Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẶT VÂN ĐỂ Trong những năm gần đây các chế phẩm enzym được dùng làm thuốc ngày càng nhiều và có nhiều chế phẩm đã phát huy hiệu quả điều trị cao. Viên a chymotrypsin là một ví dụ, sản phẩm này đã được sản xuất dưới dạng tiêm và uống. Số lượng viên a Chymotrypsin được bán ở trên thị trường Việt Nam đạt tới hàng chục triệu viêntháng. Chỉ định chính của viên này là chống viêm và phù nề. Tuy vậy chúng ta đang phải nhập a Chymotrypsin ở dạng nguyên liệu và thành phẩm, do đó không chủ động được trong sản xuất và người bệnh phải chịu giá thuốc cao. Hơn nữa việc bảo quản a Chymotrypsin đòi hỏi dưới 10°c, trong khi đó đa số các hiệu thuốc trong nước không đáp ứng được điều này do vậy chế phẩm khó có thể đảm bảo về hoạt tính. Nhằm khắc phục được những đặc điểm trên, một mặt chúng ta tiến hành nghiên cứu nhiệt đới hoá chế phẩm a Chymotrypsin. Mặt khác tiến hành nghiên cứu các chế phẩm enzym khác có tác dụng điều trị tương tự nhưng lại có độ bền hoạt tính enzym cao phù hợp với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa của nước ta. Để có thể thay thế từng phần tiến tới thay thế hoàn toàn a chymotiypsin. Chính vì vậy, tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu cứu phối hợp b r o m e ỉa in v à a C h y m o try p sin v ớ i tỷ lệ thích h ợ p v ề hoạt đ ộ e n z y m v à đ ộ bền hoạt tính để làm thuốc” là để nhằm mục đích: 1 Tạo ra một số chế phẩm bromelain từ cây dứa (Ananas comusa). 2 Xác định được tỉ lệ thích hợp về hoạt độ protease khi phối hợp hai chế phẩm enzym. 3 Đánh giá được độ bền hoạt tính của hỗn hợp enzym.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI *1^ •$» «ỉ« «£# •£# *ĩ> «2# «2# %t# *£« *{# #Ị^ #Ị% #Ị% rj% 0Ị% #J> «Ị% #Ị% •!% rj> #Ị> #J% r fi #J> #J> #J5 #J% ^Ị% ^Ị% BỘ YTẾ NGUYỄN ÍCH TUẤN NGHIÊN CỨU PHỐI HỢP BROMELAIN VÀ a- CHYMOTRYPSIN VỚI TỈ LỆ THÍCH HỢP VỂ HOẠT ĐỘ ENZYM VÀ ĐỘ BỂN HOẠT TÍNH ĐỂ LÀM THUỐC (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DUỢC sĩ KHOÁ 2001- 2006) Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Rư Noi thực hiện: Bộ môn Hoá Sinh, Đại học Dược HN Thời gian thực hiện: Tháng 5 năm 2006 ể ^ A e i ẹ v - ; -r-/Ị^£> HÀ NÔI. 5.2006 I § § »D I MỤC LỤC ĐẶT VÂN ĐỂ 1 PHẦN 1 TỔNG QUAN 2 1.1 Đại cương chung về protease 2 1.2 Bromelain 4 1.2.1 Đặc điểm cấu tạo của bromelain 4 1.2.2 Cấu trúc không gian của bromelain 5 1.2.3 Tính chất của bromelain 6 1.2.4 Hoạt tính của bromelain— 7 1.2.5 Tác dụng dược lý của bromelain 9 1.3 a - Chymotrypsin 13 1.3.1 Cấu trúc của Chymotrypsin 13 1.3.2 Tính chất của Chymotrypsin 13 1.3.3 Sự hoạt hoá chymotrypsinogen 14 1.3.4 Cơ chế hoạt động của a - Chymotrypsin 15 1.3.5 Tính đặc hiệu của a - Chymotrypsin 16 PHẦN 2 THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ - - 18 2.1 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 18 2.1.1 Nguyên liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 18 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu - 21 2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét - 26 2.2.1 Chiết, tách và tạo chế phẩm bromelain từ Dứa 26 2.2.2 Xác định hoạt độ protease của bromelain tinh 28 2.2.3 Xác định hoạt độ enzyme của a - Chymotrypsin — 30 2.2.4 Xác định tỉ lê phối hợp thích hợp của bromelain và AC 31 2.2.5 Nghiên cứu độ bền hoạt độ của hỗn hợp enzym 31 2.3 Bàn luận 36 PHẦN 3 KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 39 3.1 Kết luận 39 3.2 Đề xuất 40 CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT AB, AC ĐHQGHN ĐHQGTPHCM NXB KH & KT NXB YHHN PGE, PGG, PGHo Hỗn hợp AC và B3 tỉ lộ AC/B3 = 1 1 a - Chymotrypsin Đại học quốc gia Hà Nội Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Nhà xuất bản y học Hà Nội Prostaglandin E2 Prostaglandin G2 Prostaglandin H2 ĐẶT VÂN ĐỂ Trong những năm gần đây các chế phẩm enzym được dùng làm thuốc ngày càng nhiều và có nhiều chế phẩm đã phát huy hiệu quả điều trị cao. Viên a- chymotrypsin là một ví dụ, sản phẩm này đã được sản xuất dưới dạng tiêm và uống. Số lượng viên a - Chymotrypsin được bán ở trên thị trường Việt Nam đạt tới hàng chục triệu viên/tháng. Chỉ định chính của viên này là chống viêm và phù nề. Tuy vậy chúng ta đang phải nhập a- Chymotrypsin ở dạng nguyên liệu và thành phẩm, do đó không chủ động được trong sản xuất và người bệnh phải chịu giá thuốc cao. Hơn nữa việc bảo quản a- Chymotrypsin đòi hỏi dưới 10°c, trong khi đó đa số các hiệu thuốc trong nước không đáp ứng được điều này do vậy chế phẩm khó có thể đảm bảo về hoạt tính. Nhằm khắc phục được những đặc điểm trên, một mặt chúng ta tiến hành nghiên cứu nhiệt đới hoá chế phẩm a- Chymotrypsin. Mặt khác tiến hành nghiên cứu các chế phẩm enzym khác có tác dụng điều trị tương tự nhưng lại có độ bền hoạt tính enzym cao phù hợp với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa của nước ta. Để có thể thay thế từng phần tiến tới thay thế hoàn toàn a- chymotiypsin. Chính vì vậy, tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu cứu phối hợp brom eỉain và a - Ch ym otrypsin với tỷ lệ thích hợ p về hoạt đ ộ en zy m và độ bền hoạt tính để làm thuốc” là để nhằm mục đích: 1 Tạo ra một số chế phẩm bromelain từ cây dứa (Ananas comusa). 2 Xác định được tỉ lệ thích hợp về hoạt độ protease khi phối hợp hai chế phẩm enzym. 3 Đánh giá được độ bền hoạt tính của hỗn hợp enzym. PHẨN 1 TỔNG QUAN 1.1 Đại cương chung về protease — Protease là các enzym xúc tác sự thuỷ phân liên kết peptid trong phân tử và các cơ chất tương tự. — Nhiều protease có khả năng thuỷ phân liên kết ester và vận chuyển acid amin. — Phân loai quốc tế protease được chia làm 4 phân nhóm phụ: + Phân nhóm phụ 3.4.1: gồm các aminopeptid do hydrolase (aminopeptidase) xúc tác sự thuỷ phân liên kết peptid ở đầu mạch polypeptid. + Phân nhóm 3.4.2: gồm các enzym peptidil aminoacid hydrolase (cacboxylpeptitdase) xúc tác cho sự thuỷ phân liên kết ở đầu mạch c của polypeptid. + Phân nhóm phụ 3.4.3: gồm các enzym dipeptid - hydrolase xúc tác cho sự thuỷ phân dipeptid. + Phân nhóm phụ 3.4.4: gồm các enzym dipeptidil - peptid hydrolase các enzym này xúc tác cho sự thuỷ phân các liên kết peptid nội mạch. — Phân loai dưa trẽn các nhóm chức hoat đổng trong trung tâm hoạt động người ta chia protease thành 4 nhóm: + Nhóm Serinic: có nhóm -OH hoạt động là của serin. Các enzym này hoạt động mạnh trong khoảng pH € (7; 11). + Nhóm Thiolic: có nhóm hoạt động là SH + Nhóm chứa kim loại: có các kim loại tham gia vào các phần hoạt động xúc tác, hoạt động mạnh trong khoảng pH € (6,5;7,5). + Nhóm protease - acid: thường có nhóm hoạt động là nhóm cacboxyl, hoạt động mạnh trong khoảng pH € (1,5;5). — Phân loai dưa trẽn vùng pH hoat đổng phân ra: protein kiềm, trung tính, acid. Tuy nhiên nó chỉ có ý nghĩa thực dụng vì pH tối thích của mỗi enzym phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như: bản chất cơ chất + Protease acid: renin, pepsin + Protease trung tính: amylase, papain + Protease kiềm: tiypsin, chymotrypsin — Phân loai dưa trẽn nguồn gốc chia ra làm 3 loại: + Protease thực vật. + Protease động vật: được tách ra từ những thành phẩn khác nhau trẽn cơ thể động vật. + Protease vi sinh: hệ thống rất phức tạp gồm nhiều enzym giống nhau về cấu trúc, trọng lượng và hình dạng phân tử, thường có trọng lượng phân tử thấp, chủ yếu từ nấm mốc, vi khuẩn, xạ khuẩn. — Phân loai dưa vào vi trí tác dung của protease trên liên kết peptid của phân tử protein [3]: + Endopeptidase: chủ yếu phân giải các liên kết peptid nằm trong protein. Phân cắt những đoạn peptid có khối lượng phân tử nhỏ (polypeptid mạch ngắn, pepton . . .)• Nhóm các protease tiêu hoá chủ yếu ở người và động vật: pepsin và renin trong dịch dạ dày, trypsin và chymotrypsin của tuyến tuỵ và niêm mạc ruột non đều thuộc nhóm này. + Exopeptidase: chủ yếu cắt các liên kết peptid ở hai đầu mạch, vd: nhóm carboxylpeptidase và aminopeptidase phân giải liên kết peptid từ hai đầu mạch polypeptid có nhóm carboxyl và amin tương ứng, ngoài ra còn có dipeptidase phân giải dipeptid thành các acid amin tự do. OH N H -C H - 2 I R 1 Endopeptidase H c o — NH CH NHCHCO — NHCHCO — NHCHCO"NHCHCOOH Amino peptidase HO HO R. H H Carboxy peptidase Exopeptidase Hình 1: VỊ trí tác dụng của protease trên liên kết peptid của phân tử protein 1.2 Bromelain 1.2.1 Đặc điểm cấu tạo của bromelain — Bromelain (EC 3.4.22.3.2) là tên gọi chung cho nhóm enzym thực vật chứa nhóm sulfhydryl, có khả năng phân giải protein, được thu nhận từ họ Dứa (Bromeliaceae), đặc biệt là ở thân và trái cây dứa. — Bromelain là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 manóse, 2 glucosamin, 1 xylose và 1 fructose. Sợi hydrat carbon này dường như một nửa sợi không liên quan đến cơ chế xúc tác của phân tử. — Khi phân tích thành phần aminoacid ở bromelain thân và bromelain quả thì tuỳ theo phương pháp thu nhận và phương pháp phân tích mà có thành phần acid amin thay đổi khác nhau. Bromelain thân có thành phần aminoacid thay đổi trong khoảng 321 - 144 aminoacid và bromelain quả là 283 - 161 aminoacid. — Bromelain thân là một chuỗi polypeptid có aminoacid ở đầu là valin đầu N và Glycin đầu c. [...]... 4: Hoạt độ của bromelain tại các nồng độ khác nhau Qua bảng trên ta sẽ chọn nồng độ bromelain là c= 5.10'^% làm nồng độ nghiên cứu —Như vậy hoạt độ của bromelain là HđB = 121.6 (nKat) 29 2.2.3 Xác định hoạt độ enzym của a- Chymotrypsin — a - Chymotrypsin tinh khiết được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ t°= -15°c, hoà tan trong nước ở các nồng độ khác nhau, đem đo hoạt tính, nhằm xác định nồng độ enzym. .. có 3 hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase Bromelain thân có hoạt tính enzym với nhiều cơ chất tự nhiên và có thể thuỷ phân cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp Hoạt tính phân giải casein (Ul/mg) Cơ chất Bromelain thân Casein Bromelain quả xanh Bromelain quả chín 7.4 4.0 3.0 Bảng 2: Hoạt tính phân giải casein của bromelain [3] — Đối với cơ chất là casein, hoạt tính enzym của bromelain. .. Sulfat và trong ethanol) 14 — Khi chymotrypsinogen A được hoạt hoá sẽ tạo ra các dạng anpha, beta, gama, p i Chymotrypsin B được hoạt hoá thành dạng Chymotrypsin B hoạt động Các enzym anpha, beta, gama - Chymotrypsin có tính đặc hiệu và có hoạt tính đối với một số cơ chất rất giống nhau do đó khó phân biệt được chúng về mặt enzym Tuy nhiên chúng lại khác nhau về tính chất protein, dạng tinh thể, độ hoà... sạch chỉ còn 60 - 70% hoạt tính Bromelain có biên độ pH rộng 3 - 1 0 nhưng pH tối thích của enzym là 5 - 8 tuỳ thuộc vào cơ chất + Ảnh hưởng bởi các ion kim loai: các ion kim loại có ảnh hưỏfng đến hoạt tính của enzym do chúng thường gắn vào các trung tâm hoạt động của enzym Muối thuỷ ngân có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính của bromelain và mức độ kìm hãm thay đổi tuỳ theo nồng độ muối Ngoài ra, còn... vào nhiệt độ, thòi gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzym, bản chất dung dịch đệm, sự hiện diện của chất hoạt hoá Khi thu nhận bromelain thân, nếu dùng tác nhân kết tủa là ammonium sulfat thì enzym có hoạt tính cao nhất ở pH 4,8 và ổn định ở pH 4,6 - 5,4 Bromelain thân đã được tinh sạch một phần có hoạt tính cao ở pH 6,0 và 8,0 ổn định ở pH 3,5 - 5,6 với nhiệt độ 63°c Enzym. .. mật độ quang (D) và nồng độ protein (mg/ml): D Biểu đồ mẫu Hình 4: Sự phụ thuộc giữa mật độ quang (D) và nồng độ protein (C) Từ biểu đồ chuẩn cho thấy, sự biến thiên của mật độ quang tuyến tính bậc một theo nồng độ protein Như vậy ta có thể xác định được lượng protein đã bị thuỷ phân bởi enzym (A) 2.1.1.3 Phương pháp xác định hoạt độ enzym — Nguyên tác: cơ chất được ủ với enzym ở điều kiện thích hợp. .. khẳng định có mặt bromelain trong tủa thu được 2 2.2 Xác định hoạt độ protease của bromelain tinh — Chế phẩm bromelain tinh khiết được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ t°= - 15°c, tiến hành xác định hoạt độ enzym: 28 — Từ (*) ta có: B = 14, T = 3600, m = 0.5x lOn (n là nồng độ % của enzym) — HđE = (Ax6 8 8 8 )/n > + Bước 1: Xác định nồng độ bromelain thuỷ phân ~ 50% protein và có hoạt độ enzym là cao nhất:... s— — Trong phân tử bromelain thân có chứa nhóm sulữiydryl có vai trò chủ yếu trong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfit Ngoài ra trong phân tử còn có các ion không gian của enzym có lẽ có vai trò trong duy trì cấu trúc 1.2.3 Tính chất của bromelain — Các nghiên cứu về tính chất vật lý của bromelain thân dứa đượ Murachi và cộng sự nghiên cứu và công bố vào năm 1964 như sau... 0,743ml/g Độ nhớt bên trong [1] 0,039dl/g Tỷ số ma sát f/fo 1,26 Điểm đẳng điện pl 9,55 A '^^Ở 280 nm 2 0 ,1 Sự hấp thu 33.20* Trọng lượng phân tử 32.100** 35.500*** tính bằng phương pháp sa lắng khuếch tán tính từ hằng số sa lắng và độ nhớt bên trong tính bằng phương pháp Archibald Bảng 1 : Những tính chất vật lý của bromelain thân 1.2.4 Hoạt tính của bromelain 1.2.4.1 Hoạt tính enzym của bromelain — Bromelain. .. thuỷ giải của bromelain yếu hơn papain + Ảnh hưởng bởi nhiêt đỏ: nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như: thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những thay đổi làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym, nồng độ enzym, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzym + Ảnh hưởng của pH: pH là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzym pH tối thích của enzym không . YTẾ NGUYỄN ÍCH TUẤN NGHIÊN CỨU PHỐI HỢP BROMELAIN VÀ a- CHYMOTRYPSIN VỚI TỈ LỆ THÍCH HỢP VỂ HOẠT ĐỘ ENZYM VÀ ĐỘ BỂN HOẠT TÍNH ĐỂ LÀM THUỐC (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DUỢC sĩ KHOÁ 200 1- 2006) Người hướng. thích hợ p về hoạt đ ộ en zy m và độ bền hoạt tính để làm thuốc là để nhằm mục đích: 1 Tạo ra một số chế phẩm bromelain từ cây dứa (Ananas comusa). 2 Xác định được tỉ lệ thích hợp về hoạt độ protease. — 30 2.2.4 Xác định tỉ lê phối hợp thích hợp của bromelain và AC 31 2.2.5 Nghiên cứu độ bền hoạt độ của hỗn hợp enzym 31 2.3 Bàn luận 36 PHẦN 3 KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 39 3.1 Kết luận