BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VŨ THỊ NGỌC BÍCH NGHIÊN CỨU XỬ LÝ SINH KHỐI Bacillus clausii ĐỂ THU BÀO TỬ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VŨ THỊ NGỌC BÍCH NGHIÊN CỨU XỬ LÝ SINH KHỐI Bacillus clausii ĐỂ THU BÀO TỬ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Đàm Thanh Xuân Nơi thực hiện: D HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Với tất cả sự kính trọng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới cô giáo TS. Đàm Thanh Xuân – Giảng viên bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội, người đã luôn động viên, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn DS. Lê Ngọc Khánh, cùng toàn thể các thầy cô giáo và các anh chị kĩ thuật viên bộ môn Công nghiệp Dược đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu để hoàn thành khóa luận. Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dìu dắt tôi trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn ở bên, động viên và giúp đỡ tôi trong cuộc sống và học tập. Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Vũ Thị Ngọc Bích MỤC LỤC Lời cảm ơn Mục lục Các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình Đặt vấn đề ………………… ………………………………….…… …… 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1. Đại cƣơng về probiotics 1.1.1. Định nghĩa .…………… ……… ………………………… ………2 1.1.2. Lịch sử phát triển của probiotics …… ………………… ………… 2 1.1.3. Vai trò của probiotics … ……………………………… ………… 2 1.1.4. Các chế phẩm probiotics trên thị trường ……… …… ….………… 4 1.2. Bacillus clausii 1.2.1. Bacillus clausii ……….………………… ………… ……………….5 1.2.2. Bào tử Bacillus clausii …………………………… ………………….7 1.3. Sự hình thành bào tử và các phƣơng pháp thu bào tử 1.3.1. Sự hình thành bào tử ……………… ……………………………… 10 1.3.2. Sức đề kháng của bào tử ……………… ……………………………11 1.3.3. Các phương pháp giải phóng nội bào tử ……………… ……………11 Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị 2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất … … …………………… ………… …….14 2.1.2. Máy móc, thiết bị ……… ……….…………… ………………… 15 2.1.3. Môi trường sử dụng …………………………… …… ………….16 2.2. Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Lựa chọn các phương pháp xử lý sinh khối Bacillus clausii để tạo nguyên liệu chứa bào tử ………………………………………… ……… 16 quá trình bảo quản …………… ………………………… ……… ……17 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina … ……… ………… 17 2.3.2. Giữ giống trên thạch nghiêng …………… ………… …………….17 2.3.3. Chuẩn bị dịch nhân giống ……………………………… ……… …17 2.3.4. Phương pháp thu bào tử ………………………………… …….……18 2.3.5. Phương pháp đếm số lượng bào tử còn sống trong một lượng sản phẩm thu được theo nguyên tắc pha loãng liên tục .……… ……… ………… 20 2.3.6. Kiểm tra khả năng bào tử bị nảy mầm trở lại trong điều kiện bảo quản 21 Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Lựa chọn các phƣơng pháp xử lý sinh khối Bacillus clausii để tạo nguyên liệu chứa bào tử 3.1.1. Xử lý nhiệt sinh khối tế bào tạo nguyên liệu thô……… ……………22 3.1.2. Giải phóng nội bào tử từ nguyên liệu thô bằng phương pháp vật lý (phương pháp siêu âm) …………………………………………… ……….23 3.1.3. Giải phóng nội bào tử từ nguyên liệu thô bằng phương pháp hóa học …………………………………………………….…………………………24 3.1.4. Sử dụng tác nhân sinh học (enzyme lysozyme) …………… …… 29 trong quá trình bảo quản 2 SO 4 10% (80˚C).………….32 3.2.2. Khảo sát khả năng bào tử bị nảy mầm trở lại trong quá trình bảo quản 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………… …….…………….……… 36 Tài liệu tham khảo DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AAD Antibiotic Associated Diarrhea Bệnh tiêu chảy liên quan đến kháng sinh ADN Acid Deoxyribo Nucleic ATTC American Type Culture Bảo tàng giống vi sinh vật Mỹ B. clausii Bacillus clausii B. subtilis Bacillus subtilis B. coagulans Bacillus coagulans CFU Colony Forming Units Số đơn vị khuẩn lạc E. coli Escherichia coli EDTA Ethylen Diamine Tetra Acetic acid IBD Inflammatory Bowel Diseases Bệnh viêm ruột cấp LAB Lactic Acid Bacteria Nhóm vi khuẩn lactic SDS Sodium Dodecin Sulfate DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu. Bảng 2.2: Các máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu. 3.3: 2 SO 4 . Bảng 3.2: Kết quả đếm số lượng bào tử sống sót sau quá trình xử lý bằng 2 tác nhân là H 2 SO 4 10% (80°C) và lysozyme. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1: VSL#3 là hỗn hợp gồm 1 loài Streptococcus, 3 loài Bifidobacterium và 4 loài Lactobacillus. Hình 1.2: Sản phẩm Yakult nổi tiếng của Yakult Nhật Bản được công bố có chứa L. casei Shirota. Hình 1.3: Sản phẩm Biosubtyl-II của công ty vacxin và sinh phẩm số 2, Nha Trang, Việt Nam được đóng gói dưới dạng gói bột uống chứa bào tử B. subtilis. Hình 1.4: Bào tử B. clausii. Hình 1.5: Bào tử B. coagulans. Hình 1.6: Mặt cắt ngang của 1 bào tử Bacillus subtili. Hình 1.7: Chế phẩm Erceflora của công ty Sanofi – Aventis được đóng gói 2 tỷ bào tử trong 5ml. Sản phẩm được lưu hành ở Philippines. Hình 1.8: Chế phẩm Probacin của công ty INPHARM, s.r.o., ČR chứa 5 tỷ bào tử B. clausii / 10ml. Sản phẩm được lưu hành tại cộng hòa Sec. Hình 1.9: Chế phẩm Enterogermina của công ty Sanofi – Aventis. Hình 1.10: Sự hình thành bào tử. Hình 3.1: Hình ảnh tiêu bản của nguyên liệu thô. Hình 3.2: Hình ảnh sau xử lý bằng NaOH 20% ở 80°C trong 80 phút. Hình 3.3: Hình ảnh tiêu bản sau xử lý sinh khối với H 2 SO 4 10% ở 80°C trong 80 phút. Hình 3.4: Hình ảnh tiêu bản của sản phẩm xử lý bằng lysozyme tỷ lệ 40ml lysozyme (1mg/ml)/1g nguyên liệu thô trong 120 phút. Hình 3.5: Biểu đồ thể hiện sự tương quan về % sinh khối sau xử lý so với nguyên liệu ban đầu của 3 phương pháp NaOH, H 2 SO 4 10% (80°C) và lysozyme. 1 Bacillus . Trong nhóm các Bacillus được sử dụng làm probiotics, chi B. clausii . B. clausii . , v . “ B. clausii : 1. Lựa chọn các phương pháp xử lý sinh khối Bacillus clausii để tạo nguyên liệu chứa bào tử. 2. Khảo sát ủa bào tử sau xử lý ảy mầm trong quá trình bảo quản. 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Đại cƣơng về probiotics: 1.1.1. Định nghĩa: Thuật ngữ probiotics là một thuật ngữ được dùng để chỉ các vi khuẩn có lợi cho con người và động vật [32]. 1.1.2. Lịch sử phát triển của probiotics: Các vi khuẩn có lợi cho cơ thể con người lần lượt được phát hiện ra từ hơn một thế kỷ trước. Nhóm các vi khuẩn lactic (LAB) được Elie Metchnikoff (1845 – 1916) phát hiện ra khi ông nghiên cứu mối liên quan giữa chế độ ăn có sử dụng sữa lên men với đời sống khỏe mạnh của người nông dân Bulgari. Cùng thời gian đó, lần đầu tiên Bifidobacterium được bác sĩ nhi khoa người Pháp Henry Tissier - phân lập từ phân của những đứa trẻ sơ sinh được bú mẹ. Chi Bacillus đã được sử dụng trong các chế phẩm sinh học trong 1 thời gian dài với chế phẩm được biết đến nhiều nhất là Enterogermina (được đăng ký tại Italy năm 1958) [30]. Hiện nay, probiotics được đưa vào các chế phẩm dưới nhiều dạng: thuốc, thực phẩm, thực phẩm chức năng. Ngoài chi Lactobacillus và Bifidobacterium là các probiotics đã được sử dụng phổ biến và lâu đời thì Enterococcus, Bacillus, Streptococcus và Pediococcus cũng đang được ứng dụng rộng rãi [11]. 1.1.3. Vai trò của probiotics:  Điều trị tiêu chảy do các nguyên nhân: - Do sử dụng kháng sinh (AAD): Một nghiên cứu tại Mỹ năm 2006 đã chỉ ra rằng: Saccharomyces boulardii, Lactobacillus rhamnosus GG, và hỗn [...]... thế, trong sinh khối thu được sau quá trình này có cả 3 dạng: tế bào sinh dưỡng đã chết, bào tử tự do và nội bào tử vẫn nằm trong tế bào sinh dưỡng Để thu được nguyên liệu chứa bào tử tinh khiết, cần phải phá vỡ tế bào sinh dưỡng nhằm 2 mục đích là giải phóng nội bào tử ra khỏi tế bào sinh dưỡng và loại được hoàn toàn dạng sinh dưỡng ra khỏi sinh khối chứa bào tử (vì khi bị phá vỡ, các tế bào sinh dưỡng... Đặc điểm sinh hóa Vi khuẩn B clausii có khả năng thủy phân được casein, gelatin và tinh bột, nhưng không thủy phân được Tween 20, 40 hoặc 60 Cho phản ứng oxidase, catalase dương tính, khử nitrate thành nitrit [25] 1.2.2 Bào tử Bacillus clausii:  Đặc điểm bào tử: Hình 1.4: Bào tử B clausii [32] Hình 1.5: Bào tử B coagulans Bào tử Bacillus clausii cũng mang những đặc điểm chung của bào tử: - Bào tử là... Sự hình thành bào tử [2] 11 Pha 1: Trong tế bào sinh dưỡng, ADN được phân chia thành chromosome riêng biệt Pha 2: Màng tế bào chất lấn sâu vào phân chia tế bào để hình thành 2 phần không đều nhau Pha 3: Phần nhân bào tử mang ADN lún sâu vào tế bào chất Pha 4: Vỏ bào tử được hình thành Pha 5: Áo bào tử được hình thành Pha 6: Tế bào mẹ ly giải để giải phóng bào tử Quá trình hình thành bào tử mất khoảng... thấy: trong sinh khối tồn tại đồng thời 3 dạng là tế bào sinh dưỡng bắt màu xanh, bào tử tự do bắt màu đỏ và đỏ nằm trong tế bào sinh dưỡng bào tử màu (chưa được giải phóng) Trong đó chiếm đa phần là bào tử tự do và nội bào tử chưa được giải phóng 23 Hình 3.1: Hình ảnh tiêu bản của nguyên liệu thô Nhận xét, : Kết quả thu được cho thấy, sau 4 ngày nuôi cấy và được xử lý nhiệt thì trong sinh khối chứa... phƣơng pháp xử lý sinh khối Bacillus clausii để tạo nguyên liệu chứa bào tử: Nhờ có sức đề kháng của mình, bào tử vi khuẩn probiotics có thể đi qua được hàng rào bảo vệ là acid dịch vị và muối mật để nảy mầm nguyên vẹn ở ruột non Bacillus claussi có khả năng sinh nội bào tử, việc sử dụng các phương pháp khác nhau là nhằm phá bỏ vỏ tế bào, giải phóng nội bào tử Hơn nữa, xác tế bào sinh dưỡng khi bị... hiệu quả tách bào tử khỏi vỏ tế bào, trên tiêu bản vẫn có cả 3 dạng tồn tại của B clausii là dạng tế bào sinh dưỡng, bào tử tự do và nội bào tử vẫn còn nằm trong tế bào sinh dưỡng Nhận xét, : Mặc dù cùng là chủng Gram (+) nhưng có thể bản chất thành tế bào 2 loài Lactobacillus và Bacillus có thể có sự khác biệt, dẫn đến sự khác biệt về hiệu quả xử lý , theo lý thuyết, SDS phá vỡ vỏ tế bào vi khuẩn bằng... phá bỏ vỏ tế bào với các tác nhân khác nhau nhằm tìm ra được phương pháp xử lý hiệu quả nhất 3.1.1 Xử lý nhiệt sinh khối tế bào tạo nguyên liệu thô [3]: Mục tiêu: Tạo ra được sinh khối chứa chủ yếu là bào tử Tiến hành: Nuôi Bacillus clausii ở điều kiện 37°C, lắc 110 vòng/phút Sau 4 ngày, dịch nuôi cấy được đun cách thủy ở 100°C trong 1 giờ Sau đó ly tâm dịch nuôi cấy để thu cắn Rửa lại sinh khối theo... dạng sống tiềm sinh của vi khuẩn Nó có những đặc điểm đặc biệt để giúp vi khuẩn tồn tại trong những điều kiện khắc nghiệt và nảy mầm trở lại khi gặp điều kiện thu n lợi Mỗi vi khuẩn chỉ có thể hình thành một bào tử [2] - Cấu tạo:[22] o ADN nằm trong lõi bào tử o Vỏ bảo vệ bao quanh lõi bào tử o Áo bào tử trong mỏng o Áo bào tử ngoài dày 8 Lớp áo ngoài Lớp áo trong Vỏ bào tử Lõi bào tử ADN Hình 1.6:... H2SO4 Bacillus clausii a Sử dụng tác nhân là SDS 3%: Trên cơ sở kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả của viện Sinh học nhiệt đới trong việc phá vỡ tế bào Lactobacillus spp [7] Tiến hành: Lấy 0,5 g nguyên liệu thô 2.3.4 (a), ủ với 30ml dung dịch SDS 3% ở 80°C trong 80 phút Rửa lại Kết quả: Việc sử dụng SDS 3% ở 80°C trong 80 phút để xử lý sinh khối chứa bào tử Bacillus clausii không có hiệu quả tách bào. .. chủ yếu là bào tử Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Hiền [3] Sau 4 ngày nuôi cấy thì chất dinh dưỡng trong dịch lên men đã giảm nhiều tạo điều kiện thu n lợi cho tế bào sinh dưỡng chuyển thành dạng bào tử Dưới tác dụng của nhiệt độ cao (100°C trong 1 giờ), tế bào sinh dưỡng còn non chết đi Bacillus clausii 55˚C [36]), tế bào sinh dưỡng già chuyển thành dạng bào tử Vì thế, . 1.2.2. Bào tử Bacillus clausii:  Đặc điểm bào tử: Hình 1.4: Bào tử B. clausii [32]. Hình 1.5: Bào tử B. coagulans. Bào tử Bacillus clausii cũng mang những đặc điểm chung của bào tử: - Bào. 4 1.2. Bacillus clausii 1.2.1. Bacillus clausii ……….………………… ………… ……………….5 1.2.2. Bào tử Bacillus clausii …………………………… ………………….7 1.3. Sự hình thành bào tử và các phƣơng pháp thu bào tử 1.3.1 bào tử [2]. - Cấu tạo:[22] o ADN nằm trong lõi bào tử. o Vỏ bảo vệ bao quanh lõi bào tử. o Áo bào tử trong mỏng. o Áo bào tử ngoài dày. 8 Hình 1.6: Mặt cắt ngang của 1 bào tử Bacillus