của chúng tôi là 25.25 m (R 20,50-30, SD 6,71) và 29,53 m (R 21,36-37,7 SD 11,55). Nếu cửa sổ màng zona mở quá to, toàn bộ phôi sẽ có nguy cơ thoát ra ngoài Y học thực hành (807) - số 2/2012 44 khi thao tác trên phôi hay chuyển phôi. Ngợc lại, nếu cửa sổ quá nhỏ, nguy cơ song thai cùng trứng sẽ tăng. Alikani và cs (2003) báo cáo tỷ lệ song thai cùng trứng ở những ca thực hiện phơng pháp hỗ trợ phôi thoát màng là 0,55% (P < 0,05). Tuy nhiên, số liệu thống kê của Cochrane 2003 từ 23 thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có đối chứng cho thấy cha có mối tơng quan rõ ràng giữa song thai cùng trứng và kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng. Do vậy, nguyên nhân của sự gia tăng tỷ lệ có thai là do bản thân quá trình TTTON (kích thích buồng trứng, môi trờng nuôi cấy phôi) hay do tác động lên màng zona cần đợc xác định qua nhiều thực nghiệm lâm sàng hơn. Nhiều nghiên cứu trong vòng 20 năm qua cho thấy quá trình sinh thiết 1 phôi bào không làm ảnh hởng đến khả năng làm tổ cũng nh sự phát triển của các em bé sinh ra từ phơng pháp TTTON. Nghiên cứu chúng tôi thực hiện sinh thiết 1 phôi bào/phôi và có tỉ lệ phôi bào sống và tiếp tục phân cắt sau sinh thiết là 95,83% (46/48), 2 phôi bào chết sau sinh thiết do là phôi có chất lợng xấu, có 6 phôi bào/phôi và có tỷ lệ phân mảnh 20%. Trong 46 phôi sống này, có 56,52% (26/46) phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang và thoát màng khi đánh giá hình thái phôi sau 72 giờ sinh thiết, có 19,57% (9/46 phôi ngừng phát triển ở gia đoạn phân cắt, 13,04% (6/46) phôi ngừng phát triển ở gia đoạn nén và 10,87% (5/46) phôi không thoát màng. Kết quả của chúng tôi tơng đối phù hợp khi so sánh với kết quả trong nghiên cứu của Goossen và cs (2008) công bố tỷ lệ hình thành phôi nang sau sinh thiết 1 phôi bào/phôi là 51,6% (829/1608 phôi). Tỉ lệ bất thờng NST Theo nghiên cứu của Magli và cs (2007) khi sinh thiết 4665 phôi để thực hiện PGD-FISH, phôi có 8 phôi bào vào ngày sinh thiết (ngày 3) cho tỉ lệ bất thờng số lợng NST thấp nhất (48%), so với tỉ lệ bất thờng số lợng NST của phôi có 7 phôi bào là 56% và phôi có 6 phôi bào là 71% (Hình 1). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy có 21.05% (4/19) phôi bình thờng về 5 NST 13, 18, 21, X, Y (Bảng 4) ở cả 3 nhóm phôi có 6,7, hay 8 phôi bào vào ngày sinh thiết. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tơng đối phù hợp với nghiên cứu trên, tuy nhiên số lợng mẫu phôi bào chẩn đoán di truyền còn quá ít và cần đợc thực hiện nghiên cứu thêm trong tơng lai nhằm xác định tỉ lệ bất thờng 5 NST 13, 18, 21, X, Y ở phôi TTTON. Hình 1: Bất thờng số lợng NST tơng ứng với các giai đoạn phát triển của phôi có 5 phôi bào quan sát lúc 62 giờ sau thụ tinh. Nghiên cứu của chúng tôi cho kết quả phôi mang số lợng bình thờng NST 13, 18, 21 lần lợt là 74,29% (26/35), 81,08% (30/37) và 80% (28/35). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu PGD của Jennifer và cs (2009) tại Boston IVF thực hiện trên 703 phôi TTTON của 99 bệnh nhân báo cáo tỉ lệ phôi có số lợng NST 13 bình thờng dao động từ 76-79%, tỉ lệ phôi có số lợng NST 18 bình thờng là 70-81% và tỉ lệ phôi có số lợng NST 21 bình thờng là 22-23%. Hạn chế của nghiên cứu chúng tôi là lợng mẫu thu thập còn quá ít (48 phôi bào đợc sinh thiết). Vấn đề thuyết phục bệnh nhân đồng ý hiến phôi cho nghiên cứu thực sự rất khó khăn và phải thông qua nhiều bớc thủ tục hành chính. Đồng thời, toàn bộ các phôi bệnh nhân hiến là những phôi đợc trữ lạnh bằng phơng pháp trữ chậm trong thời gian từ 2-10 năm cũng là yếu tố cản trở làm giảm đi nguồn phôi bệnh nhân hiến tặng và phôi thỏa điều kiện đợc chọn vào nghiên cứu. Bên cạnh đó, kỹ thuật FISH trong PGD thực hiện chỉ trên một phôi bào duy nhất. Đây là một kỹ thuật cao, đòi hòi ngời thực hiện di truyền có nhiều kinh nghiệm chuyên môn trong quy trình thực hiện và phân tích kết quả. Trong bớc đầu thực hiện này, tỉ lệ phôi bào không có kết quả di truyền của chúng tôi còn tơng đối cao, dao động từ 9,76-14,63% cho các NST 13, 18, 21. Tuy nhiên, với điều kiện con ngời và cơ sở vật chất hiện tại của khoa Hiếm Muộn và Khoa Di truyền BV Từ Dũ, những nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn và chẩn đoán nhiều NST hơn sẽ đợc thực hiện trong tơng lai không xa nhằm có đợc kết quả chẩn đoán PGD chính xác hơn cho bệnh nhân. Kết luận Phơng pháp chẩn đoán di truyền trớc làm tổ nhằm giúp lựa chọn phôi không mang một số bất thờng di truyền xác định. Sinh thiết và chẩn đoán di truyền là hai quá trình quan trong trong chẩn đoán di truyền trớc làm tổ. Nghiên cứu của chúng tôi chứng minh đợc quá trình sinh thiết phôi không ảnh hởng đến sự phát triển tiếp theo của phôi. 56.52% phôi sau sinh thiết vẫn phát triển tiếp đến giai đoạn phôi nang và có thể sử dụng để chuyển vào buồng tử cung sau khi đợc chẩn đoán không mang bất thờng di truyền xác định. Nghiên cứu này cũng xác đinh đợc tỉ lệ phôi trữ-rã TTTON có số lợng NST 13,18, 21, X, Y bình thờng là 21.05%. Quy trình chẩn đoán PGD tại khoa Hiếm Muộn và khoa Di Truyền BV Từ Dũ đợc xây dựng hoàn chỉnh và mang lại ý nghĩa thiết thực cho nhóm bệnh nhân lớn tuổi, điều trị TTTON thất bại nhiều lần, sẩy thai liên tiếp, BN mang bất thờng cấu trúc NST dạng khảm hay chuyển đoạn, hay mang đột biến đơn gen. Triển khai thành công qui trình PGD sẽ góp phần thúc đẩy sự phát triển của lĩnh vực hỗ trợ sinh sản tại Việt Nam, nắm bắt đợc sự tiến bộ khoa học trên thế giới, đa các kỹ thuật chẩn đoán di truyền hiện đại ứng dụng trong y học, chủ động loại bỏ các bất thờng về di truyền. Điều này mang ý nghĩa rất lớn trong việc loại bỏ các gen xấu trong cộng đồng và nâng cao chất lợng dân số của Việt Nam. Y học thực hành (807) - số 2/2012 45 TàI LIệU THAM KHảO 1. Blake D, Proctor M, Johnson N and Olive D (2005) Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted conception. Cochrane Database Syst Rev 2: CD002118 2. Sandalinas M, Sadowy S, Alikani M, et al. Developmental ability of chromosomally abnormal human embryos to develop to the blastocyst stage. Hum Reprod 2001; 16: 19548. 3. Handyside A.H., Kontogianni E.H., Hardy K., Winston R.M., 1990. Pregnancies from biopsied human embryos sexed by Y-specific DNA amplification. Nature 344, 768770. 4. Joyce C. Harper, Preimplantation Genetic Diagnosis 2nd Edition, Edited by Joyce Harper University College London, Cambridge University Press 5. Richard A, Anderson, Sue P. 2008 The current status of preimplantation genetic screening: British Fertility Society Policy and Practice Guidelines. Human Fertility 11:2, 71-75 6. Pellicer A, Rubio C, Vidal F et al. 1999 In vitro fertilization plus preimplantation genetic diagnosis in patients with recurrent miscarriage: an analysis of chromosome abnormalities in human preimplantation embryos. Fertility and Sterility 71, 10331039. 7. Werlin L, Rodi I, DeCeherney A et al. 2003 Preimplantation genetic diagnosis as both a therapeutic and diagnostic tool in assisted reproductive technology. Fertility and Sterility 80, 467468. 8. Kahraman S, Benkhalifa M, Donmez E et al. 2004 The results of aneuploidy screening in 276 couples undergoing assisted reproductive techniques. Prenatal Diagnosis 4, 307311. NGHIÊN CứU Độ TậP TRUNG I-131 VàO TUYếN GIáP UNG THƯ NGUYÊN PHáT Phan Sỹ An, Trần Giang Châu và CS TóM TắT Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu đánh giá độ tập trung I-131 ở tuyến giáp ung th nguyên phát theo kích thớc khối u và giai đoạn ung th. Đối tợng và phơng pháp: Nghiên cứu trong nhóm bệnh nhân đã đợc xác định tế bào học, kích thớc khối u và giai đoạn UTTG theo các tiêu chuẩn và mô bệnh học. Mỗi bệnh nhân đợc uống 5 Ci I-131ở dạng dung dịch Iodua natri. Dùng đầu đếm nhấp nháy với tinh thể NaI có kích thớc 5 x 5 cm có bao định hớng hình trụ. Đặt chế độ gamma phổ kế một kênh với độ mở cửa sổ là 80-120 KeV.Đo HTPX tuyến giáp so với liều uống sau 2 giờ và 24 giờ. Kết quả và kết luận: Độ tập trung I-131 tại tuyến giáp,không góp phần vào chẩn đoán ung th giáp nhng vẫn có giá trị thăm dò chức năng giáp của tổ chức tuyến giáp lành còn lại. Độ tập trung I-131 của nhóm UTTGT hầu hết tơng đơng với ngời bình thờng với giá trị trung bình 12,7% ở thời điểm 2 giờ và 28,5% ở thời điểm 24 giờ. Không có sự tơng quan với kích thớc khối U và giai đoạn UTTGT tiên phát. Đo độ TT. I-131 còn giúp tính liều điều trị UTTG thể biệt hóa bằng I-131, nó không thể thiếu trong qui trình điều trị. Từ khóa: độ tập trung I-131, tuyến giáp ung th SUMMARY Study objectives: The study evaluates the I-131 concentration in primary thyroid cancer with tumor size and stage of cancer. Subjects and Methods:The study patient group were identified cytology, tumor size and stage by standards and histopathology. Each patient is given 5 Ci I-131. Used detector of flashes with crystals NaI(Tl)-size 5 x 5 cm and by how orient collimated. Set a channel gamma spectrometer with 80-120 KeV degrees. Detected activity on thyroid after 2 hours and 24 hours. Results and conclusions: I-131 concentration in the thyroid, not contribute to the diagnosis of thyroid cancer but still worth exploring the function of thyroid gland of the organization remains healthy. The I-131 concentration of cancer group equivalent normal people with average value 12.7% at the time of 2 hours and 28.5% at the time of 24 hours. No correlation with tumor size and stage of primary thyroid cancer. Keywords: I-131 concentration, primary thyroid cancer ĐặT VấN Đề Để chẩn đoán chức năng tuyến giáp trạng, từ những năm 1950 nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã ứng dụng các phơng pháp y học hạt nhân để đo độ tập trung I-131 (iod phóng xạ) ở tuyến giáp. Vì iod là một trong những nguyên liệu để tổng hợp nên hormon tuyến giáp, do đó khi iod đợc hấp thu vào máu chỉ có tuyến giáp mới bắt giữ lại tùy theo yêu cầu sử dụng của tế bào tuyến. Trong ung th tuyến giáp (UTTG) nguyên phát, để chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng, nhiều phơng pháp đã đợc ứng dụng nh xét nghiệm tế bào học, mô bệnh học, định lợng các hooc môn trục yên giáp, các chất chỉ điểm khối u. Bên cạnh đó còn có các phơng pháp ghi hình tuyến giáp nh chụp X quang, CT, MRI, siêu âm tuyến giáp, Y học hạt nhân ghi hình nh Scanner, Gamma-camera, SPECT,PET và PET/CT. Đặc biệt là phơng pháp đo độ tập trung I-131 ở tuyến giáp, đơn giản nhất và hũ ích nên đợc ứng dụng nhiều. Vì sơ bộ ban đầu nó đã cho biết chức năng của tế bào tuyến giáp bình thờng hay bệnh lý. ở Việt Nam, Phan Văn Duyệt đã ứng dụng từ những năm 1970. Phơng pháp đo độ tập trung I-131 vào tuyến giáp cũng đã đợc nghiên cứu và ứng dụng ngay từ những ngày đầu của các khoa, các đơn vị y học hạt nhân trong cả nớc. Tuy nhiên nghiên cứu riêng và sâu ở Việt Nam trong ung th tuyến giáp trạng nguyên phát cũng cha có nhiều, do đó trong công trình này chúng tôi tập trung vào mục tiêu: Nghiên cứu đánh giá độ tập trung I-131 ở tuyến giáp ung th nguyên phát theo kích thớc khối u và giai đoạn ung th. . (807) - số 2/2012 41 ứNG DụNG Kỹ THUậT SINH THIếT Và CHẩN ĐOáN MộT Số BấT THƯờNG Số LƯợNG NHIễM SắC THể CủA PHÔI SAU Rã ĐÔNG TRONG QUY TRìNH THụ TINH TRONG ốNG NGHIệM Vũ Bích Thụy,. tiêu: Xác định tỉ lệ phôi sống sau sinh thiết và tỉ lệ bất thờng số lợng nhiễm sắc thể ở phôi sau rã đông tạo ra từ phơng pháp bơm tinh trùng vào bào tơng trứng, chủ yếu là các bất thờng NST 13,. Quy trình sinh thiết và nuôi cấy phôi Quá trình sinh thiết để chẩn đoán di truyền trớc làm tổ trong nghiên cứu này đợc thực hiện ở giai đoạn phân cắt của phôi (ngày thứ 3 sau thụ tinh) Quy