Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh protein g ứng dụng trong tách chiết igg làm nguyên liệu chế tạo sinh phẩm chẩn đoán miễn dịch học bệnh cho vật nuôi

57 523 0
Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh protein g ứng dụng trong tách chiết igg làm nguyên liệu chế tạo sinh phẩm chẩn đoán miễn dịch học bệnh cho vật nuôi

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP VIỆN NĂM 2014 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG SINH PROTEIN G ỨNG DỤNG TRONG TÁCH CHIẾT IgG LÀM NGUYÊN LIỆU CHẾ TẠO SINH PHẨM CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH HỌC BỆNH CHO VẬT NUÔI MÃ SỐ: V2014 - 17 Thuộc nhóm ngành khoa học: Công nghệ Sinh học Chủ nhiệm đề tài: Ths. Nguyễn Thị Thu Hiền Hà Nội - 2014 DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI STT Họ và tên Chức vụ Đơn vị công tác 1 ThS. Nguyễn Thị Thu Hiền Giảng viên Khoa CNSH – Viện ĐH Mở HN 2 TS. Phạm Thị Tâm Giảng viên Khoa CNSH – Viện ĐH Mở HN 3 TS. Bùi Thị Hải Hòa Giảng viên Khoa CNSH – Viện ĐH Mở HN Đơn vị phối hợp chính: Khoa Công nghệ Sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội MỤC LỤC PHẦN I. MỞ ĐẦU 1 I. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI. 1 II. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 2 III. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3 IV. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1. Đại cương về protein G 3 1.1. Cấu trúc của Protein G 4 1.1.1. Cấu trúc của tiểu đơn vị α. 5 1.1.2. Cấu trúc của tiểu đơn vị βγ. 5 1.2. Cơ chế gắn kết IgG của Protein G 6 1.3. Ứng dụng của Protein G 7 1.4. Tình hình nghiên cứu protein G trong nước và quốc tế. 9 2. Vi khuẩn Streptococcus sp 10 2.1. Đặc điểm hình thái và sinh lý sinh hóa của vi khuẩn Streptococcus sp 11 2.1.1. Đặc điểm hình thái 11 2.1.2. Đặc điểm sinh lý sinh hóa. 11 2.2. Đặc điểm sinh trưởng và khả năng sinh độc tố của Streptococcus sp 13 2.2.1. Đặc điểm sinh trưởng 13 2.2.2. Cấu trúc kháng nguyên 15 2.2.3. Các enzym và độc tố. 16 2.3. Tình hình nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp protein G từ Streptococcus sp 18 V. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 1. Đối tượng nghiên cứu 19 2. Vật liệu nghiên cứu 20 2.1 Hóa chất và thiết bị 20 2.1.1 Thiết bị 20 2.1.2. Hoá chất trong thí nghiệm 21 2.2 Môi trường nuôi vi sinh vật 21 2.2.1. Môi trường phân lập 21 2.2.2. Môi trường lên men 21 3. Phương pháp nghiên cứu 22 3.1 Phương pháp vi sinh 22 3.1.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn Streptococcus sp 22 3.1.2 Các phương pháp sinh hóa. 23 3.2. Phương pháp hóa sinh 25 3.2.1 Quy trình tách chiết, tinh sạch protein G từ vi khuẩn Streptococcus sp 25 3.2.2. Phương pháp thu nhận protein G thô từ Streptococus sp 26 3.2.3. Xác định hàm lượng protein tổng theo phương pháp Bradforfd 26 3.2.4. Phương pháp sắc ký lọc gel Sephadex G-50 27 3.2.5. Phương pháp SDS-PAGE 28 3.3. Phương pháp Elisa gián tiếp kiểm tra khả năng gắn kết kháng thể động vật của Protein G 31 PHẦN II: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32 1. Kết quả phân lập một số chủng vi khuẩn Streptococcus sp 32 1.1. Kết quả sàng lọc các chủng vi khuẩn có hình cầu, gram dương 32 1.2. Đặc điểm hình thái tế bào và đặc tính sinh lí, sinh hoá của các chủng vi khuẩn Streptococcus sp phân lập được 34 2. Kết quả tách chiết và làm sạch protein G từ 7 chủng Streptococcus sp 38 2.1. So sánh hiệu quả kết tủa Protein G bằng aceton và (NH 4 ) 2 SO 4 bão hoà 60% 39 2.2. Kết quả làm sạch Protein thu nhận từ chủng Streptococcus sp S 8.1.1 bằng sắc kí lọc gel 42 3. Kết quả kiểm tra khả năng gắn kết với kháng thể động vật của protein G 43 4. Tinh sạch và thu nhận IgG 45 PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 1. Kết luận 48 2. Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BHIA : Brain Heart Infusin Agar BSA : Bovine Serum Albumin CAMP : Christie, Atkins, Munchpeterson cAMP : Cyclic Adenosine Monophosphate DAG : diacyglycerol DNA : Deoxylribonucleic aicd ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay GTP : Guanosine triphosphate IgG : Immunoglobulin G IP3 : Inositol trisphotphate KIA : Kligler Iron Agar KLPT : Khối lượng phân tử LB : Luria-Bertani MR :Methyl Red OD : Độ đục PBS : Phosphate Buffer Saline PLC : Phospholipase C SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophores TSA : Tryticase Soy Agar V.P : Voges-Proskauer DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 So sánh khả năng gắn kết kháng thể đơn dòng và đa dòng ở động vật có vú của protein G và protein A sử dụng phản ứng ELISA 8 Bảng 1.2 Hiệu suất thu hồi IgG tinh sạch sử dụng protein G Sepharose Fast Flow 10 Bảng 1.3 Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Streptococcus sp 12 Bảng 2.1: Kết quả phân lập 24 chủng vi khuẩn hình cầu, Gram dương 32 Bảng 2.2: Kết quả thử nghiệm sinh hóa trên 24 chủng vi khuẩn đã sàng lọc 36 Bảng 2.3: Kết quả dựng đường chuẩn BSA 40 Bảng 2.4: Kết quả thu hồi Protein G theo hai phương pháp kết tủa bằng aceton và (NH 4 ) 2 SO 4 bão hoà 60% 41 Bảng 2.5. Giá trị OD với các nồng độ khác nhau của kháng thể đa dòng (Pab) phủ giếng 47 DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ Sơ đồ 1: Quy trình phân lập vi khuẩn Streptococcus sp 22 Sơ đồ 2: Quy trình tách chiết và tinh sạch protein G từ vi khuẩn Streptococcus sp 25 Hình 1.1 Cấu trúc không gian của Protein G 4 Hình 1.2 Hình thái vi khuẩn Streptococcus sp 11 Hình 1.3 Tan máu alpha trên MT thạch máu 5% của S. pneumoniae 14 Hình 2.1: Đặc điểm hình thái và sinh hóa của một số chủng Streptococcus sp đã sàng lọc 37 Hình 2.2: Dịch vi khuẩn sau 72 giờ lên men và ly tâm thu tế bào 38 Hình 2.3: Kết quả phản ứng giữa protein G với dung dịch Bradford 39 Hình 2.4: Đồ thị đường chuẩn BSA 40 Hình 2.5: Hình ảnh điện di protein ở các bước tinh sạch của chủng S 8.1.1 42 Hình 2.6: Kết quả phản ứng lai Western blot 43 Hình 2.7: Kết quả ELISA đánh giá khả năng gắn kết với IgG của một số loài động vật 44 1 PHẦN I. MỞ ĐẦU I. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI. IgG (Immunoglobulin G) là lớp kháng thể chính trong máu và dịch ngoại bào, có chức năng kiểm soát và bảo vệ cơ thể với hiện tượng nhiễm trùng. IgG có thể tạo liên kết với tác nhân gây bệnh như: virus, vi khuẩn, nấm thông qua các phương thức: i) ngưng kết và opsonin hóa từ đó thu hút tế bào thực bào, kích thích quá trình thực bào; ii) hoạt hóa hệ thống bổ thể theo con đường cổ điển tạo dòng thác bổ thể để loại bỏ tác nhân gây bệnh; iii) trung hòa độc tố; iv) gây độc trung gian tế bào phụ thuộc kháng thể (ADCC) và phân giải protein nội bào qua kháng thể trung gian. Lớp kháng thể này bắt đầu xuất hiện 24-48 giờ sau kích thích kháng nguyên, có khả năng nhận biết đặc hiệu kháng nguyên kích thícTrong chẩn đoán bệnh ở người, động vật, thậm chí trên cả thực vật, IgG được xác định là công cụ phát hiện tác nhân gây bệnh với độ đặc hiệu cao, đưa ra kết quả chẩn đoán nhanh, có thể thực hiện trên số lượng mẫu lớn vì vậy lớp kháng thể này thường được sử dụng trong hầu hết các chẩn đoán sàng lọc trong giám sát dịch bệnh. Trong các sinh phẩm chẩn đoán miễn dịch học như ELISA, IFAT, Western blot, hóa mô miễn dịch, ngưng kết, miễn dịch so màu… IgG được sử dụng là yếu tố chuẩn để phát hiện kháng nguyên (tác nhân gây bệnh) hoặc là kháng thể cộng hợp để phát hiện phức hợp kháng nguyên-kháng thể. Hiện tại, trên thế giới có hàng ngàn loại sinh phẩm chẩn đoán miễn dịch học, trong thành phần tất cả các sinh phẩm này đều sử dụng IgG. Ở Việt Nam, IgG được sử dụng trong các hệ thống chẩn đoán miễn dịch học đã được thiết lập để xác định bệnh trên người như HIV, viên gan B, ung thư, Trên động vật, IgG được sử dụng trong phản ứng ELISA giám sát huyết thanh học các bệnh: cúm gia cầm, tai xanh ở lợn, thậm chí xác định type virus gây lở mồm long móng trên trâu bò,… Trên thực vật, IgG được sử dụng để phát hiện bệnh làng lùn, lùn xoắn lá ở lúa, bệnh Greening ở cây có múi, bệnh ở khoa tây xoăn lá, nhăn lá, khảm lá ở cây khoai 2 tây do Potato Leaf Roll Virus (PLRV) và Potato Virus X, Y (PVX, PVY)…Tuy nhiên, hầu như các hệ thống chẩn đoán miễn dịch học được thiết lập trong nước chưa được thương mại hóa với lý do chính là chưa có hệ thống tinh sạch IgG có hiệu quả dẫn tới giá thành không hợp lý. IgG có thể được tách chiết bằng các phương pháp như: kết tủa bằng muối amon sulfate, sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực với protein A/G. Trong đó, phương pháp ái lực với protein A hoặc G là phương pháp có hiệu quả tách chiết và tinh sạch cao hơn các phương pháp còn lại. Protein A là thành phần cấu tạo màng tế bào của một số chủng vi khuẩn Staphylococcus aureu, có trọng lượng 42,000 Da, có khả năng liên kết đặc hiệu với mảnh Fc của IgG. Mặc dù protein này không liên kết với IgG của chuột lang, IgG3 của người, IgG1 của chuột nhắt trắng tuy nhiên nó lại có ái lực mạnh với IgG của thỏ vì vậy thường được sử dụng để tách kháng thể trong huyết thanh của loài này. Protein G là yếu tố cấu tạo thành tế bào của vi khuẩn Streptococci chủng G, có khả năng liên kết với IgG tại các mảnh Fc và Fab. Protein G tự nhiên có hai vùng liên kết với các Ig và các vùng liên kết với albumin cũng như bề mặt tế bào. Việc phát hiện được một chủng vi khuẩn Streptococcus sp có khả năng sản sinh protein G là cơ sở để thu nhận và sản xuất protein G làm nguyên liệu tách chiết IgG sử dụng trong công tác điều trị và chẩn đoán bệnh trên người và động vật. Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh protein G ứng dụng trong tách chiết IgG làm nguyên liệu chế tạo sinh phẩm chẩn đoán miễn dịch học bệnh cho vật nuôi”. II. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI - Phân lập và tuyển chọn được chủng vi khuẩn Streptococcus sp có khả năng sinh tổng hợp protein G 3 - Xác định đặc tính sinh lí, sinh hóa chủng vi khuẩn Streptococcus sp phân lập được. - Nghiên cứu thu nhận và tinh sạch protein G Streptococcus sp - Xác định khả năng gắn kết của protein G Streptococcus sp với kháng thể IgG của một số động vật. - Nghiên cứu ứng dụng IgG trong chẩn đoán bệnh tiêu chảy ở lợn con. III. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Để đạt được mục tiêu nghiên cứu trên phải tiến hành một số chuyên đề cụ thể sau: Nội dung 1: Phân lập và tuyển chọn được vi sinh vật có khả năng sinh protein G Nội dung 2: Tinh sạch và tách chiết được protein G Nội dung3:. Đánh giá độ gắn kết của protein G với IgG của một số động vật nuôi (thỏ, gà). Nội dung 4: Nghiên cứu ứng dụng IgG trong chẩn đoán bệnh tiêu chảy ở lợn con. IV. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Đại cương về protein G Protein G là yếu tố cấu tạo thành tế bào của vi khuẩn Streptococci chủng G, có khả năng gắn kết với IgG tại các mảnh Fc và Fab. Protein G tự nhiên có hai vùng gắn kết với các Ig và các vùng gắn kết với albumin cũng như bề mặt tế bào. Protein G được phát hiện nhờ vào thí nghiệm của Martin Rodbell năm 1971 về sự kích hoạt cAMP bởi glucagon. Nhờ thí nghiệm này Martin Rodbell đã phát hiện ra sự hiện diện của GTP là rất quan trọng trong phản ứng này. Ông gọi đây là protein điều hòa guanine nucleotide. Với bản chất là một dị phân tử nằm trong màng tế bào chất, protein G gắn kết với các nucleotit Guanine là GDP và GTP. Được cấu tạo từ ba loại tiểu đơn vị khác nhau, protein G có dạng heterotrime gắn kết với bề mặt bên [...]... g n kết với IgG, nguyên do bởi khả năng g n kết đặc hiệu của bản thân từng loại IgG Protein G không chỉ có khả năng g n kết mạnh với kháng thể đa dòng IgG, ví dụ kháng thể của bò sữa, cừu và ngựa…mà còn g n kết được với kháng thể đa dòng IgG của chuột, IgG3 của người… Bảng 1.1 So sánh khả năng g n kết kháng thể đơn dòng và đa dòng ở động vật có vú của protein G và protein A sử dụng phản ứng ELISA 8 1.4... IgG3 và IgG4 ) Các mối quan hệ của protein A cho IgG thay đổi đáng kể giữa các loài và IgG phân nhóm và đã được đặc trưng rộng rãi( Duhamel et al., 1979, Schwartz 1990) Ở người, protein A có ái lực cao với IgG1 , IgG2 và IgG4 , nhưng kém với IgG3 Trong số bốn phân nhóm IgG ở chuột, Protein A có ái lực yếu nhất cho IgG1 trong khi protein G có ái lực với tất cả bốn lớp IgG Vì vậy, ngoài chức năng là một... chất trung gian dẫn truyền tín hiệu, protein G còn được biết đến với khả năng tinh sạch kháng thể Protein G có khả năng g n với vùng Fc của IgG ở nhiều loài động vật có vú và cả vùng Fab của IgG, do vậy sử dụng protein G tinh sạch IgG có 7 đem lại hiệu quả tốt hơn so với dùng protein A tinh sạch IgG Mặc dù đều được sử dụng làm vật liệu tinh sạch IgG nhưng protein G và protein A khác nhau ở vị trí g n kết... dịch nổi tế bào,… Kháng thể động vật có vú được phân thành các loại chính: IgA, IgD, IgE, IgG và IgM IgG là lớp chủ yếu của kháng thể trong huyết thanh và được tạo ra với số lượng lớn trong các phản ứng miễn dịch thứ cấp Các lớp kháng thể IgG được chia thành các lớp con mà thay đổi tùy thuộc theo loài và các thuộc tính của các thành phần chuỗi nặng Có bốn lớp con của IgG ở người( IgG1 , IgG2 , IgG3 và. .. Trong nghiên cứu này, các nhà khoa học đã nhận thấy rằng, protein G 65kDa của chủng G1 48 và protein G 58kDa của chủng C40 có khả năng g n kết cả IgG và HAS, còn protein G 40kDa của chủng G4 3 lại chỉ có khả ngăng g n kết với IgG Một nghiên cứu khác về biểu hiện và tinh sạch protein G từ Streptococcus tái tổ hợp (Christopher R Goward et al., 1990), các nhà nghiên cứu đã tách gen mã hóa protein G từ chủng. .. nghiêng, thạch ứng, sự tạo thành màu nâu bởi FeS Kết quả khả năng sử dụng đường: phản ứng (+) với lactose khi phần thạch nghiêng chuyển sang vàng, và (+) với glucose khi phần thạch ứng có màu vàng Còn ngược lại không đổi màu là (-) với cả lactose và glucose - Phản ứng thử khả năng sinh Idol: môi trường sử dụng cho phản ứng là môi trường tryptone waster Môi trường được tiệt trùng để nguội và tăng sinh vi. .. vùng B1 và B2 là Glu42 – Val có thể là nguyên nhân sự thay đổi ái lực g n IgG giữa hai vùng B1, B2 Những nghiên cứu này cho thấy, protein G gắn kết với mảnh Fab của IgG yếu hơn so với mảnh Fc 1.3 Ứng dụng của Protein G Protein G được hai nhà khoa học Alfred G Gilman và Martin Rodbell tìm ra và giải thích vai trò của chúng trong quá trình truyền tin bên trong tế bào và nhờ đó được trao giải Nobel Y học. .. hình nghiên cứu protein G trong nước và quốc tế Các nghiên cứu về protein G trong nước còn rất ít, trong khi đó trên thế giới, các nghiên cứu về khả năng g n kết với IgG của protein G khá là phổ biến Theo Langone, 1982, các protein g n kết liên tục với vùng Fc của IgG thì nằm trên bề mặt của các chủng Staphylococci và Streptococci Protein A từ chủng Staphylococcus aureus được biết đến với khả năng g n... IgG (Erntell et al., 1988) Trên phân tử protein G còn có những vùng g n kết độc lập và riêng biệt cho các mảnh Fab và Fc của IgG, ngoài ra nó còn có những cấu trúc dài, cho phép g n đồng thời cả hai mảnh Fab và Fc (Erntell et al., 1988) Hiện tại trên thế giới, người ta đã sử dụng protein G Streptococcal tái tổ hợp để sản xuất kit tinh sạch IgG như g n protein G vào gel Sepharose 4 fast flow và sử dụng. .. người, trong khi protein A không có khả năng g n kết với IgG3 (Guss et al., 1986) Tuy nhiên, protein A có ái lực với IgG đa giá của người cao hơn protein G (Guss et al., 1986; Eliasson et al., 1988) Protein G đã được chứng minh là tương tác với vùng Fab của IgG, nhưng nó lại được xác định là có ái lực tương tác thấp hơn 10 lần so với vùng Fc (Bjorck và Kronvall, 1984) và đã được báo cáo là g n kết . trên người và động vật. Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài: Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh protein G ứng dụng trong tách chiết IgG làm nguyên liệu chế tạo sinh. PROTEIN G ỨNG DỤNG TRONG TÁCH CHIẾT IgG LÀM NGUYÊN LIỆU CHẾ TẠO SINH PHẨM CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH HỌC BỆNH CHO VẬT NUÔI MÃ SỐ: V2014 - 17 Thuộc nhóm ngành khoa học: Công nghệ Sinh học. chuỗi nặng. Có bốn lớp con của IgG ở người( IgG 1 , IgG 2 , IgG 3 và IgG 4 ). Các mối quan hệ của protein A cho IgG thay đổi đáng kể giữa các loài và IgG phân nhóm và đã được đặc trưng rộng rãi(

Ngày đăng: 29/07/2015, 14:33

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

Tài liệu liên quan