BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN BÌNH NGUYÊN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CAPTOPRIL TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN BÌNH NGUYÊN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CAPTOPRIL TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn : ThS Trần Thị Lan Hương Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa Dược - Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới Ths TRẦN THỊ LAN HƯƠNG – người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này. Tôixin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Hóa Dược, Dược lý đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian làm thực nghiệm việ c tại bộ môn. Tôi xin gửi tới các thầy cô giáo, các cán bộ Trường Đại học Dược Hà Nội lời cảm ơn chân thành về sự dạy bảo, dìu dắt tận tình trong suốt năm năm tôi học tập tại đây. Và cuối cùng, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới cha mẹ kính yêu và những người thân trong gia đình, bạn bè đã luôn giành cho tôi tình yêu thương, sự quan tâm, động viên trong suốt quá trình học tập và làm khóa luậ n tốt nghiệp. Hà nội, ngày 16 tháng 05 năm 2013 Sinh Viên Nguyễn Bình Nguyên MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương I : TỔNG QUAN 2 1.1 Đại cương về Captopril 2 1.1.1 Công thức, tính chất 2 1.1.2 Tác dụng, chỉ định, chống chỉ định 2 1.2 Một số phương pháp định lượng captopril 3 1.2.1 Đinh lượng Captopril bằng phép đo Iod 3 1.2.2 Định lượng Captopril bằng phương pháp đo quang 4 1.3 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 5 1.3.1 Định nghĩa 5 1.3.2 Các thông số cơ bản của quá trình sắc ký 5 1.3.3 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC 7 1.3.4 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn sắc ký 7 1.3.5 Phương pháp định lượng bằng HPLC 11 1.4 Thẩm định phương pháp phân tích 12 1.4.1 Yêu cầu chung 12 1.4.2 Nội dung thẩm định phương pháp 12 Chương II: ĐỐI TƯỢNG, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1 Đố i tượng nghiên cứu 14 2.2 Dụng cụ, hóa chất 14 2.2.1 Dụng cụ và thiết bị 14 2.2.2 Hóa chất 14 2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 14 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu 14 2.3.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.3.3 Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả 16 Chương III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ,BÀN LUẬN 17 3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 17 3.1.1 Khảo sát chọn bước sóng thích hợp 17 3.1.2 Chọn pha tĩnh 18 3.1.3 Khảo sát chọn thành phần pha động và tốc độ dòng 19 3.1.4 Khảo sát chọn dung môi hòa tan Captopril 24 3.1.5 Điều kiện sắc ký đã chọn 25 3.2 Xây dựng và đánh giá phương pháp định lượng Captopril trong trong nguyên liệu bằng phương pháp HPLC 25 3.2.1 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký 25 3.2.2 Xây d ựng phương pháp định lượng 27 3.3 Đánh giá phương pháp định lượng 28 3.3.1 Khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng 28 3.3.2 Đánh giá tính chính xác của phương pháp 30 3.3.3 Đánh giá tính đặc hiệu của phương pháp 33 3.4 Bàn luận 35 3.5 Áp dụng phương pháp xây dựng 36 Chương IV: KẾT LUẬN, ĐÁNH GIÁ 37 4.1 Kết luận 37 4.2 Đề xuất 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÚ THÍCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AcCN : Acetonitril AF : Hệ số bất đối xứng(Asymmetric) HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography). MeOH: Methanol RSD : Độ lệch chuẩn tương đối(Relative Standard Deviation) R s : Hệ số phân giải (Resolution) TB : Trung bình DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Nội dung Trang 1.1 Cấu trúc cột LC-DB 9 1.2 Cấu trúc cột có gốc Isopropyl 9 3.1 Phổ hấp thụ UV của Captopril trong MeOH:Đệm phosphat 0,01M pH=2,40 (65:35) 17 3.2 Sắc ký đồ của Captopril khi chạy ở các hệ đệm khác nhau và các pha động khác nhau. 19 3.3 Thông số phân tích và sắc ký đồ của Captopril khi chạy ở pH =2,50 20 3.4 Thông số phân tích và sắc ký đồ của Captopril khi chạy ở pH =2,40 20 3.5 Thông số phân tích và sắc ký đồ của Captopril khi chạy ở pH =2,30 21 3.6 Thông số phân tích và sắc ký đồ của Captopril khi chạy hệ MeOH:Đệm pH 2,4 (60/40) 22 3.7 Thông số phân tích và sắc ký đồ của Captopril khi chạy hệ MeOH:Đệm pH 2,4 (65/35) 22 3.8 Thông số phân tích và sắc ký đồ của Captopril khi chạy hệ MeOH:Đệm pH 2,4 (70/30) 23 3.9 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ dung dịch và diện tích pic của Captopil 29 3.10 Sự tương quan giữa lượng Captopril ban đầu và lượng tìm lại 32 3.11 Sắc ký đồ của mẫu trắng 33 3.12 Sắc ký đồ của Captpril chuẩn đối chiếu (100µg/ml) 34 3.13 Sắc ký đồ của Captopril thử (100µg/ml) 34 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang 3.1 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống HPLC 26 3.2 Cách pha dãy dung dịch khảo sát khoảng tuyến tính 28 3.3 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của Captopril 29 3.4 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp 30 3.5 Kết quả đánh giá tính đúng của phương pháp 31 3.6 Kết quả định lượng Captopril trong Captopril nguyên liệu của công ty dược phẩm Traphaco 36 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, tăng huyết áp là một bệnh mang tính chất phổ biến. Điều đáng ngại chính là có tới 50% người bị tăng huyết áp không biết mình bị tăng huyết áp, khoảng 30% của những người đã biết mình tăng huyết áp nhưng vẫn không có một biện pháp điều trị nào.Tăng huyết áp nếu không được điều trị đúng và đầy đủ dẫn đến nhiều biến chứng nặng nề như suy thận, suy tim, tai biến mạch não… thậm chí có thể gây tử vong hoặc để lại các di chứng nặng nề ảnh hưởng đến sức khỏe, sức lao động của người bệnh. Một trong những thuốc đầu tay bác sỹ hay dùng để điều trị tăng huyết áp trên bệnh nhân đó chính là nhóm ức chế men chuyển trong đó Captopril là một thuốc kinh điển. Muốn kiểm soáttốt các chế phẩm chứa Captopril thì đi từ việc nhỏ nhất đó là đánh giá được nguồn nguyên liệu để sản xuất thuốc Captopril. Hiện nay, ở Việt Nam, phương pháp chính để định lượng Captopril trong nguyên liệu là phương pháp oxy hóa khử bằng phép đo Iod. Trên thực tế nếu như trong nguyên liệu có các chất khử và các chất oxy hóa thì khi áp dụng phương pháp này dễ dẫn đến các sai số. HPLC là một phương pháp phân tích có tính ổn định,có độ chính xác và độ chọn lọc cao, được sử dụng rộng rãi trong phân tích và dược phẩm. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng Captopril trong nguyên liệu bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”. Với 3 mục tiêu sau:  Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng captopril trong nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.  Thẩm định phương pháp xây dựng theo các tiêu chí của một phương pháp định lượng, từ đó đề ra quy trình định lượng thường quy để định lượng Captopril trong nguyên liệu  Áp dụng phương pháp mới xây dựng để định lượng Captopril trong nguyên liệu. 2 CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ CAPTOPRIL 1.1.1. Công thức, tính chất  Công thức hóa học :  Tên khoa học : Acid 1-(3-mercapto-2-methylpropanoyl)pyrolidin-2-carboxylic  Công thức phân tử : C 9 H 15 NO 3 S ; M=217,28;  Tính chất: Bột kết tinh màu trắng ngà,ở 25 o C: tan tốt trong nước (160 mg/ml), ethanol,methanol,methylclorid, tan trong glyceryltriacetat (20 mg/ml),trong dung dịch NaOH loãng, rất ít tantrong dầu ngô, ethyl acetat (< 1mg/ml).Nhiệt độ nóng chảy: 105 o C – 108 o C.Góc quay cực riêng trong ethanol tuyệt đối là α D 25 = - 127,8 o ,hai đồng phân R,S có góc quay cực riêng lệch nhau +5 o . Hằng số phân ly trong nước pKa lần lượt là 3,7 (-COOH) và 9,8 (-SH). Hệ số phân bố logP(octhanol/nước) =0,34, logP(CH 2 Cl 2 /nước(pH=2))=1,39, logP(octhanol/HCl 0,1M)=1,9.[12] 1.1.2. Tác dụng, chỉ định, chống chỉ định: 1.1.2.1. Dược động học : Captopril hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, có F tuyệt đối là 60% - 75%, C max trong huyết tương đạt được khoảng 1 giờ sau khi uống. Captopril liên kết với protein khoảng 30%. Chủ yếu được bài tiết trong nước tiểu, khoảng 40%-50% đào thải qua thận ở dạng còn nguyên hoạt tính, còn lại chuyển hóa qua gan thành dạng captopril disulfide và captopril-cystein.Captopril có t 1/2 = 2–3h, Cl s =13,33 ml/min/kg.[14] [...]... tiến hành định lượng phức tạp vì nhiều giai đoan khó thực hiện, sản phẩm đo quang là chất trung gian dễ bị phân hủy,làm giảm sự chính xác của phép định lượng Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp phân tích có tính ổn định, độ chính xác và độ chọn lọc cao được sử dụng rộng rãi trong phân tích và dược phẩm.Vì vậy trong đề tài này, chúng tôi nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng Captopril... Captopril trong nguyên liệu bằng HPLC 1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.3.1 Định nghĩa Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng ở áp suất cao Pha tĩnh có thể là chất rắn được bao trên bề mặt một chất mang rắn, hoặc là chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên... nghiệm ở nước ta hiện nay để nghiên cứu, xây dựng quy trình định lượngCaptopril trong nguyên liệu bằng phương pháp HPLC có tính chính xác, đặc hiệu cao 2.3.2 Nội dung nghiên cứu 2.3.2.1 .Nghiên cứu các điều kiện tiến hành xây dựng phương pháp  Khảo sát điều kiện sắc ký Chọn bước sóng phát hiện, chọn cột, chọn pha động, tốc độ dòng thích hợp để có pic captopril cân đối và thời gian lưu hợp lý Chúng tôi... xây dựng định lượng Captopril trongnguyên liệu Áp dụng phương pháp xây dựng tiến hành định lượng Captopril trong nguyên liệu của Công ty dược phẩm Traphaco Tiến hành sắc ký theo chương trình đã chọn trên các mẫu thử, song song với mẫu chuẩn Trong khoảng tuyến tính, nồng độ chất phân tích tỷ lệ thuận với diện tích pic trên sắc ký đồ So sánh diện tích mẫu chuẩn và mẫu thử để định lượng chất thử trong dung... trình sắc ký xảy ra theo cơ chế : hấp phụ, phân tán, trao đổi ion, loại cỡ hay tương tác hóa học trên bề mặt.[5] 1.3.2 Các thông số cơ bản của quá trình sắc ký  Thời gian lưu tR : Thời gian lưu của một chất là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detertor và cho pic trên sắc ký đồtính từ lúc tiêm đến lúc xuất hiện đỉnh của pic Thời gian lưu là thông tin về mặt định. .. trình sắc ký  Cột Luna C8 (250 mm x 4,6 µm, 5µm)  Pha động là MEOH/Đệm phosphat 0,01M pH = 2,40(tỷ lệ 65/35)  Thể tích tiêm 20µl  Tốc đô dòng 0,6 ml/min 28  Detertor UV 220 nm  Nhiệt độ phân tích là nhiệt độ phòng 3.2.2.3Tiến hành sắc ký định lượng Chuẩn bị và cho hệ thống HPLC chạy ổn định với pha động trong 30 phút Tiêm lần lượt 20µl mỗi dung dịch đã chuẩn bị vào hệ thống sắc ký Tiến hành sắc ký. .. 2,460:40 Sắc ký đồ và thông số phân tích thu được cho ta thấy pic của Captopril và pic của tạp chất chưa tách ra khỏi được nhau (tCaptopril = 8,467 phút, ttạp chất = 9,600 phút ) và thời gian lưu của Captopril dài Trong trường hợp này, nếu giảm tỷ lệ MeOH trong pha động thì thời gian lưu càng tăng, trong khi thời gian lưu của pic tạp đã là 23 9,600 phút nên nếu giảm tỷ lệ MeOH trong pha động thì thời gian... thông tin về mặt định tính của sắc ký đồ, nó là hằng số đối với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không đổi Ngoài ra trong một phép phân tích còn thời gian lưu hiệu chỉnh, được tính bằng công thức sau: tR’ = tR – tM Với: tM là thời gian lưu của 1 chất không bị lưu giữ bởi pha tĩnh Nếu tR quá nhỏ thì sự tách kém, còn nếu tR quá lớn thì pic bị loãng, thời gian phân tích kéo dài.[2]... chọn điều kiện sắc ký 8 1.3.4.1 Lựa chọn pha tĩnh cho HPLC Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột, là yếu tố quan trọng quyết định sự tách của một hỗn hợp nhiều chất Tùy vào độ phân cực của pha tĩnh và pha động sắc ký được chia thành 2 loại :  Sắc ký pha thuận: pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực, chất phân tích thường là các chất phân cực hoặc là các chất có thể phân cực  Sắc ký pha đảo: pha... lượng chất thử trong mẫu cần định lượng 2.3.3 Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả 2.3.3.1 Đánh giá dung môi hòa tan Dùng phương pháp HPLC đã xây dựng để đánh giá sự phù hợp, tính dặc hiệu của dung môi sử dụng để hòa tan hoàn toàn Captopril trong nguyên liệu dựa trên kết quả đánh gia tính chính xác, tính đúng của phương pháp 2.3.3.2 .Định tính Thời gian lưu và hình dạng pic của captopril trên sắc ký . nguyên liệu bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao . Với 3 mục tiêu sau:  Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng captopril trong nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.  Thẩm định phương. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.3.1. Định nghĩa Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ. TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN BÌNH NGUYÊN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CAPTOPRIL TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ