BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM * ðỖ THỊ HOA CHẾ KHÁNG NGUYÊN VÀ KHÁNG THỂ KHÁNG VI RÚT GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP DÙNG TRONG CHẨN ðOÁN HUYẾT THANH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI – 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM * ðỖ THỊ HOA CHẾ KHÁNG NGUYÊN VÀ KHÁNG THỂ KHÁNG VI RÚT GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP DÙNG TRONG CHẨN ðOÁN HUYẾT THANH HỌC Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60640101 LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học PGS.TS Tô Long Thành HÀ NỘI – 2012 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… i Lêi c¶m ¬n Lêi c¶m ¬nLêi c¶m ¬n Lêi c¶m ¬n Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm chẩn ñoán thú y trung ương - Cục Thú Y ñã giúp ñỡ và tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Tô Long Thành Giám ñốc trung tâm chẩn ñoán thú y trung ương – Cục Thú Y là giáo viên trực tiếp hướng dẫn và giúp ñỡ tôi hoàn thành luận văn này. Xin bày tỏ lòng biết ơn và kính trọng tới Ths. Nguyễn Tùng, phó Giám ñốc trung tâm chẩn ñoán thú y trung ương – Cục Thú Y ñã dành nhiều thời gian, công sức giúp ñỡ tôi trong suốt quá hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn những y kiến ñóng góp quý báu của thầy giáo, cô giáo trong ban ðào tạo sau ðại học – Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam trong quá trình học tập, hoàn thiện và bảo vệ luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ nhân viên trong phòng Vi rút, phòng Giải phẫu bệnh thuộc trung tâm chẩn ñoán thú y trung ương – Cục Thú Y ñã tạo ñiều kiện, giúp ñỡ trong các thí nghiệm thực hiên ñề tài. Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn sựu giúp ñỡ nhiệt tình của các bạn ñồng nghiệp, gia ñình và người thân ñã ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Xin chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày 15 tháng 11 năm 2012 ðỗ Thị Hoa Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… ii LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả thu ñược trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Nếu có gì sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Tác giả luận văn ðỗ Thị Hoa Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn i Lời cam ñoan ii Mục lục iii Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt vi Danh mục các bảng vii Danh mục các hình viii MỞ ðẦU 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1 Giới thiệu chung về PRRS 5 1.1.1 Khái quát về PRRS 5 1.1.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 8 1.1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước 13 1.1.4 Tình hình dịch Tai xanh ở Việt Nam 16 1.2 Các kiến thức về chẩn ñoán 22 1.2.1 Chẩn ñoán qua các dấu hiệu lâm sàng 22 1.2.2 Chẩn ñoán dựa vào bệnh tích 22 1.2.3 Chẩn ñoán vi rút học 23 1.2.4 Phương pháp huyết thanh học 24 CHƯƠNG II. VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 25 2.2 Nội dung nghiên cứu 26 2.2.1 Ổn ñịnh giống vi rút PRRS ñể chế kháng nguyên 26 2.2.2 Chế kháng nguyên cho phản ứng IPMA, ELISA 26 2.2.3 Sử dụng vi rút ñể chế kháng huyết thanh trên Lợn 26 2.2.4 Chuẩn ñộ kháng nguyên và kháng huyết thanh chế ñược 27 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iv 2.2.5 Kiểm tra ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu chẩn ñoán ñối với kháng nguyên và kháng huyết thanh tự chế. 27 2.3. Phương pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Phân lập vi rút trên môi trường tế bào MARC145 27 2.3.2 Phương pháp phát hiện, giám ñịnh vi rút bằng phương pháp realtime 28 2.3.3 Phương pháp chế kháng nguyên và kháng huyết thanh 32 2.3.4 Phương pháp ELISA 34 2.3.5 Phương pháp IPMA 36 2.3.6 Phương pháp kiểm tra ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể tự chế 38 2.3.7 Phương pháp tính TCID50 theo công thức Karber 40 2.3.8 Phương pháp xử lý số liệu 40 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 Nhân giống và chuẩn ñộ vi rút 41 3.2 Chế kháng nguyên cho kít ELISA 43 3.3 Chuẩn ñộ kháng nguyên tự chế bằng phương pháp IPMA, ELISA 45 3.3.1 Kết quả chuẩn ñộ kháng nguyên bằng phản ứng IPMA 45 3.3.2 Kết quả chuẩn ñộ kháng nguyên trên kít ELISA 49 3.4 Theo dõi sự hình thành kháng huyết thanh bằng phản ứng ELISA 52 3.5 Kết quả chuẩn ñộ kháng huyết thanh 54 3.5.1 Chuẩn ñộ kháng huyết thanh bằng phương pháp ELISA 54 3.5.2 Chuẩn ñộ kháng thể bằng phương pháp IPMA 56 3.6 Kiểm tra ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu bằng phản ứng ELISA 59 3.7 Kết quả kiểm tra chế phẩm sau khi chế 61 3.7.1 Tính tinh khiết của kháng nguyên và kháng thể sau khi chế 61 3.7.2 Kết quả kiểm tra tính ổn ñịnh của kháng nguyên và kháng thể băng phương pháp ELISA. 62 3.8 Kết quả so sánh mẫu huyết thanh chẩn ñoán bằng kháng nguyên và kháng th ể tự chế với kít Herdcheck 3X 64 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… v 3.9 Kết quả so sánh 343 mẫu bằng 2 phương pháp ELISA và IPMA 66 3.10 Mỗi tương quan giữa nguyên liệu tự chế và kít Herdcheck 3X 69 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 PHỤ LỤC 77 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Diễn giải Ký hiệu chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt PRRS Porcine reproductive and respiratory syndrome Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn. ELISA Enzyme linked immunosorbent assay Phản ứng ELISA IPMA Immuno-Peroxidase Monolayer Assay Phản ứng miễn dịch có gắn men peroxidase trên tế bào 1 lớp rRT-PCR Phản ứng Realtime-RT PCR real-time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction MARC-145 Tế bào thận khỉ xanh Châu Phi CPE Cytopathic pathogene effect Bệnh tích tế bào FCS Fetal calf serum Huyết thanh thai bê BSC II Bio-safety cabinet Buồng an toàn sinh học cấp II MEM Modified Eagles medium Môi trường nuôi cấy tế bào AEC 3-Amino-9-ethylcarbazole Chất phát màu - IPMA DMSO Dimethylsulfoxide Thành phần trong bảo quản tế bào PBS Phosphate buffered saline Dung dịch muối ñệm phốt phát TCID50 50 % tissue culture infective dose Liều gây nhiễm 50 % tế bào Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Sự tương ñồng về nucleotide của các chủng PRRS khi so sánh với chủng Bắc Mỹ VR2332 7 Bảng 1.2 Một số tên gọi của bệnh 8 Bảng 1.3 Các ñoạn gen mã ñọc mở của vi rút PRRS 9 Bảng 2.1 Danh mục các cặp mồi và mẫu dò 30 Bảng 2.2 Công thức áp dụng cho kít realtime RT-PCR (hãng Invitrogen) 31 Bảng 2.3 Chu kì nhiệt của phản ứng realtime RT-PCR 31 Bảng 2.4 Các bước tiến hành chế kháng nguyên cho phản ứng ELISA 32 Bảng 2.5 Các bước chế kháng nguyên cho phản ứng IPMA, FAT 33 Bảng 2.6 Các bước thực hiện phản ứng ELISA 35 Bảng 2.7 Bảng công thức dịch tễ 2x2 39 Bảng 3.1 Kết quả sau 3 lần chuẩn ñộ vi rút 07196 trên tế bào MARC 42 Bảng 3.2 Kết quả theo dõi sự phát triển bệnh tích tế bào sau 3 ngày 46 Bảng 3.3 Kết quả chuẩn ñộ kháng nguyên 07196 49 Bảng 3.4 Tóm tắt kết quả S/P của kháng nguyên pha loãng 51 Bảng 3.5 Hàm lượng Kháng thể trung bình sau khi công 53 Bảng 3.6 Kết quả chuẩn ñộ kháng huyết thanh bằng 2 kháng nguyên 55 Bảng 3.7 ðộ nhạy và ñộ ñặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể tự chế 60 Bảng 3.8 Sự tinh khiết của sản phẩm sau 14 ngày theo dõi nuôi cấy 62 Bảng 3.9 Sự tính ổn ñịnh của KN, KT 07196 trong 6 tháng bảo quản 63 Bảng 3.10 Kết quả so sánh của 343 mẫu huyết thanh trên 2 phản ứng 65 Bảng 3.11 Kết quả so sánh của 2 phương pháp ELISA và IPMA 66 Bảng 3.12 So sánh của phương pháp ELISA và IPMA 67 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 ðại thực bào khi bị PRRS xâm nhập 6 Hình 1.2 ðại thực bào chưa bị PRRS xâm nhập 6 Hình 1.3 Sơ ñồ hệ gen của vi rút PRRS 10 Hình 1.4 Hệ phả của 5 chủng virus PRRS từ các nước khác nhau 10 Hình 2.1 Mô tả phản ứng ELISA gián tiếp phát hiện kháng thể PRRS 36 Hình 3.1 Hình ảnh 10 chai tế bào trước khi nhiễm 43 Hình 3.2 Ảnh tế bào bình thường 44 Hình 3.3 Tế bào phá hủy 100% 44 Hình 3.4 Xử lý RIPA trên chai tế bào bị phá hủy 44 Hình 3.5 Ảnh chiết tách protein vi rút bằng RIPA 45 Hình 3.6 Hình ảnh dương tính trong phản ứng IPMA 48 Hình 3.7 Hình ảnh âm tính trong phản ứng IPMA 48 Hình 3.8 Biểu ñồ hàm lượng kháng nguyên tự chế 52 Hình 3.9 Biểu ñồ hàm lượng kháng thể tăng theo các tuần sau khi công 54 Hình 3.10 Biểu ñồ kết quả chuẩn ñộ kháng thể sau khi chế 56 Hình 3.11 Kháng huyết thanh pha loãng 1/80 trong phản ứng IPMA 57 Hình 3.12 Kháng huyết thanh pha loãng 1/320 trong phản ứng IPMA 57 Hình 3.13 Kháng huyết thanh pha loãng 1/1280 trong phản ứng IPMA 58 Hình 3.14 Kháng huyết thanh pha loãng 1/5120 trong phản ứng IPMA 58 Hình 3.15 Kháng huyết thanh pha loãng 1/10240 trong phản ứng IPMA 58 Hình 3.16 ðồ thị so sánh 2 phương pháp chuẩn ñoán kháng thể PRRS 68 Hình 3.17 Mối tương quang giữa kháng nguyên, kháng thể tự chế và kít Herdcheck 3X 69 [...]... a kháng nguyên và kháng th ki m tra thì vai trò c a kháng nguyên ñóng vai trò quan tr ng trong ph n ng, m t khác ñ ñánh giá ñư c m u huy t thanh là dương tính thì ph c thu c r t nhi u và m u huy t thanh ñ i ch ng c a ph n ng Do ñó ñ ph c v công tác xét nghi m huy t thanh h c c a b nh PRRS chúng tôi ti n hành nghiên c u ñ tài “Ch kháng nguyên và kháng th kháng vi rút gây h i ch ng r i lo n sinh s n và. .. i dùng các phương pháp huy t thanh h c Do ñó ñ ti n hành nghiên c u ch kháng nguyên và kháng th vi rút gây h i ch ng r i lo n sinh s n và hô h p l n, dùng trong ch n ñoán huy t thanh h c là hư ng ñi ñúng ñ n và h t s c c n thi t Vi c ch ñư c ch ph m này có ý nghĩa khoa h c cao và nó kh ng ñ nh trình ñ khoa h c c a nghành thú y Vi t Nam ñ i v i th gi i, ñ ng th i s b t ñư c ngo i t , có s n ngu n nguyên. .. (96,5%) Vi rút PRRS có th tiêu di t t i 40% ñ i th c bào làm phá hu ph n l n h th ng b o v cơ th và khi n cho các vi khu n và vi rút khác có cơ h i phát tri n và gây b nh Sau khi xâm nh p vào t bào ñ i th c bào chúng nhân lên và phá hu r t nhanh t bào b o v cơ th Vì th vi rút h p th và th c hi n quá trình nhân lên ch trong t bào này và phá hu nó M t t l l n t bào ñ i th c bào trong ph nang ph i b vi rút. .. i, ngo i tr trư ng h p vi rút PRRS Vi rút PRRS có th tiêu di t t i 40% ñ i th c bào làm phá hu ph n l n h th ng b o v cơ th và khi n cho các vi khu n và vi rút khác có cơ h i phát tri n và gây b nh Sau khi xâm nh p vào t bào ñ i th c bào chúng nhân lên và phá hu r t nhanh t bào Lúc ñ u vi rút PRRS kích thích các t bào này, nhưng sau 2 ho c 3 ngày vi rút s gi t ch t chúng, các virion ñư c gi i phóng... nghiên c u ngoài nư c B nh PRRS gây ra tri u ch ng h u h t các lo i l n, nhưng 2 nhóm tri u ch ng cơ b n thư ng th y là h i ch ng r i lo n sinh s n bao g m s y thai, thai ch t và ch t lưu và h i ch ng hô h p bi u hi n b i các d u hi u b ăn, s t và ho Vi rút PRRS là m t lo i vi rút có v b c và là virus RNA chu i ñơn Vi rút này thu c h Arteviridae, gi ng Nidovirales H gen c a vi rút g m có 7 ño n ñ c m mã... …………………… 11 vi rút gây ra PRRS Châu Âu là Lelystad Benfield (1992), Cozelman (1993), Dea (1992), Saito (1996), ñã kh ng ñ nh vi rút gây PRRS có quan h h hàng g n v i vi rút vi m ñ ng m ch ng a, vi rút tăng enzyme lactate dehydrogenase huy t chu t, vi rút gây s t xu t kh Cũng như ñưa ra nh ng ñ c tính quan tr ng c a h Arteriviridae, b Nidovirales Benfield (1992), ñã mô t , ñ t tên cho virus gây b nh B... t t t c vi khu n, vi rút xâm nh p vào cơ th nhưng riêng ñ i v i vi rút PRRS nó không nh ng không b tiêu di t mà còn có th nhân lên trong ñ i th c bào, sau ñó phá hu và gi t ch t ñ i th c bào Vi rút PRRS có 1 ái l c ñ c bi t v i ñ i th c bào, ñ c bi t là ñ i th c bào ph i, ñ i th c bào này còn g i là ñ i th c bào ph nang Chúng có tác d ng tiêu hoá và lo i b các vi khu n và vi rút thâm nh p vào ph i,... Trung Qu c (2005) và Vi t nam t t c các tính bi t và l a tu i l n có th gây l n ch t v i t l cao khi có b i nhi m vi khu n Th b nh m i này ñư c cho là vi rút tai xanh th ñ c l c cao (HP-PRRS) gây ra và khác bi t v i vi rút PRRS th c ñi n ch y u t n công l n nái, l n con và t l ch t do b nh th p Sau khi xu t hi n nhi u t nh Vi t Nam vi rút này ñã lây lan r t nhanh chóng ñ n phía B c và gây thi t h i l... lo n sinh s n và hô h p dùng trong ch n ñoán huy t thanh h c” 2 M c tiêu c a ñ tài: - Ch ñư c kháng nguyên và kháng th cho ph n ng huy t thanh h c - Xác ñ nh m t s tính ch t cơ b n c a kháng nguyên kháng th , ñ m b o ñ tin c y khi ñưa vào ch n ñoán huy t thanh h c b nh PRRS b ng ph n ng ELISA, IPMA 3 ð a ñi m, ñ i tư ng nghiên c u và ý nghĩa khoa h c c a ñ tài [ơ ð a ñi m: Phòng Vi rút - Trung tâm Ch... tư ng l n con ch t và l n nái s y thai và ñi u tr kháng sinh không hi u qu Trong nghiên c u này, ngư i ta ñi u tra m t s nguyên nhân gây b nh trong ñó có h i ch ng r i lo n sinh s n và hô h p ñư c ti n hành l n ði u tra các ñàn l n gia ñình, m t s tr i gi ng c a Nhà nư c và m t s lò m Các nhà khoa h c ñã phát hi n th y kháng th PRRS trong huy t thanh các ñàn l n nuôi gia ñình và có t l lưu hành cao . dùng các phương pháp huyết thanh học. Do ñó ñể tiến hành nghiên cứu chế kháng nguyên và kháng thể vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn, dùng trong chẩn ñoán huyết thanh học. nghiệm huyết thanh học của bệnh PRRS chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài “ Chế kháng nguyên và kháng thể kháng vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp dùng trong chẩn ñoán huyết thanh. DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VI N KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VI T NAM * ðỖ THỊ HOA CHẾ KHÁNG NGUYÊN VÀ KHÁNG THỂ KHÁNG VI RÚT GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP DÙNG TRONG