BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ LAN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH METRONIDAZOL TRONG NƯỚC THẢI TẠI MỘT SỐ BỆNH VIỆN HÀ NỘI BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LC – MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ LAN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH METRONIDAZOL TRONG NƯỚC THẢI TẠI MỘT SỐ BỆNH VIỆN HÀ NỘI BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LC- MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Thị Thanh Phương ThS. Nguyễn Trung Hiếu Nơi thực hiện: Phòng Hóa Lý – TT kiểm nghiệm dược phẩm - mỹ phẩm Hà Nội HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đối với ThS. Nguyễn Thị Thanh Phương, ThS. Nguyễn Trung Hiếu đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khoá luận này. Em xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích và độc chất – Trường Đại Học Dược Hà Nội, ban giám đốc cùng toàn bộ cán bộ,nhân viên phòng Hóa lý- Trung tâm kiểm nghiệm Dược phẩm – Mỹ phẩm Hà Nội đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để thực hiện đề tài. Em chân thành cảm ơn ban giám hiệu nhà trường, phòng đào tạo, cùng các thầy cô bộ môn hoá phân tích và độc chất và các bộ môn khác của trường Đại Học Dược Hà Nội đã tạo những điều kiện tốt nhất để emhoàn thành quá trình học tập tại trường. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn gia đình,người thân,bạn bè đã luôn khích lệ,chia sẻ,động viên và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 5/2013 Sinh viên Trần Thị Lan MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1.TỔNG QUAN VỀ METRONIDAZOL 3 1.1.1. Công thức cấu tạo 3 1.1.2. Tính chất lý hóa 3 1.1.3. Đặc điểm dược động học 3 1.1.4. Dược lý – dược lâm sàng 4 1.1.5. Chế phẩm chứa metronidazol trên thị trường 5 1.1.6. Một số phương pháp định lượng metronidazol 6 1.2.THỰC TRẠNG NƯỚC THẢI BỆNH VIỆN 7 1.2.1. Thành phần, tính chất nước thải bệnh viện 7 1.2.2. Tình trạng nước thải bệnh viện hiện nay 9 1.3.TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT LC/MS 9 1.3.1. Khái niệm 9 1.3.2. Cấu tạo 9 1.3.3. Một số kỹ thuật LC/MS 15 CHƯƠNG 2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 17 2.1.1. Hóa chất và thiết bị 17 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu 18 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ KẾT QUẢ PHÂN TÍCH 20 CHƯƠNG 3.THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1. CHUẨN BỊ MẪU 22 3.2. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ 24 3.2.1. Khảo sát điều kiện khối phổ 24 3.2.2. Khảo sát điều kiện sắc ký 26 3.2.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu và ảnh hưởng của nền mẫu 28 3.3. KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP 32 3.3.1.Tính thích hợp của hệ thống 32 3.3.2. Độ chọn lọc 32 3.3.3. Khảo sát độ tuyến tính 33 3.3.4. Độ đúng 34 3.3.5. Độ chính xác 35 3.3.6. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 36 3.3.7. Khảo sát độ ổn định 37 3.3.7.1. Độ ổn định trong dung môi 37 3.3.7.2. Độ ổn định trong dung dịch thử 39 3.4. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG MTD TRONG NƯỚC THẢI BỆNH VIỆN 40 3.5. BÀN LUẬN 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT APCI : Atmospheric pressure chemical ionization ( Ion hóa hóa học ở áp suất thường ) BOD : Biochemical Oxygen Demand ( Nhu cầu oxy sinh hóa ) COD : Chemical Oxygen Demand ( Nhu cầu oxy hóa học ) ESI : Electrospray ionization ( Ion hóa phun điện tử ) HPLC : High Performance Liquid Chromatography ( Sắc ký lỏng hiệu năng cao) IT.s : Intensity.seconds ( Cường độ tín hiệu. giây ) LC/MS : Liquid chromatography – Mass spectrometry ( Sắc ký lỏng - khối phổ) LOD : Limit of detection ( Giới hạn phát hiện) LOQ : Limit of quantification ( Giới hạn định lượng) MTD : Metronidazol RSD%: Relative Standard Deviation ( Độ lệch chuẩn tương đối ) SD : Standard Deviation ( Độ lệch chuẩn ) SIM : Selected Ion Monitoring ( Chọn lọc ion ) SPE : Solid phase extraction ( Chiết pha rắn ) SRM : Selected Reaction Monitoring ( Chọn lọc ion con sau phản ứng ) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Giá trị giới hạn các thông số và nồng độ các chất ô nhiễm trong nước thải bệnh viện: QCVN 28:2010/BTNMT 8 Bảng 3.1: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc MTD trong nước ( C) 22 Bảng 3.2: Cách chuẩn bị các mẫu chuẩn MTD trong nước thải 22 Bảng 3.3: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn trong nước ( QC-W) 23 Bảng 3.4: Chuẩn bị các mẫu QC trong nước thải 23 Bảng 3.5: Kết quả khảo sát tỷ lệ thành phần pha động 27 Bảng 3.6: Kết quả khảo sát tốc độ dòng 27 Bảng 3.7: Kết quả đánh giá khả năng chiết của các phương pháp 31 Bảng 3.8: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống 32 Bảng 3.9: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của MTD 34 Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 35 Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp 36 Bảng 3.12: Kết quả độ ổn định của MTD trong dung môi 38 Bảng 3.13: Kết quả độ ổn định của MTD trong nước thải 39 Bảng 3.14: Kết quả phân tích mẫu nước thải bệnh viện 40 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Mô hình hệ thống LC/MS 10 Hình 1.2: Các bộ phận của detector khối phổ 12 Hình 1.3: Bộ ion hóa phun điện tử ESI 13 Hình 1.4: Bộ phân tích tứ cực đơn 14 Hình 1.5: Nguyên lý hoạt động của khối phổ 2 lần MS/MS 15 Hình 2.1: Máy sắc ký lỏng khối phổ Shimadzu LC/MS/MS 8030 17 Hình 2.2: Mô hình thực nghiệm 19 Hình 3.1: Phổ MS của dung dịch chuẩn MTD 5 µg/ml 24 Hình 3.2: Phổ MS 2 của dung dịch chuẩn MTD 5 µg/ml, CE = 15 V 25 Hình 3.3: Phổ MS 2 của dung dịch chuẩn MTD 5 µg/ml, CE = 25 V 25 Hình 3.4: Quy trình chiết MTD trong nước thải bệnh viện bằng chiết lỏng-lỏng 29 Hình 3.5: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn MTD 0,05µg/mL trong nước (a) và khi tiêm mẫu nước thải trắng đã được xử lý chiết lỏng – lỏng (b) 30 Hình 3.6: Sắc ký đồ mẫu nước thải trắng đã qua xử lý chiết pha rắn 30 Hình 3.7: Sắc ký đồ mẫu nước thải trắng (a), mẫu chuẩn MTD (0,005 µg/mL)(b).33 Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích píc và nồng độ MTD 34 Hình 3.9: Sắc ký đồ xác định LOD của dung dịch chuẩn MTD 37 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Nước thải bệnh viện là một trong những mối quan tâm, lo ngại vì chúng có thể gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng và nguy hại đến đời sống con người. Điều quan tâm hàng đầu đối với nước thải của các bệnh viện là vấn đề các vi trùng gây bệnh và thuốc kháng sinh . Các sinh vật được tiếp xúc lâu dài với các chất kháng sinh ở nồng độ thấp trong môi trường sẽ kích thích sự phát triển của các chủng vi khuẩn kháng thuốc và duy trì quần thể các chủng kháng thuốc. Hiện tượng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng trong nhiều loài vi khuẩn gây bệnh cho người, đang là mối quan tâm lo lắng của toàn xã hội. Vi khuẩn kháng kháng sinh làm giới hạn khả năng điều trị nhiễm trùng. Hơn thế nữa, các chủng vi khuẩn không gây bệnh nhưng kháng kháng sinh còn là nơi tồn trữ tính kháng thuốc để truyền cho những vi khuẩn gây bệnh khác. Nhưng tình trạng xử lý nước thải bệnh viện hiện nay lại chưagiám sát được dư lượng thuốc kháng sinh, chưa được đưa vào tiêu chuẩn quản lý. Metronidazol là một dẫn chất thuộc nhóm 5- nitro imidazol, có phổ hoạt tính rộng trên động vật nguyên sinh như amip, Giardia và trên vi khuẩn kị khí. Nên metronidazol có một vị trí rất quan trọng trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn kỵ khí. Vì vậy, việc định lượng hàm lượng kháng sinh metronidazol trong nước thải tại một số bệnh viện trên địa bàn thành phố Hà Nội là rất cần thiết nhằm xác định được tình hình thực trạng dư lượng kháng sinh trong nguồn nước thải và đề xuất những giải pháp quản lý, xử lý phù hợp nhằm đem lại hiệu quả cao và tránh được tình trạng kháng kháng sinh. Hệ thống phân tích LC/MS ra đời là bước nhảy vọt về kỹ thuật phân tích, tạo điều kiện cho các nhà khoa học thực hiện được các nghiên cứu phức tạp. Với ưu điểm vượt trội về độ nhạy và tính đặc hiệu, kỹ thuật phân tích này ngày càng được áp dụng nhiều trong nghiên cứu các chất có hàm lượng thấp. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “ Xây dựng phương pháp định lượng và khảo sát hàm lượng kháng sinh metronidazol trong nước thải một số bệnh viện Hà Nội bằng kỹ thuật LC- MS”. Với các mục tiêu: 2 1. Khảo sát điều kiện định lượng kháng sinh metronidazol bằng kỹ thuật LC- MS. 2. Thẩm định phương pháp định lượng vừa xây dựng. 3. Áp dụng phương pháp để khảo sát hàm lượng kháng sinh metronidazol trong nước thải tại một số bệnh viện Hà Nội. [...]... và mẫu QC được chuẩn bị từ các dung dịch chuẩn làm việc độc lập 24 3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ 3.2.1 Khảo sát điều kiện khối phổ Chúng tôi xây dựng phương pháp định lượng căn cứ vào tài liệu phương pháp định lượng kháng sinh trong nước thải bệnh viện tại Thụy Sĩ bằng LC- MS [35] và phương pháp định lượng MTD trong huyết tương bằng LC- MS/ MS [36], với điều kiện khối phổ: • Kiểu khối phổ: ... ổn định Mẫu nước thải bệnh việnThanh Trì (T301, T311) Hình 2.2:Mô hình thực nghiệm 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Qua nghiên cứu tài liệu tham khảo, chúng tôi căn cứ vào phương pháp định lượng kháng sinh trong nước thải bệnh viện tại Thụy Sĩ bằng LC- MS [35] và phương pháp định lượng MTD trong huyết tương bằng LC- MS/ MS [36] để làm cơ sở xây dựng phương pháp định lượng Tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký và. .. NGHIÊN CỨU - Khảo sát, tối ưu hóa các điều kiện để xây dựng quy trình định lượng metronidazol trong nước thải bệnh viện trên thiết bị LC- MS - Thẩm định phương pháp định lượng ( tính thích hợp, độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ ổn định) - Thu thập và phân tích một số mẫu nước thải bệnh viện trên địa bàn thành phố Hà Nội Tiến hành thực nghiệm... điều kiện khối phổ trên thiết bị LC- MS/ MS (Shimadzu LC/ MS/ MS 8030) sử dụng cột pha đảoApollo C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm) và pha động chứa các thành phần acetonitril, nước điều chỉnh pH = 3 bằng acid acetic đặc Từ kết quả khảo sát, lựa chọn những điều kiện thích hợp để có thể tiến hành định lượng MTD trong nước thải bệnh viện bằng phương pháp HPLC với detector MS Sau đó, tiến hành thẩm định phương pháp theo... 19 Xây dựng phương pháp Thẩm định phương pháp Phân tích một số mẫu thật Chọn điều kiện MS ( mảnh mẹ, mảnh con, thế phân mảnh ) Độ chọn lọc Tính thích hợp Chọn điều kiện sắc ký (cột sắc ký, thành phần pha động, tốc độ dòng, thể tích tiêm) Độ tuyến tính Mẫu nước thải bệnh viện Đại học Y Hà Nội (T101, T111) Độ đúng Độ chính xác Mẫu nước thải bệnh viện Ba Vì (T201, T211) Chọn phương pháp chiết mẫu LOD và. .. của bệnh viện được lấy từ các bệnh viện: + Mẫu nước thải bệnh viện Đại học Y Hà Nội, ngày lấy mẫu 21/11/2012: trước xử lý (ký hiệu T101) và sau xử lý ( ký hiệu T111) + Mẫu nước thải bệnh viện Ba Vì, ngày lấy mẫu 19/11/2012: trước xử lý (ký hiệu T201) và sau xử lý ( ký hiệu T211) + Mẫu nước thải bệnh viện Thanh Trì, ngày lấy mẫu 25/12/2012: trước xử lý (ký hiệu T301) và sau xử lý ( ký hiệu T311) 2.2 NỘI... trong nước thải bệnh viện Từ năm 2009, Viện Y học Lao động & Vệ sinh Môi trường cùng với một số đơn vị như Viện Pasteur Nha Trang, Viện Vệ sinh Dịch tễ Tây Nguyên, Viện Vệ sinh Lao động TP.HCM thực hiện chương trình quan trắc của Bộ Y tế, trong đó có quan trắc nước thải bệnh viện Kết quả quan trắc cho thấy, nước thải bệnh viện có đặc điểm ô nhiễm chủ yếu như nước thải sinh hoạt chứa vi khuẩn ,trong. .. ở 319 nm là 377 Song song tiến hành với chuẩn cùng điều kiện 1.6.1.3 Định lượng bằng đo nitrit: [4] Bằng cách khử nhóm nitro thơm bằng hydro mới sinh thành nhóm amin thơm, định lượng metronidazol dựa vào nhóm chức amin thơm này 7 1.6.1.4 Định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ):[9] Định lượng Metronidazol bằng HPLC với chương trình chạy như sau: - Cột Supelco IC-AB2 C18 (150 x 4,6 mm, 5... tích MS lần 2 Kỹ thuật MS/ MS được sử dụng để tăng độ chọn lọc và tăng độ nhạy do làm giảm nhiễu đường nền đáng kể 16 1.3.3.4 Kỹ thuật SRM ( Selected Reaction Monitoring) Nếu khi lấy khối phổ 2 lần MS/ MS ( MS2 ) mà khối phổ kế chỉ ghi nhận một mảnh ion con mà thôi thì ta nói sử dụng kỹ thuật SRM ( chọn lọc ion con sau phản ứng) Đây là một kỹ thuật định lượng khá chính xác 17 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG... theo thời gian Kỹ thuật SIM có tác dụng làm giảm bớt nhiễu đường nền và do đó tăng độ nhạy ( tăng tỉ lệ tín hiệu/ nhiễu đường nền) Kỹ thuật SIM nhạy hơn Fullscan Kỹ thuật này thuận lợi để phân tích dư lượng một chất đã biết trong một mẫu phức tạp 1.3.3.3 Kỹ thuật MS/ MS Kỹ thuật này chọn một ion ở chế độ MS lần 1, ion đó được phân tích tiếp bằng cách sử dụng năng lượng bẻ gãy tạo ra một hoặc vài ion con . DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ LAN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH METRONIDAZOL TRONG NƯỚC THẢI TẠI MỘT SỐ BỆNH VIỆN HÀ NỘI BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ. phương pháp định lượng và khảo sát hàm lượng kháng sinh metronidazol trong nước thải một số bệnh viện Hà Nội bằng kỹ thuật LC- MS”. Với các mục tiêu: 2 1. Khảo sát điều kiện định lượng. lượng kháng sinh metronidazol bằng kỹ thuật LC- MS. 2. Thẩm định phương pháp định lượng vừa xây dựng. 3. Áp dụng phương pháp để khảo sát hàm lượng kháng sinh metronidazol trong nước thải tại một