BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU TRANG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ THỬ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƢ CỦA LÁ CÂY MÃNG CẦU XIÊM (ANNONA MURICATA L.), HỌ ANNONACEAE KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Hà Nội, năm 2014 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU TRANG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ THỬ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƢ CỦA LÁ CÂY MÃNG CẦU XIÊM (ANNONA MURICATA L.), HỌ ANNONACEAE KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: TS Đỗ Quyên ThS, NCS Hồ Đắc Hùng Nơi thực hiện: Bộ môn Dƣợc liệu, trƣờng ĐH Dƣợc, Hà Nội Viện Hóa học, Viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam Hà Nội, năm 2014 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Đỗ Quyên, ngƣời thầy ủng hộ, giúp đỡ, tận tình bảo tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình làm khố luận Tơi xin chân thành cảm ơn PGS., TS Phạm Gia Điền, TS Bùi Kim Anh, Th.S, NCS Hồ Đắc Hùng giúp đỡ, góp ý cho tơi q trình làm khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn cán Phịng Cơng nghệ hoạt chất sinh học, Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện cho tơi hồn thành khố luận Nhân dịp này, tơi xin bày tỏ kính trọng cảm ơn tới Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo thầy cô giáo trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đồng hành, tạo điều kiện cho đƣợc học tập, tiếp thu kiến thức kinh nghiệm quý báu suốt năm học Xin cảm ơn gia đình bạn bè ln động viên tơi để tơi có thêm nghị lực say mê nghiên cứu khoa học Hà nội, ngày 14 tháng năm 2014 Nguyễn Thu Trang MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN ii DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ CÁC HÌNH iii MỤC LỤC iv ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I- TỔNG QUAN 1.1 Vị trí phân loại đặc điểm thực vật 1.1.1 Vị trí phân loại lồi Mãng cầu xiêm 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố chi Annona 1.1.3 Đặc điểm thực vật phân bố lồi Annona muricata L 1.2 Thành phần hóa học 1.2.1 Các hợp chất acetogenin 1.2.2 Các hợp chất alcaloit 1.2.3 Tinh dầu 1.2.4 Sterol 1.2.5 Carotenoit 1.2.6 Các nhóm chất khác 1.3 Tác dụng sinh học 1.4 Công dụng 12 CHƢƠNG 2- NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ 14 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị 14 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 14 2.1.2 Dung mơi, hóa chất 14 2.1.3 Thiết bị 14 2.1.3.1 Dùng cho chiết xuất, định tính phân lập 14 2.1.3.2 Dùng cho xác định thông số vật lý hóa học chất 15 2.1.3.3 Dùng cho thử hoạt tính gây độc tế bào 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Nghiên cứu hoá học 16 2.3.1.1 Chiết xuất 16 2.3.1.2 Phân lập 17 2.3.1.3 Nhận dạng 17 2.3.2 Thử tác dụng gây độc tế bào 17 2.3.2.1 Các dòng tế bào 17 2.3.2.2 Phƣơng pháp thử tác dụng gây độc tế bào 17 CHƢƠNG 3- THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1 Thực nghiệm kết 19 3.1.1 Chiết xuất 19 3.1.2 Tác dụng gây độc tế bào ung thƣ 21 3.1.3 Phân lập chất từ dịch chiết n-hexan 22 3.1.3.1 Khảo sát sơ cặn dịch chiết n-hexan SKLM 22 3.1.3.2 Phân lập cặn dịch chiết n-hexan Mãng cầu xiêm sắc 24 ký cột 3.1.3.3 Phân lập chất từ phân đoạn P27 27 3.1.3.4 Phân lập chất từ phân đoạn P71 28 3.1.3.5 Phân lập chất từ phân đoạn P55 29 3.1.4 Nhận dạng cấu trúc 30 3.1.4.1 Nhận dạng cấu trúc chất P27 30 3.1.4.2 Nhận dạng cấu trúc Chất P71 31 3.1.4.3 Nhận dạng cấu trúc Chất P55.7 33 3.2 Bàn luận 36 3.2.1 Tác dụng gây độc tế bào dịch chiết n-hexan từ 36 Mãng cầu xiêm 3.2.2 Về thành phần hoá học 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC 46 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN H-NMR 13 C-NMR Proton Nuclear magnetic resonance Cacbon (13) Nuclear magnetic resonance AST Ánh sáng thƣờng ATCC American type culture collection DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer DMEM Eagle's minimal essential medium DMSO Dimethyl sulfoxide EC50 The term half maximal effective concentration EI-MS Electron ionization – Mass sprectromery IC50 The half maximal inhibitory concentration J (Hz) Hằng số tƣơng tác tính Hertz KB Human epidermic carcinoma LU Human lung carcinoma MCF7 Human breast adenocarcinoma RPMI Roswell Park Memorial Institute medium SKLM Sắc ký lớp mỏng STT Số thứ tự TMS Tetramethylsilane UV Ultra violet d Duplet dd Duplet duplet m Multiplet t Triplet δ (ppm) Độ chuyển dịch hóa học tính ppm ppm Phần triệu DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ CÁC HÌNH Danh mục hình Hình 1.1: Khung cấu trúc chung acetogenin Hình 1.2: Cấu trúc hố học acetogenin mạch thẳng Hình 1.3: Cấu trúc hố học acetogenin có nhóm epoxy Hình 1.4: Cấu trúc hố học acetogenin có nhóm tetrahyrofuran Hình 1.5: Cấu trúc hố học acetogenin có nhóm tetrahyrofuran Hình 1.6: Khung cấu trúc nhóm alcaloit Hình 1.7: Khung cấu trúc sterol Hình 3.1: Sơ đồ chiết xuất bột Mãng cầu xiêm 20 Hình 3.2: Sắc kí đồ cặn dịch chiết n-hexan mãng cầu xiêm 22 hệ dung môi khác quan sát AST Hình 3.3: Sắc ký đồ cặn dịch chiết n-hexan hệ dung mơi 23 Toluen:Etyl acetat:Acid acetic [40:10:1] Hình 3.4: Sắc kí đồ chất P27 hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH 27 [98:2], màu ceri sulfat Hình 3.5: Sắc ký đồ chất P71 hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH 29 [9:1], màu ceri sulfat Hình 3.6: Sắc ký đồ chất P55.7 hệ dung môi CH2Cl2 : EtOAc 30 [8:2], quan sát AST Hình 3.7: Cơng thức cấu tạo β-sitosterol (P27) 31 Hình 3.8: Cơng thức cấu tạo β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosit 33 (P71) Hình 3.9: Cơng thức cấu tạo lutein (P55.7) 35 Danh mục bảng Bảng 3.1: Hàm lƣợng cặn dịch chiết Mãng cầu xiêm 19 Bảng 3.2: Kết thử hoạt tính độc tế bào cặn dịch chiết n-hexan từ 21 Mãng cầu xiêm Bảng 3.3: Kết SKLM cặn dịch chiết n-hexan hệ dung môi 24 Toluen:Etyl acetat:Acid acetic [40:10:1] Bảng 3.4.1: Số liệu phổ NMR hợp chất P55.7 lutein [10] 34 Bảng 3.4.2: Số liệu phổ NMR hợp chất P55.7 lutein [10] (tiếp) 35 49 Phụ lục 2b: Phổ 1H-NMR chất P71 (ß-sitosterol-3-O-ß-D-glucopyranosit) 50 Phụ lục 2c: Phổ 1H-NMR chất P71 (ß-sitosterol-3-O-ß-D-glucopyranosit) 51 Phụ lục 3a: Phổ 13C-NMR chất P71 (ß-sitosterol-3-O-ß-D-glucopyranosit) 52 Phụ lục 3b: Phổ 13C-NMR chất P71 (ß-sitosterol-3-O-ß-D-glucopyranosit) 53 Phụ lục 4a: Phổ DEPT chất P71 (ß-sitosterol-3-O-ß-D-glucopyranosit) 54 Phụ lục 4b: Phổ 13C-DEPT chất P71 (ß-sitosterol-3-O-ß-Dglucopyranosit) 55 Phụ lục 5a: Phổ 1H-NMR chất P55.7 (lutein) 56 Phụ lục 5b: Phổ 1H-NMR chất P55.7 (lutein) 57 Phụ lục 5c: Phổ 1H-NMR chất P55.7 (lutein) 58 Phụ lục 6a: Phổ 13C-NMR chất P55.7 (lutein) 59 Phụ lục 6b: Phổ 13C-NMR lutein 60 Phụ lục 6c: Phổ 13C-NMR chất P55.7 (lutein) 61 Phụ lục 7: Phổ DEPT chất P55.7 (lutein) Phụ lục 8: Phổ ESI-MS chất P55.7 (lutein) 400 450 MSD Trap Report v (A4-Opt2) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Intens x105 1.2 Analysis Nam e: 14012101.d DO MS.m M ethod: Sam ple N am e: MH7 Analysis Info: 500 Page of 550 569.5 I nstrum ent: Agilent 6310 Ion Trap Phong PTHC, Vien Hoa HCTN Operator: 600 650 m/z +MS, 4.8min #321 Print Date: 1/21/2014 9:53:56 AM Acq Date: 1/21/2014 9:45:18 AM Display Report - Selected Window Selected Analysis 62 63 ...BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU TRANG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ THỬ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƢ CỦA L? ? CÂY MÃNG CẦU XIÊM (ANNONA MURICATA L. ), HỌ ANNONACEAE KHOÁ LUẬN... 23,2 (C-1 5); 25,4 (C-2 3); 27,7 (C-1 6); 28,7 (C- 33 2 5); 29,2 (C- 2); 31,3 (C- 7); 31,4 (C- 8); 33,3 (C-2 2); 35,4 (C-2 0); 36,2 (C-1 0); 36,8 (C- 1); 38,3 (C- 4); 39,2 (C-1 2); 41,8 (C-1 3); 45,1 (C-2 4); ... alcol: elemol, (E)-nerolidol, spathulenol, globulol, epi-globulol, 1- epi-cubenol, -epi-cadinol, -epi-muurolol, -cadinol hợp chất có hàm l? ?ợng cao l? ?: -caryophyllene (1 3,6 %), -cadiene (9 ,1 %),