BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN DUY PHƢƠNG BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA CÂYBẢY LÁ MỘT HOA (PARIS CHINENSIS FRANCH.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SỸ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN DUY PHƢƠNG BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA (PARIS CHINENSIS FRANCH.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SỸ Ngƣời hƣớng dẫn: 1.ThS. Nguyễn Thị Duyên 2. TS. Hà Vân Oanh Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Dược học cổ truyền 2. Khoa Hoá thực vật – Viện dược liệu HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Khoá luận này là kết quả của quá trình học tập, rèn luyện của em tại trường Đại học Dược Hà Nội và quá trình nghiên cứu tại viện Dược liệu dưới sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô. Nhân dịp này em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Hà Vân Oanh, ThS. Nguyễn Thị Duyên và TS. Đỗ Thị Hà, những người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em hoàn thành khoá luận này. Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơn đến: Ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện để em được học tập và nghiên cứu tại trường. Các cán bộ nghiên cứu khoa Hoá thực vật – Viện Dược liệu đã giúp đỡ em trong quá trình làm thực nghiệm. Dù đã rất cố gắng, nhưng lần đầu làm nghiên cứu em khó tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận được ý kiến đóng góp quý giá của các thầy cô để khoá luận thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Duy Phương MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ… 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Vị trí phân loại Paris chinensis Franch. (Bảy lá một hoa)………. …… 2 1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Paris L………………… 2 1.2.1. Đặc điểm thực vật chi Paris L…………………………………… … 2 1.2.2. Phân bố chi Paris L………………………………… …………….… 3 1.3. Đặc điểm thực vật và phân bố loài Bảy lá một hoa (Paris chinensis Franch.)…………………………………………………………………….….4 1.3.1. Đặc điểm thực vật…… ………………… ……………………… ….4 1.3.2. Sinh thái và phân bố 5 1.4. Thành phần hoá học……………………………………………… ……5 1.5.Tác dụng sinh học 13 1.5.1.Tác dụng chống ung thư 13 1.5.2.Tác dụng kháng khuẩn……………………… ……… 14 1.5.3.Tác dụng trên tim mạch…………………………… 14 1.5.4. Tác dụng cầm máu 14 1.5.5.Tác dụng giảm đau 15 1.5.6. Độc tính 15 1.6. Công dụng 15 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu…… ………………………….………….… 17 2.1.1. Nguyên liệu……………………………………….…… 17 2.1.2. Hoá chất và trang thiết bị………………………………………… 17 2.2. Phương pháp nghiên cứu…………………………………… 18 2.2.1. Nghiên cứu về thực vật…………………………… 18 2.2.2. Nghiên cứu về hoá học……… ………………… ……………… 19 2.2.2.1. Phương pháp định tính……………………… ………………… 19 2.2.2.2. Phương pháp tách chiết và phân lập chất tinh khiết từ Bảy lá một hoa 19 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu thực vật ……………………… … 21 3.2. Kết quả định tính …………………………………………………… 23 3.3. Kết quả chiết xuất, phân lập và nhận dạng các chất … 30 3.3.1. Chiết các phân đoạn từ phần dưới mặt đất Bảy lá một hoa…… 30 3.3.2. Kết quả phân lập và tinh sạch chất tinh khiết từ phân đoạn ethyl acetat…… …… …………………………………………………… 32 3.3.2.1. Khảo sát bằng sắc ký lớp mỏng……………………………… 32 3.3.2.2. Phân lập bằng sắc ký cột……………………………………………33 3.3.2.3. Biện giải cấu trúc của chất PE 1 ………… ….…………………… 37 3.4. Bàn luận…………………………………………………………………42 3.4.1. Về việc chọn đề tài và mục tiêu của đề tài…………………… … 42 3.4.2. Về thực vật………………………………………………… … 43 3.4.3. Về hoá học……………………………………………………….……43 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1. Kết luận.……………………… …………………………………… 46 4.2. Đề xuất………………………………………………………………….46 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ BLMH : Bảy lá một hoa CC : Sắc ký cột CS : Cộng sự DCM : Diclomethan Dd : Dung dịch EtOAc : Ethyl acetat EtOH : Ethanol HPLC : Hight Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) MeOH : Methanol NXB : Nhà xuất bản PD : Polyphyllin D Pđ : Phân đoạn SKC : Sắc ký cột SKLM : Sắc ký lớp mỏng Tr., pp. : Trang VKH & CNVN : Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam DANH MỤC CÁC BẢNG STT Bảng Nội dung Trang 1 1.1 Các loài thuộc chi Paris L. ở Việt Nam 3 2 1.2 Các saponin được Xu – Jie Qin và CS phân lập từ thân và lá Paris polyphylla var. yunnanensis 8 3 1.3 Các saponin được Xia Wu và CS phân lập từ thân và lá Paris polyphylla var. yunnanensis 11 4 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong phần dưới mặt đất BLMH bằng phản ứng hoá học 29 5 3.2 Các hệ dung môi sử dụng chạy cột phân đoạn EtOAc 34 6 3.3 So sánh phổ của PE 1 với phổ của polyphyllin D 39 7 3.4 So sánh tác dụng của polyphyllin D và các thuốc chống ung thư trên tế bào ung thư gan HepG2 và ung thư kháng thuốc R-HepG2 45 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ STT Hình Nội dung Trang 1 2.1 Phần dưới mặt đất của Bảy lá một hoa sau khi sơ chế 17 2 2.2 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu chiết xuất và phân lập chất tinh khiết từ phần dưới mặt đất của Bảy lá một hoa 20 3 3.1 Mẫu cây Bảy lá một hoa thu hái ở Đà Lạt – Lâm Đồng 22 4 3.2 Hình ảnh kết quả định tính acid amin, saponin và đường khử 30 5 3.3 Sơ đồ quy trình chiết các cao phân đoạn từ phần dưới mặt đất Bảy lá một hoa 31 6 3.4 Sắc ký đồ khi khảo sát phân đoạn EtOAc bằng các hệ dung môi khác nhau 33 7 3.5 Sắc ký đồ các phân đoạn sau khi chạy cột phân đoạn EtOAc 35 8 3.6 Sắc ký đồ của cao EtOAc, phân đoạn II và chất PE 1 36 9 3.7 Sơ đồ phân lập chất tinh khiết từ Bảy lá một hoa 37 10 3.8 Công thức cấu tạo chất PE 1 42 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa, với diện tích phần đất liền hơn 330.000 km 2 , đồi núi chiếm 4/5 diện tích. Những điều kiện địa lý và khí hậu trên đã tạo cho Việt Nam có thảm thực vật phong phú và đa dạng, trong đó có rất nhiều loài được dùng làm thuốc. Nhiều dược chất làm thuốc có nguồn gốc từ dược liệu như: rutin, D. strophantin, berberin, taxol, palmatin, artermisinin, Xu hướng nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của các hợp chất thiên nhiên để làm thuốc ngày càng được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm bởi nhiều ưu điểm như: độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể so với các thuốc có nguồn gốc tổng hợp khác. Bảy lá một hoa (Paris chinenis Franch.) và những loài khác cùng chi là những cây thuốc quý hiếm, thường được sử dụng trong dân gian để tiêu sưng nhọt, chữa rắn cắn,… [5]; từ lâu Trung Quốc đã sử dụng vị thuốc này để điều trị ung thư. Hiện nay, tác dụng dược lý đặc biệt là tác dụng chống ung thư của Bảy lá một hoa đang được các nhà khoa học trên thế giới đi sâu nghiên cứu. Tuy nhiên, tại Việt Nam chưa có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hoá học cũng như tác dụng sinh học của Paris chinensis Franch. nói riêng cũng như các loài thuộc chi Paris L. nói chung. Vì vậy, để góp phần làm sáng tỏ thành phần hoá học cũng như giá trị sử dụng của loài Paris chinensis Franch. ở Việt Nam, chúng tôi thực hiện đề tài “ Bƣớc đầu nghiên cứu thành phần hoá học của loài Bảy lá một hoa (Paris chinensis Franch.)” với các mục tiêu như sau: 1. Sơ bộ xác định sự có mặt của các nhóm chất chính thuộc phần dưới mặt đất của Bảy lá một hoa. 2. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các chất phân lập được từ phần dưới mặt đất của Bảy lá một hoa. 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 . Vị trí phân loại chi Paris L. Theo hệ thống phân loại của Takhtajan (1987), vị trí phân loại của chi Paris L. là: Phân giới thực vật bậc cao. Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta). Lớp Hành (Liliopsida). Phân lớp Loa kèn (Lilidae). Bộ củ nâu (Dioscoreales). Họ Bảy lá một hoa (Trọng lâu) (Trilliaceae). Chi Bảy lá một hoa, Tảo hưu (Paris L.) [4]. 1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Paris L. 1.2.1. Đặc điểm thực vật chi Paris L. Cỏ nhiều năm; thân rễ thường hình trụ, nạc, nằm ngang; phần trên mặt đất thẳng đứng, đơn độc không phân nhánh, nảy mầm vào mùa xuân, tàn lụi vào mùa đông. Lá mọc đối hoặc mọc vòng trên thân, 4 - 10 lá; phiến lá màu lục, có vệt tím hoặc không, hình mũi giáo, hình thuôn, hình trứng ngược, mềm, gân bên rõ, không có cuống hoặc có cuống dài hoặc ngắn. Hoa thường đơn độc hoặc một vài hoa mọc ở đỉnh, to, màu lục, đều, lưỡng tính, mẫu 3 - 5, cuống dài, thẳng đứng. Đài (2) 3 - 5 (10), rời nhau, hình mũi giáo, màu lục hoặc màu trắng, thường to hơn cánh hoa, xếp lợp hoặc hơi vặn. Cánh hoa 2 (3) - 5 (10), dạng dải hoặc hình trứng, bằng nhau, màu sắc khác nhau. Nhị 3 - 22 chiếc, phần lớn là 6 - 12; chỉ nhị dẹp, ngắn, đính ở gốc mảnh bao hoa; bao phấn hình thuôn, đính gốc, 2 ô, mở bằng khe dọc, đỉnh trung đới kéo dài thành hình cầu hoặc hình sợi hoặc không kéo dài. Bầu thượng, tròn hoặc có cạnh, 3 - 12 lá noãn, nhiều ô, với kiểu đính noãn trung trụ hoặc 1 ô với kiểu đính noãn bên, mỗi bên nhiều noãn; vòi nhuỵ 3 - 5, rời hoặc dính nhau phần [...]... Tình hình nghiên cứu trong nước: Các nghiên cứu về Bảy lá một hoa cho thấy thân rễ của loại thảo dược này chứa 7 - 9 % đường [1], sơ bộ chứa các nhóm chất chính là saponin, tanin catechic, sterol, acid amin, polysacharid [7] Như vậy, những nghiên cứu về thành phần hóa học của Bảy lá một hoa tại Việt Nam còn rất hạn chế 1.5 Tác dụng sinh học 1.5.1 Tác dụng chống ung thƣ Theo Jing Suna và CS phần chiết... thân rễ Bảy lá một hoa (4 g), thiên hoa phấn (8 g), bạc hà (12 g), sắc uống - Chữa rắn độc cắn, nhọt ở vú, viêm phổi: thân rễ Bảy lá một hoa (4 - 20 g), sắc uống - Chữa hen suyễn, ung thư phổi: thân rễ Bảy lá một hoa (4 - 20 g) phối hợp với các vị thuốc khác - Chữa lòi dom: thân rễ Bảy lá một hoa mài với giấm bôi rồi đẩy vào 17 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1... 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu Mẫu cây Bảy lá một hoa tươi thu hái ở Đà Lạt, Lâm Đồng, vào tháng 12 năm 2013 Sau khi nghiên cứu về thực vật, phần dưới mặt đất của Bảy lá một hoa được rửa sạch, thái mỏng, sấy đến khối lượng không đổi ở 55oC Bảo quản trong túi nilon để sử dụng trong quá trình nghiên cứu Hình 2.1: Phần dƣới mặt đất của Bảy lá một hoa sau khi sơ chế 2.1.2 Hoá chất, trang thiết... thực vật cây Bảy lá một hoa, đối chiếu với các tài liệu chuyên khoa phân loại thực vật như: ―Thực vật chí Việt Nam‖ [6], ―Thực vật chí Trung Quốc‖, với sự giúp đỡ của PGS TS Vũ Xuân Phương cùng các chuyên gia thực vật, chúng tôi giám định mẫu cây Bảy lá một hoa thu hái ở Đà Lạt – Lâm Đồng có tên khoa học là Paris chinensis Franch (Phụ lục 1) họ Trọng lâu (Trilliaceae) 22 Lá và hoa Cuống hoa và Hoa Tràng,... Butan, Nê pan, Pakistan, Mianma, Thái lan), châu Âu và châu Mỹ [6] 1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố loài Bảy lá một hoa (Paris chinensis Franch ) Bảy lá một hoa có tên khoa học : Paris chinensis Franch Tên đồng nghĩa: P polyphylla Sm var chinensis (Franch.) Hara [5] Tên khác : Tảo hưu, Thất diệp nhất chi hoa, cúa dô (H’Mông) [1] Tên nước ngoài: Parisette, Herbe – Paris (Pháp) [1] Họ Trilliaceae [1], [5]... Ngoài ra, Bảy lá một hoa còn có ở Mianma, Trung Quốc, Lào, Thái Lan [6] 1.4 .Thành phần hoá học Tình hình nghiên cứu trên thế giới Các nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài thuộc chi Paris L chỉ ra sự có mặt của các nhóm chất tannin, flavonoid, axid phenolic, saponin [13], [23], đường [1], acid amin [21] Trong đó, thành phần chính là saponin steroid [9], [18] * Năm 2005, Devkota đã phân lập được... hưởng từ hạt nhân 20 Bảy lá một hoa (phần dưới mặt đất) Chiết 3 lần bằng EtOH 800 thu hồi dung môi Cao tổng Bổ sung nước Cao n-hexan Lắc với n-hexan Dịch nước Cao diclomethan Lắc với diclomethan Dịch nước Cao nước Lắc với EtOAc Cao EtOAc Chạy cột, tinh chế Chất tinh khiết Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế nghiên cứu chiết xuất và phân lập chất tinh khiết từ phần dƣới mặt đất của Bảy lá một hoa 21 CHƢƠNG 3: KẾT... Sinh thái và phân bố: Bảy lá một hoa mọc nơi đất ẩm, nhiều mùn, gần bờ nước, khe suối hay hốc đá, dưới tán rừng kín thường xanh ở độ cao trên 600 m Mùa ra hoa tháng 2 - 6, mùa quả tháng 3 - 10 [6], [5] Bảy lá một hoa phân bố ở Lào Cai (Sa Pa), Yên Bái (Nghĩa Lộ), Lai Châu (Tuần Giáo), Phú Thọ (Thanh Sơn), Hà Tây (Ba Vì), Hoà Bình (Lương Sơn), Mai Châu (Pà Cò) Ngoài ra, Bảy lá một hoa còn có ở Mianma,... ống nghiệm dịch chiết Bảy lá một hoa 2-3 giọt dung dịch chì acetat 10% Hiện tượng: Không thấy có tủa bông trắng Phản ứng với đồng acetat: cho vào ống nghiệm chứa dịch chiết Bảy lá một hoa 2-3 giọt đồng acetat Hiện tượng: Không xuất hiện tủa nâu Kết luận: Dƣợc liệu không có tanin 3.2.7 Định tính acid hữu cơ Thiết kế thí nghiệm: Cho vào ống nghiệm có dịch chiết nước Bảy lá một hoa một ít tinh thể Na2CO3... nhiều loài cây thuộc chi Paris L mọc ở những tỉnh miền Tây Nam Trung Quốc đã được dùng chủ yếu làm thuốc chữa sốt, giải độc và chữa ho [1] Cũng có khả năng trị kinh phong lắc đầu, lè lưỡi Cũng có thể trị bệnh phổi và độc giang mai Dân gian thường dùng làm mát khi bị sưng đau và hen suyễn [5] 16 Một số bài thuốc có Bảy lá một hoa [1] - Chữa trẻ em kinh sài, tay chân co giật: thân rễ Bảy lá một hoa, sấy . BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN DUY PHƢƠNG BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA CÂYBẢY LÁ MỘT HOA (PARIS CHINENSIS FRANCH.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SỸ. 2014 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN DUY PHƢƠNG BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA (PARIS CHINENSIS FRANCH.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SỸ. Phần dưới mặt đất của Bảy lá một hoa sau khi sơ chế 17 2 2.2 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu chiết xuất và phân lập chất tinh khiết từ phần dưới mặt đất của Bảy lá một hoa 20 3 3.1 Mẫu cây