BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ HÒA XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦA ATENOLOL TRONG CHẾ PHẨM BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI -2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ HÒA XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦA ATENOLOL TRONG CHẾ PHẨM BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. Th.S. Vũ Ngân Bình 2. DS. Ngô Minh Thúy Nơi thực hiện đề tài: 1. Bộ môn Hóa phân tích & Độc chất Trường Đại học Dược Hà Nội 2. Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Vũ Ngân Bình – Bộ môn Hóa phân tích và độc chất- Trường Đại học Dược Hà Nội, DS. Ngô Minh Thúy và PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh – Phòng Quản lý khoa học – Trường Đại học Dược Hà Nội, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận. Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô giáo, các anh/ chị kỹ thuật viên tại Bộ môn Hóa phân tích và độc chất- Trường Đại học Dược Hà Nội cũng như toàn thể anh/ chị cán bộ, công nhân viên tại Labo Hóa – Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo và các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt năm năm em học tập tại trường. Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, bạn bè, và những người luôn theo sát chăm lo, động viên, kích lệ em trong học tập và cuộc sống. Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2014 Sinh viên Đỗ Thị Hòa MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ ATENOLOL 3 1.1.1. Tính chất lý, hóa 3 1.1.2. Dược lý và cơ chế tác dụng 4 1.2. TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT ĐIỆN DI MAO QUẢN 6 1.2.1. Khái niệm 6 1.2.2. Nguyên lý của quá trình điện di mao quản 7 1.2.3. Điện di mao quản vùng 9 1.3. VÀI NÉT VỀ PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC 10 1.3.1. Đồng phân quang học 10 1.3.2. Phương pháp phân tách đồng phân đối quang 10 1.3.3. Ứng dụng điện di mao quản trong phân tích đồng phân quang học 12 1.4. TÁCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG BẰNG CE SỬ DỤNG CYCLODEXTRIN LÀ TÁC NHÂN CHỌN LỌC ĐỐI QUANG 13 1.4.1. Tổng quan về Cyclodextrin 13 1.4.2. Tách đồng phân đối quang sử dụng Cyclodextrin là tác nhân chọn lọc đối quang 15 1.5. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦA ATENOLOL 16 1.5.1. Nghiên cứu trong nước 16 1.5.2. Nghiên cứu trên thế giới 17 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 19 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 19 2.1.2. Dung môi và hóa chất 19 2.1.3. Trang thiết bị 19 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 20 2.2.1. Hoàn thiện phương pháp định lượng đồng phân đối quang của Atenolol bằng điện di mao quản 20 2.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng đồng phân đối quang của Atenolol bằng điện di mao quản 20 2.2.3. Ứng dụng phương pháp này định lượng chế phẩm có chứa Atenolol trên thị trường 21 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.3.1. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn, dung dịch mẫu và các dung dịch làm việc 21 2.3.2. Khảo sát và lựa chọn điều kiện điện di 22 2.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích 23 2.3.4. Ứng dụng định lượng Atenolol trong các chế phẩm trên thị trường 23 2.3.5. Phương pháp xử lí số liệu 23 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25 3.1. KHẢO SÁT VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN ĐIỆN DI 25 3.1.1. Lựa chọn cột mao quản 25 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của điện thế áp vào hai đầu mao quản. 26 3.2. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 28 3.2.1. Độ phù hợp hệ thống 28 3.2.2. Khoảng nồng độ tuyến tính 29 3.2.3. Độ đặc hiệu 31 3.2.4. Độ lặp lại 33 3.2.5. Độ đúng 34 3.3. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG ATENOLOL TRONG CHẾ PHẨM. 36 BÀN LUẬN 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT BGE (Background Electrolyte) Dung dịch điện ly nền CE (Capillary Electrophoresis) Điện di mao quản CGE (Capillary Gel Electrophoresis) Điện di mao quản gel CIEF (capillary isoelectric focusing) Điện di mao quản hội tụ đẳng điện CITP (capillary isotachophoresis) Điện di mao quản đẳng tốc CM-β-CD Carboxymethyl beta cyclodextrin CZE (Capillary Zone Electrophoresis) Điện di mao quản vùng DM- β-CD Dimethyl beta cyclodextrin EOF ( Electro-osmotic flow ) Dòng điện thẩm GC (Gas Chromatography) Sắc ký khí HPCE (High Performance Capillary Electrophoresis) HPLC ( High Performance Liquid Chromatography) Sắc ký lỏng hiệu năng cao MEKC (Micellar Electrokinetic Chromatography) Sắc ký điện động mixen R s (Resolution) Độ phân giải RSD ( Relative Standard Deviation ) Độ lệch chuẩn tương đối SD (Standard Deviation) Độ lệch chuẩn SĐK Số đăng ký SFC (Supercritical fluid chromatography) Sắc ký lỏng siêu tới hạn SKS Số kiểm soát TLC (Thin layer chromatography) Sắc ký lớp mỏng Tris Tris(Hydroxymethy) amimomethan β-CD Beta cyclodextrin DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Tính chất của một số CD tự nhiên. 14 Bảng 2: Độ phù hợp hệ thống 28 Bảng 3: Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn Atenolol racemic 29 Bảng 4: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính 30 Bảng 5: Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu thử M1 34 Bảng 6: Kết quả xác định phần trăm tìm lại trên mẫu M1(thêm 10%) 35 Bảng 7: Kết quả xác định phần trăm tìm lại trên mẫu M1(thêm 20%) 36 Bảng 8: Kết quả định lượng mẫu M2 37 DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1: Công thức cấu tạo của Atenolol 3 Hình 2: Sơ đồ hệ thống điện di mao quản. 7 Hình 3: Sự hình thành dòng EOF 8 Hình 4: Giá trị thực của hiệu điện thế 25 Hình 5: Giá trị thực của cường độ dòng điện: 26 Hình 6: Điện di đồ ở 3 hiệu điện thế 27 Hình 7: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic của S-(-)-Atenolol theo nồng độ S-(-)-Atenolol 30 Hình 8: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic của R-(+)-Atenolol theo nồng độ R-(+)-Atenolol 31 Hình 9: Điện di đồ mẫu placebo 32 Hình 10: Điện đi đồ mẫu Atenolol racemic chuẩn 100 ppm. 32 Hình 11: Điện di đồ mẫu thử 100 ppm. 32 Hình 12: Điện di đồ mẫu M2 37 Hình 13: Vị trí tương tác liên kết hydro[22]. 39 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, trong điều trị trên lâm sàng đã sử dụng ngày càng nhiều các thuốc có chứa hoạt chất là các dạng đồng phân quang học tinh khiết, giúp nâng cao hiệu quả điều trị, giảm liều dùng và hạn chế được nhiều tác dụng không mong muốn so với khi dùng thuốc có chứa hoạt chất ở dạng hỗn hợp racemic. Ví dụ như levofloxacin (đồng phân tả tuyền của ofloxacin) có tác dụng kháng khuẩn mạnh gấp hàng chục đến hàng trăm lần dextrofloxacin (đồng phân hữu tuyền của ofloxacin) [4], hoặc dexchlorpheniramin maleat (đồng phân hữu tuyền của chlorpheniramin maleat) là một thuốc kháng Histamin H 1 dùng điều trị dị ứng có tác dụng mạnh gấp hai lần chlorpheniramin maleat (dạng racemic) với cùng liều lượng do dạng đồng phân tả tuyền không có tác dụng, do đó cho phép giảm liều dùng chỉ còn một nửa [3]. Trong cuộc sống hiện đại ngày nay, xu hướng các bệnh về tim mạch ngày càng tăng nhanh. Đối với nhóm thuốc tim mạch thì thời gian điều trị thường kéo dài, do đó việc sử dụng dạng đồng phân quang học tinh khiết lại càng có ý nghĩa quan trọng. Atenolol là dẫn chất của benzenacetamid, có tác dụng chẹn chọn lọc trên thụ thể β 1 - adrenergic, dùng điều trị tăng huyết áp, đau thắt ngực mạn tính ổn định, nhồi máu cơ tim sớm (trong vòng 12 giờ đầu) và dự phòng sau nhồi máu cơ tim, loạn nhịp nhanh trên thất [2]. Với một carbon bất đối trong phân tử, Atenolol là hỗn hợp racemic của hai đồng phân đối quang: S-(-)-Atenolol và R-(+)-Atenolol. Một số nghiên cứu đã chứng minh và chỉ ra rằng S-(-)-Atenolol đóng vai trò chính trong chẹn β giao cảm khi dùng Atenolol dạng hỗn hợp racemic, đồng thời độc tính cũng thấp hơn so với dạng R-(+)-Atenolol [20],[21]. Do đó việc sản xuất và sử dụng đồng phân S-(-)-Atenolol ngày càng được quan tâm nhiều hơn. Điều này đòi hỏi phải xây dựng phương pháp phân tách và định lượng được từng dạng đơn đồng phân trong hỗn hợp racemic của Atenolol. Trong những năm gần đây, kỹ thuật điện di mao quản (Capillary Electrophoresis - CE) là phương pháp hóa lý được các nhà phân tích lựa chọn trong lĩnh vực tách các đồng phân quang học với nhiều lý do: hiệu lực tách cao, lượng 2 mẫu và hóa chất sử dụng nhỏ, thiết bị hoàn toàn tự động, cơ chế tách đơn giản và dễ dàng trong phát triển phương pháp [16], [19], [22]. Tại Việt Nam, việc áp dụng kỹ thuật điện di mao quản trong phân tích kiểm nghiệm vẫn còn hạn chế. Để nâng cao năng lực kiểm tra chất lượng thuốc của hệ thống kiểm nghiệm cũng như hội nhập với xu hướng phát triển của ngành Dược trên thế giới, chúng tôi thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng các đồng phân đối quang của Atenolol trong chế phẩm bằng điện di mao quản” với hai mục tiêu: 1. Thẩm định phương pháp định lượng đồng phân đối quang của Atenolol bằng điện di mao quản. 2. Ứng dụng phương pháp này định lượng chế phẩm có chứa Atenolol trên thị trường. [...]... với thể tích khác nhau, bình định mức với thể tích khác nhau  Các dụng cụ khác: cốc có mỏ, giấy lọc, phễu thủy tinh… 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.2.1 Hoàn thiện phương pháp định lượng đồng phân đối quang của Atenolol bằng điện di mao quản  Lựa chọn cột mao quản  Lựa chọn hiệu điện thế 2.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng đồng phân đối quang của Atenolol bằng điện di mao quản  Độ phù hợp hệ thống ... Linh độ là hàm số của điện tích chất phân tích và kích thước trong điều kiện nhất định của phương pháp Chúng được tối ưu hóa bằng cách kiểm soát các thành phần của đệm, pH và lực ion Điện di mao quản vùng sử dụng nguyên lý của điện di và điện thẩm để tách các tiểu phân tích điện Linh độ điện di của ion (EP), được biễu di n bằng phương trình: EP = q/(6πηr) (1) Trong đó q là điện tích của ion,  là độ... 1.3.3 Ứng dụng điện di mao quản trong phân tích đồng phân quang học Hầu hết các thuốc là hợp chất đối quang và mỗi đồng phân thể hiện tác dụng dược lý và độc tính riêng biệt Do đó, phân tách đồng phân đối quang là cần thiết trong phân tích dược phẩm để có được những đồng phân an toàn và có tác dụng mong muốn Cho đến nay phương pháp phân tích được sử dụng cho việc tách đồng phân đối quang bao gồm sắc... % ℎ = × 100% ê Trong đó: Sthử: di n tích pic của mỗi đồng phân trong mẫu thử Schuẩn: di n tích pic của mỗi đồng phân trong mẫu chuẩn mchuẩn: khối lượng Atenolol racemic chuẩn mthử: khối lượng bột viên mth: khối lượng thu hồi của mỗi đồng phân mthêm: khối lượng chuẩn thêm của mỗi đồng phân : Hàm lượng trung bình của mỗi đồng phân trong một viên Cchuẩn: hàm lượng Atenolol racemic khan trong chất chuẩn... rectus (phải)) Nếu đồng phân quang học đó quay mặt phẳng ánh sáng sang bên trái thì nó được gọi là đồng phân quay trái S (tiếng Latinh: siniter (trái)) Hỗn hợp racemic có chứa số phân tử bằng nhau của mỗi dạng đối quang, do đó độ quay cực tổng cộng bằng không [5], [9], [15] 1.3.2 Phương pháp phân tách đồng phân đối quang 1.3.2.1 Phương pháp phân tách đồng phân đối quang gián tiếp 11 Phương pháp này dựa trên... thẩm định để đảm bảo phương pháp xây dựng được là phù hợp Các tiêu chí cần thẩm định bao gồm: độ phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng nồng độ tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng của phương pháp 2.3.4 Ứng dụng định lượng Atenolol trong các chế phẩm trên thị trường Tiến hành điện di các mẫu chuẩn Atenolol racemic và mẫu thử Dựa vào di n tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn, hàm lượng Atenolol racemic của. .. dàng trong phát triển phương pháp [9], [19] Việc tách đồng phân đối quang bằng CE có thể được thực hiện bằng phương pháp gián tiếp hoặc trực tiếp Các phương pháp trực tiếp thuận lợi hơn các phương pháp gián tiếp do sự đơn giản và tính sẵn có của một loạt các tác nhân chọn lọc đối quang như cyclodextrins (CDs), ether vòng được tetracarboxylat hóa và kháng sinh tạo phức lồng với các đồng phân đối quang Trong. .. 12 cho phân tách đồng phân quang học của acid amin Tuy nhiên cũng đã có những nghiên cứu áp dụng phương pháp này với dược chất [12] 1.3.2.2 Phương pháp phân tách đồng phân đối quang trực tiếp Phương pháp tách trực tiếp được áp dụng thành công trong CE cho việc tách đồng phân đối quang của một số nhóm hợp chất, chủ yếu là dược phẩm Tác nhân chọn lọc đối quang hoặc có thể được thêm vào dung dịch điện ly... chromatography - MEKC)  Điện di mao quản gel (capillary gel electrophoresis - CGE) 9  Điện di mao quản hội tụ đẳng điện (capillary isoelectric focusing - CIEF)  Điện di mao quản đẳng tốc (capillary isotachophoresis - CITP) [1], [6] 1.2.3 Điện di mao quản vùng Trong điện di mao quản vùng, quá trình tách được kiểm soát bằng sự khác nhau về linh độ tương đối của từng thành phần trong mẫu thử hoặc dung... đệm phosphat pH 7,0 ở mao quản không có lớp bao, thông thường trình tự xuất hiện các chất tan trong điện di đồ là các cation, các chất trung tính và các anion Hiện nay, có 5 loại điện di mao quản chủ yếu:  Điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis - CZE) còn gọi là điện di dung dịch tự do hay điện di mao quản dòng tự do  Sắc ký mixen điện động, còn gọi là sắc ký điện động mixen (micellar . Hoàn thiện phương pháp định lượng đồng phân đối quang của Atenolol bằng điện di mao quản 20 2.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng đồng phân đối quang của Atenolol bằng điện di mao quản 20 2.2.3 quang của Atenolol trong chế phẩm bằng điện di mao quản với hai mục tiêu: 1. Thẩm định phương pháp định lượng đồng phân đối quang của Atenolol bằng điện di mao quản. 2. Ứng dụng phương pháp. quang học 10 1.3.2. Phương pháp phân tách đồng phân đối quang 10 1.3.3. Ứng dụng điện di mao quản trong phân tích đồng phân quang học 12 1.4. TÁCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG BẰNG CE SỬ DỤNG CYCLODEXTRIN