Đang tải... (xem toàn văn)
1. ĐẶT VẤN ĐỂ Việc tìm các thuốc bảo vệ gan có nguồn gốc từ dược liệu trong nước đang là vấn đề được quan tâm. Trong những năm gần đây đã có một số nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của Nhân trần và Tảo Spirulina. Kết quả cho thấy Nhân trần là vị thuốc bảo vệ gan, biểu hiện khá rõ hoạt tính chống oxy hoá invivo và in vi tro. Cũng như Nhân trần, tảo Spirulina với thành phần chủ yếu là protid, lipid, pcaroten, vitamin E cũng thể hiện rõ tác dụng bảo vệ gan. Nhữnỉỉ nguyên liệu cho các nghiên cứu này: Như Nhân trần thì thường là Nhân trần mọc hoang được thu hái về và được buôn bán ử các cơ sở kinh doanh. Với tảo Spirulina mọc hoang ở Hồ Ba Mẫu cũng đã được thu thập nghiên cứu. Hiện nay ở Thái Nuuyên có loại Nhân trần tía (Adenosmư caeruleiitn R.Br.) đã bắt đầu uieo trồng ử diện tích lớn và đang dự kiến qui hoạch thành một vùng nguyên liệu. Tảo spirulina ở Bình Thuận đã được Công ty nước khoáng Vinh Hảo nuôi trồng với sản lượng lớn và ổn định. Những yếu tố này sẽ trở nên quan trợng cho việc sản xuất một dạng thuốc bảo vệ gan sau này. Vì vậy trong khoá luận này chúng tôi có nguyện vọng thực hiện được mục tiêu: Khảo tính chất chống oxy hoá của dạng cao đặc Nhân trần tía ở Thái Nguyên, Tảo nguyên Spirulina ở Bình Thuận và dạng viên nén của 2 nguyên liệu này qua hai chỉ tiêu là HTCOH in vi vo và hàm lượng GSH gan chuột trên mô hình tiêm CCI4. Hy vọng với những kết quả thu được sẽ có một số thông tin 2 Óp phần cho các cơ sở sản xuất trong nước tham khảo, tạo ra một dạng bào chế có tác dụng bảo vệ gan, từ 2 n.suyên liêu này. 1
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Được HÀ NỘI sv. LẺ VĂN TÚ TẤC DỤNG CHỐNG OXY HOA BẢO VỆ GAN CỦA NHÂN TRẦN TÍA THÁI NGUYÊN VÀ TẢO SPIRUUNA BỈNH THUẬN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHÓA 51(1996-2001) Người hướng dẫn: TS. NGUYỄN QƯAiNG THƯỜNG PGS.TSKH. LÊ THẢNH PHƯỚC Nơi thực hiện: Bộ môn Vô Cơ-Hoá lý Thời gian thực hiện: 15/2/2000 -i 5/5/2001 ị Ị \ \ J L Ạ .Ỵ L Hà Nội- 2001 L è n e á m m Em xin bầy tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới các thầy giáo: TS. Nguyễn Quang Thường PGS.TSKH. Lé Thành Phước những người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em thực hiện khoá luận này. Đổng thời em cũng xin chán thành biết ơn cô giáo Nguyễn Thị Thơm củng toàn thể các thầy, cô trong bộ môn Vô cơ - Hoá lý đã giúp em hoàn thành khoá luận này. Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2001 Sinh viên MỤC LỤC Trang 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1 2. TỔNG QUAN 2 2 .1 .Những nguyên nhân phát sinh bệnh g a n 2 2.2. Sự hình thành các dạng oxy hoạt động và hệ thống các chất chống oxy hoá (CCOH) trong cơ thể 2 2.2.1. Sự hình thành các oxy hoạt động 2 2.2.2 Chất chống oxỵ hoá (CCOH) trong cơ th ể . — . 3 2.2.3. Ảnh hưởng của các chất độc và tác nhân viêm hoại tử gan qua cơ chế gốc tự d o 4 2.3.Quá trình peroxyd hoá lipid (POL) 7 2.4.CƠ chế gốc tự do của các thuốc bảo vệ gan 9 2.5.Một số nét về Tảo Spirulina, Nhân trần 11 3. THỤC NGHIỆM 14 3.1.Chọn đối tượng và phương pháp nghiên cứu 14 3.1.1. Chọn đối tượng nghiên cứu 14 3.1.2. Phương pháp, mô hình và nguyên vật liệu nghiên c ứ u 14 3. 2. Kết quả thực nghiệm 18 3.2.1. Các kết quả khảo sát về phương pháp đo 18 3.2.2. Kết quả nghiên cứu tính chất chống oxy hoá của cao đặc Nhân trần tía Thái Nguyên 24 3.2.3. Kết quả nghiên cứu TCCOH của Tảo Spirulina ở Bình Thuận 29 3.2.4. Kết quả nghiên cứu TCCOH của protecgan - một chế phẩm từ Tảo và Nhàn trần 31 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 5. TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 BẢNG CHỮ VIẾT TẮT CCOH : Chất chốn2 oxy hoá DOHĐ : Dạnu oxy hoạt động GSH : Glutathion GSHPO : Glutathion peroxydase HTCOH : Hoạt tính chốn a oxv hoá LO : Gốc lypoxyl LOO- : Gốc lypoperoxyl MDA Manonyl dialdehyd NT : Nhân trần POL : Quá trình peroxyd hoá lipid TCCOH : Tính chất chốnu oxy hoá 1. ĐẶT VẤN ĐỂ Việc tìm các thuốc bảo vệ gan có nguồn gốc từ dược liệu trong nước đang là vấn đề được quan tâm. Trong những năm gần đây đã có một số nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của Nhân trần và Tảo Spirulina. Kết quả cho thấy Nhân trần là vị thuốc bảo vệ gan,* biểu hiện khá rõ hoạt tính chống oxy hoá invivo và in vi tro. Cũng như Nhân trần, tảo Spirulina với thành phần chủ yếu là protid, lipid, p-caroten, vitamin E cũng thể hiện rõ tác dụng bảo vệ gan. Nhữnỉỉ nguyên liệu cho các nghiên cứu này: Như Nhân trần thì thường là Nhân trần mọc hoang được thu hái về và được buôn bán ử các cơ sở kinh doanh. Với tảo Spirulina mọc hoang ở Hồ Ba Mẫu cũng đã được thu thập nghiên cứu. Hiện nay ở Thái Nuuyên có loại Nhân trần tía (Adenosmư caeruleiitn R.Br.) đã bắt đầu uieo trồng ử diện tích lớn và đang dự kiến qui hoạch thành một vùng nguyên liệu. Tảo spirulina ở Bình Thuận đã được Công ty nước khoáng Vinh Hảo nuôi trồng với sản lượng lớn và ổn định. Những yếu tố này sẽ trở nên quan trợng cho việc sản xuất một dạng thuốc bảo vệ gan sau này. Vì vậy trong khoá luận này chúng tôi có nguyện vọng thực hiện được mục tiêu: Khảo tính chất chống oxy hoá của dạng cao đặc Nhân trần tía ở Thái Nguyên, Tảo nguyên Spirulina ở Bình Thuận và dạng viên nén của 2 nguyên liệu này qua hai chỉ tiêu là HTCOH in vi vo và hàm lượng GSH gan chuột trên mô hình tiêm CCI4. Hy vọng với những kết quả thu được sẽ có một số thông tin 2 Óp phần cho các cơ sở sản xuất trong nước tham khảo, tạo ra một dạng bào chế có tác dụng bảo vệ gan, từ 2 n.suyên liêu này. 1 2. TỔNG QUAN 2.1. NHỬNG NGUYÊN NHÂN PHÁT SINH BỆNH GAN [9, 6] Bệnh gan hiện nay vẫn là bệnh phổ biến trên thế giới, đặc biệt là những nước nhiệt đới như Việt Nam. Bệnh san thườns bắt đầu từ viêm san cấp rồi chuyên sans viêm ean mạn, suy san, xơ oan và cuối cùng có thể dẫn tới une thư san. Các nguyên nhân phát sinh bệnh san rất phong phú như: viêm ean do virus. Khi các virus vào san nó biên mội thành phần của tê' bào uan thành khánu nguyên hoặc sắn kháng nguyên lên hề mặt tế hào oan. Khi đó cơ thể sản xuất ra các khánu thô’ chốns lại các khánu nguyên tạo ra phản ứns viêm. Viêm sjan hoại tử có thể do các chất độc xâm nhiễm vào cơ thể như: tetracloruacarbon(CCl4), Trinitrotoluol! (TNT: chất độc chiên tranh) và các thuốc như tetracyclin, Paracetamol. INH, Rifaimycin, hoặc ethanol. Khi vào cơ thê dưực uan chuyển hoá tạo ra nhừnu chất độc, ìiày viêm hoại từ uan. Tinh trạne thiếu dinh dưỡn« kéo dài cùne dản đốn viêm £an hoại tử. Ncoài ra còn rất nhiều nguvên nhân khác có thể dẫn đến viêm gan như: viêm gan do amip, do viêm đườns mật, do tăna áp lực tĩnh mạch cửa Quá trình viêm gan đã được nhiều tài liệu đề cập theo các cơ chế khác nhau. Cơ chế sốc tự do của quá trình này được trình bày vắn tắt (V phần dưới đây. 2.2. Sự HỈNH THÀNH CÁC DẠNG OXY HOẠT ĐỘNG VÀ HỆ THÔNG CÁC CHẤT CHỐNG OXY HOÁ TRONG cơ THE [1,3,10,12] 2.2.1. Sự hình thành các dạng oxy hoạt động (DOHĐ) 2 Trone chuỗi hô hấp tế bào oxy nhận điện tử và kết hợp với hydro tạo thành nước,.Quá trình oxy nhận điện tử ở chuỗi hô hấp tế bào thực tế qua nhiều giai đoạn và mỗi giai đoạn chỉ nhận một điện tử. Oxy nhận điện tử đầu tiên tạo thành sốc superoxyd (Oj~). Gốc này (0*~) bị SOD phân huỷ tạo thành H2 0 2 theo phản ứng: SOD 20 ;- + 2H+ >H20 2 + °2 (1) với hằne số tốc độ kị = 109 M/s. H2 0 2 tạo ra nhanh chóng bị GSHPO và cơ chất là GSH chuyển thành nước theo phản ứns: GSHPO H2 0 2 + 2GSH — — > 2H20 + GSSG (2) với hằns số tốc độ k2 = 1 0 8 iVl/s. Binh thườns do kị và k2 rất lớn, nên chủ yếu sán phẩm của quá trình hô hấp tế bào là nước. Tuy nhiên trone cơ thỏ’ vẫn tổn tại một lượng rất nhỏ H2 0 2 và OV". Đây là 2 chất có tính chất oxy hoá mạnh, do chuyển động nhiệt hoàn toàn nsẫu nhiên mà chúno va đập phản ứnu với nhau tạo ra '(), (oxy đơn hội )và §OH í sốc hydroxyl). Đây ỉà hai tiểu phàn có khả nănu phán ứnii rất cao. Chún« tấn côns vào các tổ chức của cư thê tạo ra các gốc tự do mới như LO’, LOO Các gốc tự do của oxy và các dạng oxy có khả nănu phản ứng cao như vậy được gọi là các dạng oxy hoạt động hay các oxydant. 2.2.2. Chất chống oxy hoá trong cơ thể Trong cơ thể có một hệ thống các chất trung hoà hoặc phân huỷ các dạng oxy hoạt động trên và được gọi là các CCOH hay các antioxidant bao gồm: - Enzym Superoxydismutase (SOD) Có 2 loại SOD: + MnSOD có ở ty thể + CuZnSOD có ở bào tương 3 Cả hai loại này đều phân huỷ đặc hiệu 0 ‘2 theo phản ứng ( 1 ). - GSH và GSHPO Cơ chất và enzym này phân huỷ các peroxyd và H2 0 2 theo phản ứng: LOOH + GSH GSHPQ > GSSG + LOH + H20 (3) LOOH(peroxyd) - Vitamin E Đây là một vitamin tan trong mỡ, có khả nãne nằm ở các tổ chức màne, vừa có vai trò bẫy các Hốc tự do thứ cấp như LO', LOO vừa loại bỏ ‘0 2 một chất khơi mào cho quá trình POL. Do đó vitamin E là một chất bảo vệ tốt màrm tê bào nuăn chận sự tấn cônẹ của các sốc tự do. - B-caroten. ubiquinon và các chất tươns tự tồn tại ở dạns semiquinon (sốc hền) và có tác dụns bẫy các sốc tự do. - Các tác nhàn phức hoá các kim loại chuyển tiếp như sắt và đồng. Bình thườns phản ứne của Oị với H2 0 2 tạo ra ‘0 2 và 'OH, xảy ra rất chậm (phản ứnt> Harber-Weiss), nhưns; khi cỏ mặt các kim loại chuyên tiếp ở trạng thái tự do (F c'\ Cu+) thì phán ứnu xảy ra rất nhanh (khi đó dưựe nại là phản ứnu Fenton), sắt và đổng trong CƯ thế luôn tổn tại dưới dạng phức như Ferritin, Ceruloplasmin, Transferin 2.2.3. Ánh hưởng của các chất độc và tác nhân gâv vièm gan hoại tử qua cơ chế gốc tự do. 2.2.3.1. Viém hoại tử gan do thiếu dinh dưỡng [15] Khi trons khẩu phần thức ăn không đủ chất dinh dưỡng, đặc biệt là protid, sẽ thiếu các acid amin như cystein, methionin làm cho GSH và một số chất bảo vệ san khác không được tổng hợp. Khi đó tế bào gan sẽ bị hoại tử ,do cạn kiệt GSH là một chất chốns oxy hoá mạnh có khả năne cùns với GSHPO loại bỏ các peroxyd hình thành, ức chế quá trình POL ở tế bào san. A Hàm lượns GSH trong cơ thể được coi là một chỉ tiêu đánh giá sức đề kháng và mức độ nhiễm độc của cơ thể. Thiếu dinh dưỡng còn thiếu cholin làm cho gan không tổng hợp được phospholipid . Khi đó mỡ tích tụ lại ở gan, tạo tiền đề cho quá trình POL sinh ra nhiều sản phẩm độc. 2.23.2. Viêm hoại tử gan do các chất độc xàm nhập vào cơ thể [11,12,19] Các hợp chất như tetracloruacarbon (CCỊị), trinitrotoluen (TNT), hợp chất nitro thơm, rượu hoặc các thuốc như paracetamol, tetracyelin, INH, riíầmycin Khi vào cơ thể , được gan chuyên hoá tạo ra nhiều sản phẩm trung »ian có tính oxy hoá mạnh. Các dạn« trung sian này làm tăng quá trình POL, giảm CCOH ở san làm cho các tê' bào gan bị hoại tử . Một số chất điển hình được trình bày dưới đây. * Viêm gan hoại tử do CCl4 Các dẫn chất halogen và điển hình là tetracloruacarbon (CC14), khi vào cơ ihe được oan chuyển hoá như sau: CC14 > CC1Í + C1- +0 2 V CClịOO > Cl2CO (phosaen) Trước khi thành phosgen, CC14 được men ean (cytocrom P450)chuyển thành các dạng eốc tự do như CCI3 , C1‘, CCI3 OO gây huỷ hoại các tế bào gan thông qua quá trình POL. * Viêm gan hoại tử do các hợp chất nitro Các dẫn chất nitro (RN02) khi tới gan được chuyển hoá như sau: Qua sơ đồ ta thấy từ RN02 được men gan chuyển thành RN Oj , chất này nhường điện tử cho oxy tạo gốc 0*2 và RNOÌ" lại trở về R N 02. Như vậy không có sự khử thực sự nào mà các hợp chất này chỉ xúc tác cho sự hình thành sốc 0*~. Từ gốc này sẽ hình thành '0 2 và 'OH làm tăng quá trình POL, gây phá vỡ màng tế bào (hoại tử tế bào gan). * Viêm gan mạn do rượii Khi ethanol vào gan, nó được men gan (cytocrom p450) chuyển hoá như sau: hoá lipid trị vào các protein Như vậy sau khi được gan chuyển hoá, từ ethanol đã tạo ra các sản phẩm truns sian là các gốc tự do, làm cho quá trình POL tăng mạnh, đồng thời làm giảm lưựng GSH.VÌ các lý do này nên nếu ethanol được đưa vào cơ thể với một lượng lớn trong thời gian dài sẽ gây hoại tử các tế bào gan. * Tổn thương gan do Trìnitrotoluen (TNT) Theo Zimmerman H.J., TNT là một chất thân mỡ và quá trình đào thải chúns ra khỏi cơ thê cần có thêm một nhóm phàn cực đê có thể hoà tan vào nước. Quá trình chuyển hoá này xảy ra ở san và được hệ thốns men oxy hóa 6 [...]... 12 u tảo 0 0 0 g tảo g tảo Với thành phần như vậy, tảo có tác dụng dinh dưỡng rất tốt cho heười và động vật * Gần đày, một loại tảo Spirulina mọc ở Hồ Ba Mẫu - Hà Nội cũng đã được nshiên cứu tác dụng bảo vệ gan theo cơ chế gốc tự do [4, , 18] 6 Có tác giả đã cố gắng chiết từ tảo ra các dạng khác nhau và thử tác dụng chống oxy hoá của các phân đoạn chiết Kết quả đều khảng định tác dụng tốt của Tảo Song... cao đặc Nhân trần tía ở Thái Nguyên, 18 Q-itt tãng so với lô làm chứng Tuy nhiên chưa rõ thống kê trong điều kiện thí 'nghiệm của chúng tôi 3.2.3 Kết quả đo tính chất chống oxy hoá của Tảo Bình Thuận 3.2.3.I HTCO invivo Chúno tôi tiến hành đo hoạt tính chống oxy hoá của dạng tảo nguyên lấy từ Bình Thuận ở liều lg/lK g cân nặns Thí nghiệm được tiến hành trên 2 lô chuột, mỗi lô 8 con Lô thử uống Tảo với... thử và lô chứng cho thấy hàm lượns GSH ở 2 lô thí nshiệm khône khác nhau (P>0,05) Như vậy tảo nuuvên Bình Thuận không làm thay đổi hàm lượns GSH gan chuột ở liều thực nghiệm 30 3.2.4 Kết quả nghiên cứu HTCOH của protecgan Các tác giả trước đây đã nghiên cứu tính chất chống oxy hoá của hỗn hợp tảo và nhân trần ở dạng chiết và chiết phun sương Ở các tỷ lệ khác nhau và thấv rằns ở tỷ lệ Nhân trần : Tảo. .. nghiên cứu thể hiện rõ TCCOH của dịch chiết hước Nhân trần và cũng đã chứng íỏ phần quyết định HTCOH chủ yếu là do Flavonoid [17] Theo kinh nghiệm của các lang y thì Nhân trần tía có tác dụng tốt hơn các loại Nhân trần khác 1,5 lần, mùi thơm đạc trưng hơn, có lẽ đây là điểm đáng chú ý nhất của loại Nhân trần tía 2.5.2 Tảo Spirulina [14] Có 2 loại là: + Spỉniỉina pỉcitensis + Spirulina maxima Với thành... cứu Chúng tôi chọn hai Dược liệu là : Nhân trần tía Thái nguyên và Tảo Spirulina ở Bình thuận - Cây Nhân trần tía ở Thái Nguyên trồng tới khi ra hoa, thu hoạch về nấu thành cao đặc có hàm ẩm từ 15-20%, độ tro dưới 9°/(, hàm lượng flavonoid 0,15% - Tảo spirulina ở Binh thuận có tiêu chuấn kiểm tra chất lượng để bán ra thị trườnR + ơ dạtm sàn phẩm được dỏng oỏi Ikiì của Xí nghiệp nước khoáng Vĩnh Hảo:... của Nhân trần cón Flavonoid: 0,1-5-0,15%,tinh dầu: 0,25-5-0,5% Neọài " 'òn có polyphenol, cumarin - Cây Nhân trần tía Thái Nguyên (mẫu ) với 1 các đặc điểm như trons ảnh đã dược Hội thảo khoa học ở Thái Nguyên và GS Vũ Văn Chuyên xác định là loại Nhân trần tía có tên khoa học là Adenosma caemleum R.Br.họSeroplìulariaceae Một trìnhtrướcđây số công [6,17,18] đã nghiên cứu TCCOH của Nhân hoano 2 11 trần. .. là cao đặc Nhân trần tía Thái Nguyên hoặc tảo Spirulin Bình Thuận Tất cả các con chuột đều được tiêm dung dịch CCỊị 10% pha trone dầu thực vật và cách ly Hoàn toàn với thức ăn(Mh)Sau đó giết chuột thật nhanh lấy gan làm homogenat xác định MDA và GSH 3.1.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hoá 3.1.2.2.1 Nguyên tắc của phương pháp Tiến hành peroxyd hoá acid béo chưa no ở một nhiệt độ và thời gian... tốt, thể hiện rõ HTCOH Tuy nhiên nếu đưa vào sản xuất lớn thì rất tốn kém và khó thực hiện đặc biệt là khâu lọc trước khi phun sương đối với tảo Vì vậy trước mắt chúng tôi dùng dạng nguyên liệu: Dạns tảo nguyên ở Xí nehiệp nước khoáng Vĩnh Hảo Bình Thuận và dạng cao đặc của cây Nhân trần tía của Thái Neuyên cho các thí nehiệm 13 3.THỰC NGHIỆM 3.1 CHỌN ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 3.1.1 Chọn đối... nay ở Việt Nam [5,7] có ba cây mans tên Nhân trần thuộc chi Adenosma đang được sử dụng để điều trị bệnh ean theo phương pháp y học cổ truyền, đó là: + Nhântrần: Adenosma caenileum R.Br Cầy này đã được hai danh y Việt Nam là TuệTĩnh và Hải Thượng Lãn Ôngghi vào tác phẩm y học của mình + Nhân trần Bồ bổ: Adenosma indianum Lour + Nhân trần Tây Ninh (chè cát, nhân trần cái ): Aclenosma bracteosum Banati... O V hoá của cao đặc Nhản trần X tía Thái Nguyên 3.2.2.1 HTCOH invivo của cao đặc Nhán trần * Khảo sát động học theo liều Chúng tôi tiến hành trên 5 lô chuột, mỗi lô 3 con - Lô 1 làm chứng (K) cho uống nước cất - Lô 2 cho uống cao đặc Nhân trần với liều 0,25g/lkg - Lô 3 cho uốne cao đặc Nhân trần với liều 0,5g/lke - Lô 4 cho uốna cao đặc Nhân trần với liều 1g/1 ko - Lô 5 cho uống cao đặc Nhân trần với . cứu tác dụng bảo vệ gan của Nhân trần và Tảo Spirulina. Kết quả cho thấy Nhân trần là vị thuốc bảo vệ gan, * biểu hiện khá rõ hoạt tính chống oxy hoá invivo và in vi tro. Cũng như Nhân trần, tảo. ĐẠI HỌC Được HÀ NỘI sv. LẺ VĂN TÚ TẤC DỤNG CHỐNG OXY HOA BẢO VỆ GAN CỦA NHÂN TRẦN TÍA THÁI NGUYÊN VÀ TẢO SPIRUUNA BỈNH THUẬN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHÓA 51(1996-2001) Người hướng dẫn: TS chất chống oxy hoá của cao đặc Nhân trần tía Thái Nguyên 24 3.2.3. Kết quả nghiên cứu TCCOH của Tảo Spirulina ở Bình Thuận 29 3.2.4. Kết quả nghiên cứu TCCOH của protecgan - một chế phẩm từ Tảo và