BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI **** MEAS PISAL NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT ARTEMISININ TỪ LÁ CÂY THANH CAO HOA VÀNG BẰNG DUNG MÔI ISOPROPANOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI **** MEAS PISAL NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT ARTEMISININ TỪ LÁ CÂY THANH CAO HOA VÀNG BẰNG DUNG MÔI ISOPROPANOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: DS. Trần Ngọc Bảo Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược HàNội HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: DS. Trần Ngọc Bảo Người thầy đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian qua, giúp tôi từng bước nâng cao nhận thức và phương pháp luận để hoàn thành khoa luận tốt nghiệp. Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Văn Hân đã giúp đỡ hướng dẫn và cung cấp tài liệu cho tôi trong suốt quá trình làm khóa luận. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo bộ môn Công nghiệp dược, các anh chị kỹ thuật viên đã giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian làm thực nghiệm. Nhân dịp này tôi cũng xin gửi tới toàn thể giảng viên, cán bộ trường Đại học Dược Hà Nội lời cảm ơn chân thành vì sự dạy bảo, dìu dắt tôi trong suốt năm năm học tập tại trường. Cuối cùng cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới cha mẹ, người thân và bạn bè – những người luôn dành cho tôi sự chia sẻ, quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình. Hà nội, ngày 20 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Meas Pisal MỤC LỤC CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về artemisinin 2 1.1.1. Công thức hóa học, tính chất 2 1.1.2. Nguồn gốc artemisinin 2 1.1.3. Tác dụng dược lý và chỉ định của artemisinin 2 1.2. Tổng quan về cây thanh cao hoa vàng và một số phương pháp chiết xuất artemisinin từ lá cây thanh cao hoa vàng 3 1.2.1. Cây thanh cao hoa vàng 3 1.2.2. Đặc điểm hình thái của cây thanh cao hoa vàng 3 1.2.3. Phân bố 4 1.2.4. Bộ phận dùng và chế biến 4 1.2.5. Thành phần hóa học 5 1.2.6. Công dụng 6 1.3. Một số phương pháp chiết xuất artemisinin từ lá thanh cao hoa vàng 6 1.3.1. Chiết bằng dung môi n-hexan 6 1.3.2. Chiết bằng ethanol 7 1.3.3. Chiết bằng dung môi CO 2 siêu tới hạn 7 1.3.4. Chiết bằng dung dịch ion lỏng 7 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 2.1. Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị 10 2.1.1. Nguyên liệu 10 2.1.2. Hóa chất 10 2.1.3. Máy móc, thiết bị 10 2.2. Phương pháp nghiên cứu 11 2.2.1. Phương pháp định lượng 11 2.2.2. Phương pháp chiết xuất và tinh chế artemisinin 12 2.2.2.1. Phương pháp chiết xuất với dung môi IPA 12 2.2.2.2. Phương pháp tinh chế 13 2.3.1. Lựa chọn các thông số kỹ thuật cho quy trình chiết 13 2.3.1.1. Số lần chiết 13 2.3.1.2. Thời gian chiết ở nhiệt độ phòng 14 2.3.1.3. Thời gian chiết khi tăng nhiệt độ 14 2.3.2. So sánh giữa phương pháp chiết xuất bằng dung môi IPA với chiết xuất bằng dung môi n-hexan………. 14 2.3.2.1. So sánh độ tan của artemisinin trong IPA với độ tan của atermisinin trong n-hexan 14 2.3.2.2. So sánh hiệu suất chiết xuất bằng dung môi IPA với dung môi n-hexan ở nhiệt độ phòng 15 2.3.2.3. So sánh hiệu suất chiết khi tăng nhiệt độ 16 2.3.2.4. Tính chọn lọc giữa 2 dung môi 16 2.3.3. Phương pháp tinh chế artemisinin 16 2.3.3.1. Phương pháp kết tinh trong hỗn hợp dung môi ethyl acetat : n-hexan . 17 2.3.3.2. Phương pháp kết tinh trong dung môi ethyl acetat 17 2.3.3.3. Phương pháp kết tinh trong dung môi n-hexan 17 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18 3.1. Xác định hàm lượng artemisinin trong lá thanh cao hoa vàng 18 3.2. Lựa chọn các thông số kỹ thuật cho quy trình chiết 18 3.2.1. Khảo sát số lần chiết 18 3.2.2. Khảo sát thời gian chiết xuất ở nhiệt độ phòng 19 3.2.3. Khảo sát thời gian chiết khi tăng nhiệt độ 20 3.3. So sánh giữa phương pháp chiết xuất bằng dung môi IPA với chiết xuất bằng dung môi n-hexan 21 3.3.1. So sánh độ tan của artemisinin trong IPA với độ tan của atermisinin trong n-hexan… 21 3.3.2. So sánh hiệu suất chiết xuất bằng dung môi IPA với dung môi n-hexan tại nhiệt độ phòng…… 22 3.3.3. So sánh hiệu suất chiết xuất giữa 2 dung môi IPA và n-hexan ở nhiệt độ 40 ± 5°C 23 3.3.4. Tính chọn lọc giữa 2 dung môi 24 3.4 . Xây dựng phương pháp tinh chế 25 3.4.1. Phương pháp kết tinh trong hỗn hợp dung môi ethyl acetat : n-hexan 25 3.4.2. Phương pháp tinh chế bằng kết tinh artemisinin trong dung môi ethyl acetat……. 27 3.4.3. Phương pháp kết tinh trong dung môi n-hexan 28 3.4.4. So sánh về các phương pháp tinh chế 30 3.4.5. Đề xuất phương pháp chiết xuất và tinh chế artemisinin bằng dung môi IPA 31 KẾT LUẬN 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Giải thích 1 DĐVN Dược điển Việt Nam 2 DL Dược liệu 3 DM Dung môi 4 HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography) 5 IPA Isopropanol 6 P Tinh khiết (Pure) 7 STT Số thứ tự DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung bảng Trang Bảng 1.1 Độ tan của artemisinin trong 2 dung dịch ion lỏng N, N – dimethylethanolammonium octanoate và bis 2-methoxyethylammonium bis (trifluoromethysulfonylimide) 8 Bảng 1.2 So sánh dung môi chiết artemisinin về hiệu suất chiết xuất, thời gian chiết, chi phí vận hành, chi phí đầu tư 8 Bảng 2.1 Tên và nguồn gốc của các hóa chất dùng trong thí nghiệm 10 Bảng 3.1 Kết quả đo quang của dung dịch artemisinin 18 Bảng 3.2 Hiệu suất chiết xuất (%) artemisinin tại 4 lần chiết 19 Bảng 3.3 Hiệu suất chiết tại 3 thời gian chiết xuất khác nhau 19 Bảng 3.4 Hiệu suất chiết xuất artemisinin bằng dung môi IPA ở nhiệt độ 40 ± 5°C tại 5 thời gian chiết 20 Bảng 3.5 Độ tan của artemisinin trong 2 dung môi IPA và n-hexan 21 Bảng 3.6 Hiệu suất chiết artemisinin bằng dung môi IPA và dung môi n-hexan tại nhiệt độ phòng 22 Bảng 3.7 Hiệu suất chiết bằng 2 dung môi khi tăng nhiệt độ đến 40 ± 5°C 23 Bảng 3.8 Kết quả so sánh độ chọn lọc giữa 2 dung môi IPA và n-hexan 24 Bảng 3.9 Khối lượng artemisinin thu được, hàm lượng sản phẩm và hiệu suất của phương pháp tinh chế bằng kết tinh trong hỗn hợp dung môi ethyl acetat và n-hexan 25 Bảng 3.10 Khối lượng artemisinin thu được, hàm lượng sản phẩm và hiệu suất của phương pháp tinh chế bằng kết tinh trong dung môi ethyl acetat 27 Bảng 3.11 Khối lượng artemisinin thu được, hàm lượng sản phẩm và hiệu suất của phương pháp tinh chế bằng kết tinh trong dung môi n-hexan 28 Bảng 3.12 So sánh các phương pháp tinh chế theo các tiêu chí 30 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ STT Danh mục các hình ảnh, đồ thị Trang 1 Hình 1.1: Lá và cành của cây thanh cao hoa vàng 3 2 Hình 1.2: Các công thức của thành phần hóa học có trong cây thanh cao hoa vàng 5 3 Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết xuất artemisinin bằng dung môi IPA tương ứng với 5 thời gian chiết khác nhau ở nhiệt độ 40 ± 5°C 20 4 Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết artemisinin bằng dung môi IPA và dung môi n-hexan ở nhiệt độ phòng 22 5 Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết giữa dung môi IPA và dung môi n-hexan khi dùng nhiệt độ 40 ± 5°C 23 6 Hình3.4: Sản phẩm thô của artemisinin trong hỗn hợp dung môi ethyl acetat và n-hexan 26 7 Hình 3.5: Artemisinin tinh chế bằng phương pháp kết tinh trong hỗn hợp dung môi ethyl acetat: n-hexan 26 8 Hình3.6: Sản phẩm thô của artemisinin trong dung môi ethyl acetat 27 9 Hình 3.7: Artemisinin tinh chế bằng phương pháp kết tinh trong dung môi ethyl acetat 27 10 Hình 3.8: Sản phẩm thô của artemisinin kết tinh trong dung môi n-hexan 29 11 Hình 3.9: Artemisinin tinh chế bằng phương pháp kết tinh trong dung môi n-hexan 29 12 Hình 3.10: Quy trình chiết xuất artemisinin từ lá thanh cao hoa vàng bằng dung môi IPA 31 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Sốt rét là một bệnh phổ biến trên thế giới, trong đó có cả ở Đông Nam Á, đặc biệt ở biên giới giữa Campuchia và Thái Lan là nơi tập trung bệnh sốt rét nhiều nhất. Ký sinh trùng sốt rét có khả năng kháng thuốc rất nhanh, vì vậy con người luôn cố gắng tìm ra biện pháp để điều trị bệnh có hiệu quả. Người ta đã phát hiện artemisinin là một hoạt chất có tác dụng tốt với thể phân liệt trong máu của mọi ký sinh trùng sốt rét, đặc biệt với sốt rét thể não do chủng Plasmodium falciparum gây ra kể cả khi đã kháng cloroquin. Từ trước đến hiện nay, artemisinin đã được chiết từ lá của cây thanh cao hoa vàng (Artemisia annua L.). Trên thế giới, đã có nghiên cứu chiết xuất artemisinin bằng nhiều dung môi như: n-hexan, ethanol, ion lỏng, scCO 2 (CO 2 siêu tới hạn), HFC-134a (Hydrofluocacbon)… Ở Việt Nam, phương pháp chiết xuất artemisinin được sử dụng phổ biến nhất là phương pháp ngâm với dung môi n-hexan. Dung môi isopropanol đã được sử dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm do nó có khả năng hòa tan tốt nhiều chất và nguy cơ cháy nổ thấp hơn dung môi n-hexan và một số dung môi khác. Dựa trên ưu điểm này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết xuất artemisinin từ lá cây thanh cao hoa vàng bằng dung môi isopropanol” với mục đích góp phần tìm ra phương pháp chiết artemisinin có hiệu quả và an toàn. Đề tài gồm các mục tiêu sau: 1. Xây dựng phương pháp chiết xuất và tinh chế artemisinin từ lá cây thanh cao hoa vàng bằng dung môi IPA. 2. So sánh hiệu quả chiết xuất của dung môi IPA và n-hexan (độ tan, tính chọn lọc, hiệu suất). [...]... thường thì độc tính của artemisinin là tương đối thấp do lượng ion sắt không cao [12] 1.2 Tổng quan về cây thanh cao hoa vàng và một số phương pháp chiết xuất artemisinin từ lá cây thanh cao hoa vàng 1.2.1 Cây thanh cao hoa vàng Thanh cao hoa vàng (tên khoa học là Artemisia annua L.), là cây thuộc họ Cúc (Asteraceae) Ngoài ra, cây còn có tên khác là Thanh hao hoa vàng, ngải hoa vàng, ngải si, ngải hôi,... các phương pháp chiết xuất artemisinin từ lá thanh cao hoa vàng trong mục đích lựa chọn dung môi có ưu điểm nhất về hiệu suất chiết, an toàn, chi phí thấp Các phương pháp chiết artemisinin từ lá cây thanh cao hoa vàng : 1.3.1 Chiết bằng dung môi n-hexan Ở Việt Nam cũng như trên thế giới, người ta sử dụng dung môi n-hexan để chiết xuất artemisinin Phương pháp chiết bằng dung môi n-hexan được coi là... thời gian chiết xuất artemisinin bằng dung môi IPA là 16 giờ có hiệu suất cao nhất 3.2.3 Khảo sát thời gian chiết khi tăng nhiệt độ Dựa vào quy trình chiết xuất artemisinin bằng dung môi n-hexan đã được sử dụng ở Việt Nam, Chúng tôi lựa chọn nhiệt độ chiết xuất artemisinin từ lá thanh cao hoa vàng bằng dung môi IPA giống nhiệt độ chiết xuất bằng dung môi n-hexan là 40 ± 5°C Tỷ lệ DL/DM là 1/8, chiết 3... Hiệu suất chiết artemisinin bằng dung môi IPA và dung môi n-hexan tại nhiệt độ phòng Hiệu suất chiết (%) Dung môi chiết xuất Chiết lần 1 Chiết lần 2 Chiết lần 3 Tổng hiệu suất (%) IPA 57,78 30,52 6,82 95,12 n-hexan 52,56 27,65 5,00 85,21 23 Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết artemisinin bằng dung môi IPA và dung môi n-hexan tại nhiệt độ phòng Nhận xét: - Hiệu suất chiết bằng dung môi IPA cao hơn... ethanol 96% Vì vậy, chúng tôi sẽ tiến hành nghiên cứu chiết xuất artemisinin từ lá thanh cao hoa vàng bằng dung môi IPA với mong muốn tìm được dung môi chiết an toàn và có hiệu suất cao 10 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị 2.1.1 Nguyên liệu: Lá thanh cao hoa vàng được trồng ở vùng Vĩnh Tường, Vĩnh Phúc, lá được thu hái vào tháng 4 năm 2012 2.1.2... nguyên liệu + Lá thanh cao hoa vàng được sấy khô ở điều kiện nhiệt độ 50 – 60°C trong 1 giờ, lấy ra xay thô thành bột (rây qua cỡ rây 5mm) 13 - Giai đoạn 2: Chiết xuất Chiết xuất lá thanh cao hoa vàng bằng IPA với các thông số sau: + Dung môi chiết xuất: IPA + Khối lượng dược liệu: Từ 5g đến 250g/mẻ + Tỷ lệ DL/DM, nhiệt độ chiết xuất tương ứng với thời gian chiết xuất, số lần chiết xuất thay đổi theo... chiết, độ chênh lệch không đáng kể Do đó, tiến hành chiết 3 lần tiết kiệm được dung môi mà vẫn đảm bảo được hiệu suất chiết Vì vậy, chúng tôi chọn chiết 3 lần/mẻ để làm nghiên cứu chiết xuất artmisinin từ lá cây thanh cao hoa vàng bằng dung môi IPA 3.2.2 Khảo sát thời gian chiết xuất ở nhiệt độ phòng Sau khi lựa chọn được số lần chiết thích hợp, Chúng tôi tiếp tục khảo sát tiếp về thời gian chiết bằng. .. thuốc Trung Quốc đã sử dụng nước sắc của cây thanh cao hoa vàng để điều trị sốt Ở Việt Nam, vào thế kỳ XIV, Tuệ Tĩnh cũng đã dùng thanh cao hoa vàng trong điều trị và đến những năm 1990 bắt đầu được nghiên cứu về thành phần hóa học và phương pháp chiết xuất 1.2.2 Đặc điểm hình thái của cây thanh cao hoa vàng Hình 1.1: Lá và cành của cây thanh cao hoa vàng 4 Cây thảo mọc đứng, sống hàng năm, phân nhiều... của artemisinin trong 2 dung môi IPA và n-hexan Dung môi Độ tan (mg/ml) IPA n-hexan 30,55 3,02 Nhận xét: Đựa vào kết quả thu được, độ tan của artemisinin trong dung môi IPA cao gấp 10 lần so với độ tan của artemisinin trong dung môi n-hexan Do độ tan của 22 artemisinin trong dung môi IPA thì hiệu suất chiết bằng dung môi IPA sẽ cao hơn hiệu suất chiết bằng dung môi n-hexan 3.3.2 So sánh hiệu suất chiết. .. trên cao hơn hiệu suất chiết bằng n-hexan và ethanol, thời gian chiết xuất ngắn hơn, chi phí đầu tư cũng thấp hơn so với chiết bằng nhiều dung môi khác (bảng 1.2) Dựa trên dữ liệu đã nghiên cứu được, nhà nghiên cứu có thể so sánh về hiệu suất chiết xuất, thời gian chiết, chi phí trong quá trình chiết giữa các dung môi như bảng 1.2: Bảng 1.2: So sánh dung môi chiết artemisinin về hiệu suất chiết xuất, . pháp chiết xuất artemisinin từ lá thanh cao hoa vàng 6 1.3.1. Chiết bằng dung môi n-hexan 6 1.3.2. Chiết bằng ethanol 7 1.3.3. Chiết bằng dung môi CO 2 siêu tới hạn 7 1.3.4. Chiết bằng dung. vàng và một số phương pháp chiết xuất artemisinin từ lá cây thanh cao hoa vàng 3 1.2.1. Cây thanh cao hoa vàng 3 1.2.2. Đặc điểm hình thái của cây thanh cao hoa vàng 3 1.2.3. Phân bố 4 1.2.4 hơn dung môi n-hexan và một số dung môi khác. Dựa trên ưu điểm này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài Nghiên cứu chiết xuất artemisinin từ lá cây thanh cao hoa vàng bằng dung môi isopropanol