BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ KIM CHI NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT VÀ ĐỘC TÍNH CỦA LOÀI DÂY THÌA CANH LÁ TO (GYMNEMA LATIFOLIUM WALL. EX WIGHT) THU HÁI Ở HOÀ BÌNH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ KIM CHI NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT VÀ ĐỘC TÍNH CỦA LOÀI DÂY THÌA CANH LÁ TO (GYMNEMA LATIFOLIUM WALL. EX WIGHT) THU HÁI Ở HOÀ BÌNH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS. Phạm Hà Thanh Tùng DS. Đoàn Thị Ái Nghĩa Nơi thực hiện: Bộ môn Thực Vật – Trường Đại học Dược Hà Nội Bộ môn Dược lý – Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Em xin được bày tỏ lòng kính trọng và lời cảm ơn sâu sắc nhất tới: ThS Phạm Hà Thanh Tùng - Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội và DS Đoàn Thị Ái Nghĩa - Bộ môn Dược liệu - Dược cổ truyền, Trường Đại học Y Dược Huế. Thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình dạy bảo và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Đỗ Nguyệt Quế và ThS Nguyễn Thu Hằng - Bộ môn dược lý, Trường Đại học Dược Hà Nội đã hướng dẫn và giúp đỡ để em trong quá trình thực hiện khoá luận. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô, các chị kĩ thuật viên Bộ môn Thực vật đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có thể hoàn thành tốt quá trình làm thực nghiệm tại bộ môn. Lời sau cùng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, các anh chị và bạn bè đã luôn ở bên cạnh ủng hộ, động viên em trong suốt quá học tập, nghiên cứu và hoàn thành đề tài này. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thị Kim Chi MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. LOÀI GYMNEMA LATIFOLIUM WALL. EX WIGHT 2 1.1.1. Về thực vật 2 1.1.2. Về đa dạng di truyền 4 1.1.3. Về thành phần hoá học 5 1.1.4. Về tác dụng sinh học 6 1.1.5. Về độc tính 7 1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 8 1.2.1. Về phân lập một số hợp chất 8 1.2.2. Về nghiên cứu độc tính bán trường diễn 9 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…….12 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT, DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU 12 2.1.1. Nguyên vật liệu 12 2.1.2. Động vật thí nghiệm 12 2.1.3. Dung môi, hoá chất 12 2.1.4. Máy móc - thiết bị 13 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 13 2.2.1. Nghiên cứu phân lập một số chất tinh khiết 13 2.2.2. Xác định độc tính bán trường diễn 13 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.3.1. Phương pháp nghiên cứu phân lập một số hợp chất 13 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu về độc tính bán trường diễn 15 2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 18 3.4. PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT 18 3.4.1. Quá trình chiết xuất 18 3.4.2. Quá trình phân lập 19 3.4.3. Xác định cấu trúc các chất phân lập được 20 3.5. ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN 24 3.5.1. Ảnh hưởng của dịch chiết lá Dây thìa canh lá to đến sự tăng trưởng thể trọng của chuột cống trắng 24 3.5.2. Ảnh hưởng của dịch chiết lá Dây thìa canh lá to đến các chỉ số huyết học của chuột cống trắng 25 3.5.3. Ảnh hưởng của dịch chiết lá Dây thìa canh lá to đến các chỉ số sinh hoá của chuột cống trắng 26 3.5.4. Kết quả về mô bệnh học 27 3.6. BÀN LUẬN 29 3.3.1. Về phương pháp nghiên cứu 29 3.3.2. Về phân lập các chất 30 3.3.3. Về độc tính bán trường diễn 32 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT  Độ dịch chuyển hoá học 13 C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) 1 H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Magnetic Resonance Spectroscopy) ALAT Alanine aminotransferase AST Aspartat aminotrasferase CDCl3 Cloroform d Double – đỉnh đôi DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer ĐTĐ Đái tháo đường EA Ethyl acetat ITS Internal Transcribed Spacer s Singlet – đỉnh đơn SKC Sắc kí cột SKLM Sắc ký lớp mỏng TMS Tetramethyl silan DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR của hợp chất GLHE9 và chất tham khảo 21 Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR của hợp chất GLHE7 và chất tham khảo 23 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của dịch chiết lá Dây thìa canh lá to đến khối lượng cơ thể của chuột cống trắng 25 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của dịch chiết lá Dây thìa canh lá to đến các chỉ số huyết học của chuột cống trắng 25 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của dịch chiết lá Dây thìa canh lá to đến các chỉ số sinh hóa của chuột cống trắng 26 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của dịch chiết lá Dây thì canh lá to đến khối lượng tim, gan, thận, lách/100g chuột cống trắng 27 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Đặc điểm hình thái Gymnema latifolium Wall. ex Wight 3 Hình 1.2 Đoạn nucleotide đặc trưng phân biệt hai loài Gymnema latifolium và Gymnema sylvestre 5 Hình 1.3 Định tính gymnemagenin trong phân đoạn ethylacetat trong mẫu Gymnema latifolium Wall. ex Wight 6 Hình 2.1 Quy trình thử độc tính bán trường diễn của dịch chiết Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) 16 Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) 18 Hình 3.2 Sơ đồ phân lập phân đoạn E1 từ Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) 19 Hình 3.3 Cấu trúc hóa học của hợp chất GLHE9 22 Hình 3.4 Cấu trúc hóa học của hợp chất GLHE7 24 Hình 3.5 Hình ảnh vi thể gan, thận lô thử và lô chứng của chuột thí nghiệm 28 Hình 3.6 Các định hướng nghiên cứu tác dụng của lupeol 31 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.) đã được nền y học cổ truyền Ấn Độ Ayurveda sử dụng từ hơn 2.000 năm để điều trị đái tháo đường [29], [32]. Dựa trên kinh nghiệm này, nhiều nghiên cứu liên quan đến Dây thìa canh đã được thực hiện và một số sản phẩm từ dược liệu này đã được phát triển sử dụng trong hỗ trợ điều trị đái tháo đường. Dựa trên nguyên lý các loài thực vật ở cùng cấp phân loại bậc chi có khả năng có các hoạt chất và hoạt tính sinh học tương đồng, Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) thu hái ở huyện Cao Phong, tỉnh Hoà Bình đã được các nhà khoa học nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu sàng lọc các dược liệu có tác dụng điều trị đái tháo đường ở Việt Nam năm 2010 [7]. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) có tác dụng hạ đường huyết cao hơn Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.) [7]. Do đó, nghiên cứu đã lựa chọn Dây thìa canh lá to là một trong ba cây thuốc có triển vọng ứng dụng điều trị đái tháo đường ở Việt Nam. Tuy nhiên, cho đến nay ở Việt Nam cũng như trên thế giới chưa có một công bố nào về thành phần các chất hoá học và độc tính bán trường diễn của Dây thìa canh lá to. Do vậy, nhằm góp phần đi sâu nghiên cứu về dược liệu tiềm năng này, đề tài “Nghiên cứu phân lập một số hợp chất và độc tính của loài Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium) thu hái ở Hoà Bình” được thực hiện với mục tiêu:  Phân lập một số hợp chất trong thành phần hoá học của Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium) thu hái ở Hoà Bình.  Xác định độc tính bán trường diễn của dịch chiết lá Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium) thu hái ở Hoà Bình. 2 TỔNG QUAN 1.1. LOÀI GYMNEMA LATIFOLIUM WALL. EX WIGHT 1.1.1. Về thực vật 1.1.1.1. Vị trí phân loại Theo hệ thống phân loại của Takhtajan công bố năm 2009 [27], Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) có vị trí phân loại như sau: + Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) + Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) + Phân Lớp Hoa Môi (Lamiidae) + Bộ Long Đởm (Gentianales) + Họ Trúc Đào (Apocynaceae) + Phân Họ Thiên lý (Asclepiadoideae) + Chi Gymnema R.Br. + Loài Gymnema latifolium Wall. ex Wight Ở Ấn Độ, Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) còn được biết đến với các tên đồng nghĩa khác là Gymnema khandalense và Gymnema kollimalayanum [20]. 1.1.1.2. Đặc điểm thực vật của loài Thân leo tới 6 m. Thân có lỗ vỏ, các nhánh có nhiều lông tơ. Cuống lá 1,5-4 cm, có lông tơ dày đặc; phiến lá 8-13×5-8 cm, lông dày đặc, càng xa trục càng dày đặc, gốc tròn, ngọn nhọn, gân bên 6-7 cặp. Cụm hoa xim dạng đầu thành từng đôi ở mấu, có lông dày đặc. Một cụm mang rất nhiều hoa, mùi thơm. Cuống cụm hoa 1-1,5 cm, cuống hoa 3-8 mm. Đài hình trứng, phủ lông măng. Tràng hoa vàng, hình chuông, nhẵn ở mặt ngoài. Ống hoa có 5 cặp gờ mang lông ở họng tràng, các thùy hình trứng, khoảng 1,2 ×1,2 mm, phủ lông dày đặc hướng trục, ngắn hơn so với ống tràng [12]. [...]... thu c Dây thìa canh và Dây thìa canh lá to 7 Ngoài các công bố trên, hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam chưa có một công bố chính thức nào về tác dụng sinh học của Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) 1.1.5 Về độc tính Độc tính cấp của Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz) R.Br ex Schult.) đã được xác định là LD50 = 250,00 (2 09,21-298,75) g/kg [7] Tham khảo một nghiên cứu. .. trên thế giới và ở Việt Nam công bố về các hợp chất được phân lập từ Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) 6 Hình 1.3: Định tính gymnemagenin trong các phân đoạn ethyl acetat trong mẫu Gymnema latifolium Wall ex Wight [12] 1.1.4 Về tác dụng sinh học Theo Trần Văn Ơn, Phùng Thanh Hương và cộng sự [7], dịch chiết lá Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) ở Việt Nam có... có: độc tính cấp; độc tính trường diễn ( ộc tính bán cấp, độc tính độc tính bán trường diễn, độc tính trường diễn); độc tính tại chỗ và độc tính chuyên biệt ( ộc tính sinh biến chủng, độc tính ung thư, độc tính trên sinh sản và phát triển) [1] Một số qui định về thử nghiệm độc tính bán trường diễn [1], [9]: - Thời gian: phụ thu c vào thời gian dùng thu c cho người, thường gấp 4 lần thời gian dùng thu c... thông số thu c chức năng gan: ALT và AST, bilirubin, cholesterol… 11 o Các thông số thu c chức năng thận: creatinin huyết, ure huyết… o Xét nghiệm đại thể và vi thể: gan, thận, lách, tim… 12 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ HOÁ CHẤT, DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU 2.1.1 Nguyên vật liệu Đối tượng nghiên cứu là lá của cây Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) thu hái ở Hòa Bình. .. các nhóm chất có trong Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) thu hái tại Hòa Bình có thành phần chính gồm: saponin, flavonoid, tanin, sterol, chất béo acid amin, đường khử và coumarin [3], [11] Sản phẩm thu phân phân đoạn ethyl acetat của Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) có pic sắc ký tương ứng với gymnemagenin trên sắc ký đồ (Hình 1.3) [12] Cho đến nay, chưa xác... hạ đường huyết của dịch chiết lá Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) mạnh hơn Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz) R.Br ex Schult.) Kết quả này đã được chuyển giao cho Công ty Dược Khoa (DK-Pharma) của Trường Đại học Dược Hà Nội, là nơi duy nhất ở Việt Nam trồng trọt Dây thìa canh lá to theo quy trình hướng dẫn “Thực hành tốt Trồng trọt cây thu c” (GAP- WHO) Công ty đã cho ra đời... chứng (n=10): uống nước với thể tích 1ml/100g chuột - Lô thử liều 1 (n=10): uống dịch chiết nước cao Dây thìa canh lá to với liều 1,4 g/kg chuột (tính theo dươc liệu khô) - Lô thử liều 2: gấp 3 liều 1 (n=10): uống dịch chiết nước cao Dây thìa canh lá to với liều 4,2 g/kg chuột (tính theo dược liệu khô) Hình 2.1 Quy trình thử độc tính bán trường diễn của dịch chiết 17 Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium. .. ethylacetat (4 0:1), thu được 2 phân đoạn E1A và E1B Hình 3.2 Sơ đồ phân lập phân đoạn E1 từ Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) Phân đoạn E1A được tiếp tục phân lập trên sắc ký cột pha thường với hệ dung môi n-hexan : cloroform (2 0:1) thu được 7 phân đoạn E1A1 – E1A7 20 Phân đoạn E1A6 tiếp tục được triển khai bằng phương pháp sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi aceton : methanol : nước (1 :1:0,2)... các proton và carbon trong cấu trúc giúp xác định cấu trúc các chất chính xác và đầy đủ hơn [17] 1.2.2 Về nghiên cứu độc tính bán trường diễn Nghiên cứu về độc tính của thu c đóng vai trò vô cùng quan trọng để đảm bảo tính an to n của thu c, thu c dù tác dụng mạnh đến mấy mà không an to n thì cũng sẽ không được sử dụng [1] 10 Độc tính bán trường diễn là một trong các nội dung về nghiên cứu độc tính. ..3 (b) Dạng sống; (c) Cụm hoa; (d) Mặt trên lá; (e) Mặt dưới lá; (f) Cụm hoa xim; (g) Lá bắc của cụm hoa; (h) Một hoa nguyên vẹn; (i) Đài; (j) Tràng; (k) Trụ nhị nhụy; (l) Thể truyền phấn; (m) Bộ nhụy; (n) Quả Hình 1.1 Đặc điểm hình thái Gymnema latifolium Wall ex Wight [12] 4 Trụ nhị nhụy dạng hình trụ, phần phụ nhị dạng màng ngắn hơn so với đầu núm nhụy Khối phấn hình thu n Đầu núm nhụy . tính của loài Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium) thu hái ở Hoà Bình được thực hiện với mục tiêu:  Phân lập một số hợp chất trong thành phần hoá học của Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium) . HÀ NỘI NGUYỄN THỊ KIM CHI NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT VÀ ĐỘC TÍNH CỦA LOÀI DÂY THÌA CANH LÁ TO (GYMNEMA LATIFOLIUM WALL. EX WIGHT) THU HÁI Ở HOÀ BÌNH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC. NGUYỄN THỊ KIM CHI NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT VÀ ĐỘC TÍNH CỦA LOÀI DÂY THÌA CANH LÁ TO (GYMNEMA LATIFOLIUM WALL. EX WIGHT) THU HÁI Ở HOÀ BÌNH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC