BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HỒNG NHUNG GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH ĐƯỢC TỔNG HỢP BỞI STREPTOMYCES 21.123 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HỒNG NHUNG GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH ĐƯỢC TỔNG HỢP BỞI STREPTOMYCES 21.123 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn : Ds .Tạ Thu Lan Nơi thực hiện : Bộ môn Vi sinh - Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến DS. Tạ Thu Lan - người đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình thực hiện bài khóa luận này. Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật viên giảng dạy và công tác tại Bộ môn Vi sinh – Sinh học, Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm tại đây. Cũng nhân dịp này, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể thầy cô giáo trong trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt những kiến thức cần thiết, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, những người thân luôn ở bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Do điều kiện và thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận khó tránh khỏi những thiếu sót. Tôi mong nhận được được những góp ý của thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 05/05/2014 Sinh viên NGUYỄN THỊ HỒNG NHUNG MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1. TỔNG QUAN 2 1.1 Đại cương về kháng sinh 2 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh 2 1.1.2 Phân loại kháng sinh 2 1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh 3 1.1.4 Các ứng dụng của kháng sinh 3 1.1.5 Kháng sinh actinomycin D 4 1.2 Đại cương về xạ khuẩn 5 1.2.1 Lớp xạ khuẩn 5 1.2.2 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces 7 1.3 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 8 1.4 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn sinh 11 1.4.1 Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên 11 1.4.2 Đột biến cải tạo giống xạ khuẩn sinh kháng sinh 11 1.4.3 Bảo quản giống xạ khuẩn 12 1.5 Chiết, tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 13 1.5.1 Chiết xuất 13 1.5.2 Trao đổi ion tách kháng sinh 13 1.5.3 Tinh chế 14 1.6 Phổ tử ngoại, phổ hồng ngoại, phổ khối 14 1.6.1 Phổ tử ngoại 14 1.6.2 Phổ hồng ngoại 14 1.6.3 Phổ khổi 15 1.7 Các nghiên cứu liên quan 16 1.7.1 Sản xuất kháng sinh actinomycin D từ Streptomyces 21.123 16 1.7.2 Nghiên cứu phát triển actinomycin D từ Streptomyces parvulus 16 1.7.3 Phát triển các điều kiện tối ưu cho tổng hợp actinomycin D của Sreptomyces parvulus 17 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Nguyên liệu và thiết bị 17 2.1.1 Vi sinh vật 17 2.1.2 Môi trường 18 2.1.3 Hóa chất và sinh phẩm 18 2.1.4 Thiết bị 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy và giữ giống trong ống nghiệm 20 2.3.2 Phương pháp cải tạo giống 21 2.3.3 Phương pháp lên men trên máy lắc. 22 2.3.4 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 23 2.3.5 Phương pháp chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ 24 2.3.6 Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay chân không 25 2.3.7 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký 25 2.3.8 Nghiên cứu cấu trúc phân tử kháng sinh bằng phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ tử ngoại (UV) và đo nhiệt độ nóng chảy. 27 Chương 3. KẾT QUẢ 27 3.1 Nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh 27 3.1.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên chủng Streptomyces 21.123 27 3.1.2 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 28 3.1.3 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 29 3.2 Kết quả chọn lọc biến chủng tổng hợp kháng sinh tốt nhất trong môi trường dịch thể 31 3.3 Chiết xuất và tinh chế kháng sinh từ dịch lọc 31 3.3.1 Chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ 31 3.3.2 Kết quả chạy sắc ký lớp mỏng 32 3.3.3 Kết quả chạy sắc ký cột 33 3.4 Kết quả nhiệt độ nóng chảy và biện giải sơ bộ phổ các thành phần trong hỗn hợp kháng sinh thu được 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Đường kính trung bình AND Acid 2’ – deoxyribonucleic B. subtilis Bacillus subtilis ĐB Đột biến Dd Dung dịch DM Dung môi DMHC Dung môi hữu cơ g Gram Gr(-) Gram âm Gr(+) Gram dương HTKS Hoạt tính kháng sinh IR Hồng ngoại- Infrared KS Kháng sinh MT Môi trường MS Phổ khối- Mass spectrometry P. mirabilis Proteus mirabilis s Độ lệch thực nghiệm có hiệu chỉnh SKLM Sắc ký lớp mỏng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên STH Sinh tổng hợp S. Streptomyces UV Tử ngoại- Ultraviolet VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định Bảng 2.2: Các loại dung môi sử dụng Bàng 3.1 Kết quả SLNN chủng Streptomyces 21.123 Bảng 3.2 Kết quả đột biến lần 1 Bảng 3.3 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh lần 2 Bảng 3.4 Kết quả lên men chọn biến chủng lên men chìm tốt nhất Bảng 3.5 Kết quả chọn dung môi Bảng 3.6 Kết quả SKLM trên B.subtilis Bảng 3.7 Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1 Bảng 3.8 Kết quả SKLM các phân đoạn có hoạt tính KS lần 1 Bảng 3.9 Kết quả thử hoạt tính KS các phân đoạn chạy cột lần 2 Bảng 3.10 Kết quả SKLM các phân đoạn có hoạt tính KS lần 2 Bảng 3.11 Khảng sinh tinh khiết thu được Bảng 3.12 Kết quả phổ UV DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Khuẩn lạc xạ khuẩn Hình 2: Sơ đồ phân loại xạ khuẩn Hình P1: Cơ chế tác dụng kháng sinh Hình P2: Khuẩn lạc xạ khuẩn ĐB1 Hình P3: Thử hoạt tính KS bằng phương pháp khổi thạch (VSV kiếm định B.subtilis) Hình P4: Thử hoạt tính dịch chiết DMHC bằng phương pháp khoanh giấy lọc (VSV kiếm định B.subtilis) Hình P5: Thử hoạt tính dịch lên men KS bằng phương pháp giếng thạch (VSV kiếm định B.subtilis) Hình P6: Các phân đoạn sắc ký cột Hình P7: Chạy sắc ký trên bản mỏng Silicagel Hình P8: Chạy sắc ký cột lần 2 Hình P9: Kết quả đo phổ UV-VIS chất 1 Hình P10: Kết quả đo phổ UV-VIS chất 2 Hình P11: Kết quả đo phổ IR chất 1 Hình P12: Kết quả đo phổ IR chất 2 Hình P13: Kết quả đo phổ MS chất 1 Hình P14: Kết quả đo phổ MS chất 2 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Sự ra đời của các loại thuốc kháng khuẩn và kháng sinh là một trong những thành tựu vĩ đại của y học, mở ra một kỷ nguyên mới trong việc phòng và chữa các bệnh nhiễm trùng. Tuy nhiên, cùng với sự biến đổi của vi khuẩn kháng lại tác dụng của thuốc và việc lạm dụng kháng sinh làm cho các kháng sinh "kho vũ khí chống lại vi khuẩn" đang dần dần vô tác dụng do vi khuẩn đã quá "quen" với thuốc. Viện Y học Mỹ gọi tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn là thảm họa đối với môi trường và sức khỏe cộng đồng. WHO coi sự gia tăng kháng thuốc là viễn cảnh đen tối của nhân loại khi kháng sinh không còn tác dụng. Tổng Giám đốc Tổ chức WHO, bà Margaret Chan đã đưa ra lời cảnh báo về khả năng con người quay trở lại thời kỳ trước khi kháng sinh được phát triển nếu không có một hành động toàn cầu giải quyết vấn đề kháng thuốc đang ngày càng trầm trọng. Bà cho biết: "Kho vũ khí điều trị bệnh của con người đang dần cạn kiệt. Tốc độ mất đi những loại thuốc thiết yếu đó nhanh hơn tốc độ phát triển các loại thuốc thay thế rất nhiều. Trên thực tế, hệ thống nghiên cứu và phát triển các loại thuốc kháng sinh mới gần như đã ngừng lại". Nhằm góp phần nghiên cứu và phát hiện thêm những chất kháng sinh mới, chúng tôi tiến hành lựa chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu kháng sinh được sinh tổng hợp bởi Streptomyces 21.123” làm khóa luận tốt nghiệp với các mục tiêu sau:  Nghiên cứu cải tạo giống theo hướng nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh với chủng Streptomyces 21.123.  Nghiên cứu điều kiện chiết, tách, tinh chế kháng sinh để thu kháng sinh tinh khiết.  Nghiên cứu một vài đặc tính của kháng sinh: nhiệt độ nóng chảy, phổ tử ngoại, phổ hồng ngoại, phổ khổi. [...]... vật lý  Lên men sinh tổng hợp kháng sinh  Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế kháng sinh do Sreptomyces 21. 123 tổng hợp  Xác định phổ UV, phổ IR, phổ khối và nhiệt độ nóng chảy của kháng sinh thu được 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy và giữ giống trong ống nghiệm Chủng Streptomyces 21. 123 đã chọn được nuôi cấy trên môi trường thạch nghiêng MT1 Môi trường phân lập được pha, chỉnh... Các nghiên cứu liên quan 1.7.1 Sản xuất kháng sinh actinomycin D từ Streptomyces 21. 123 Chủng giống Streptomyces 21. 123 được phân lập từ đất tại phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh và sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội đã được tác giả Hoàng Thị Thùy Hương (2009) nghiên cứu và báo cáo trong hội nghị khoa học trường cũng như trong luận văn thạc sỹ[8] Kết quả nghiên cứu cho thấy, chủng giống Streptomyces 21. 123...2 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh Kháng sinh là những hóa chất nguồn gốc vi sinh vật (nấm hoặc vi khuẩn) hay các nguồn khác có hoạt tính sinh học cao, có khả năng ức chế, thậm chí tiêu diệt một số vi khuẩn hay vi sinh thể khác ở nồng độ thấp Các chất này được điều chế bằng cách chiết xuất, bán tổng hợp hay tổng hợp[ 2,9] 1.1.2 Phân loại kháng sinh Có nhiều... sinh ansamycin (rifammycin, rifampicin)  Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B…)  Các kháng sinh nhóm antracyclin (daunorubicin…)  Các kháng sinh nhóm actinomycin (actinomycin D )  Các kháng sinh nhóm quinolon (ciprofloxacin, ofloxacin…)  Các kháng sinh sulfonamid (sulfamethazol…) 1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp. .. tin hơn về ion nghiên cứu nên được dùng phổ biến hơn.[8] Người ta có thể dùng phương pháp khối phổ để nghiên cứu tất cả các nguyên tố hay hợp chất có thể biến thành dạng khí hay hơi Đối với hợp chất vô cơ, phương pháp phân tích khối phổ thường được dùng để nghiên cứu thành phần đồng vị hoặc để xác định vết các chất nghiên cứu Đối với hợp chất hữu cơ, phương pháp phân tích khối phổ thường được dùng trong... Các kháng sinh β-lactam (penicillin, cephalosporin…)  Các kháng sinh chloramphenicol (chloramphenicol…)  Các kháng sinh aminoglycoside (streptomycin, gentamycin…)  Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (tetracyclin, minocyclin…)  Các kháng sinh polypeptide (polymycin, bacitracin…) 3  Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin )  Các kháng sinh lincosamid (clindamycin, lincomycin…)  Các kháng. .. loại kháng sinh: theo nguồn gốc, theo tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh, theo cơ chế tác dụng… Phân loại dựa trên nguồn gốc:  Kháng sinh nguồn gốc sinh vật gồm có: Các β-lactam (penicillin, cephalosporin, imipinem, monobactam), các aminosid, các phenicol, các tetracyclin, các macrolid và chất tương tự, các rifamycin và polypeptid  Kháng sinh bán tổng hợp như: ampicillin  Kháng sinh tổng hợp. .. thời gian xử lý thích hợp sẽ giết chết hầu hết các VSV Những cá thể nào còn sống sót sẽ có sự đột biến gen, làm thay đổi các tính trạng dẫn đến hoặc làm mất, làm giảm khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên mạnh mẽ (đột biến dương)[9] Để tạo ra các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành đột biến bậc thang, kết hợp các phương pháp... cứu cho thấy, chủng giống Streptomyces 21. 123 nuôi cấy trên môi trường phân lập thích hợp có khả năng sinh kháng sinh, có thành phần chính được biện luận cấu trúc là actinomycin D 1.7.2 Nghiên cứu phát triển actinomycin D từ Streptomyces parvulus Nghiên cứu gần đây cho thấy khởi đầu sự tổng hợp của actinomycin D trong Streptomyces parvulus là do giải phóng từ sự ức chế dị hóa Lglutamat Trong những khám... xuất thuốc kháng sinh Một lượng đáng kể S parvulus đã không thể tổng hợp actinomycin khi D-glucose (0,01-0,25%) đã được thêm vào môi trường nuôi cấy Sự ức chế không phải do sự suy giảm độ pH của môi trường trong quá trình dị hóa glucose [21] Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và thiết bị 2.1.1 Vi sinh vật Giống xạ khuẩn: Chủng Streptomyces 21. 123 được bộ môn Vi sinh- Sinh học, . tài: Góp phần nghiên cứu kháng sinh được sinh tổng hợp bởi Streptomyces 21. 123” làm khóa luận tốt nghiệp với các mục tiêu sau:  Nghiên cứu cải tạo giống theo hướng nâng cao hiệu suất sinh tổng. sinh tổng hợp kháng sinh với chủng Streptomyces 21. 123.  Nghiên cứu điều kiện chiết, tách, tinh chế kháng sinh để thu kháng sinh tinh khiết.  Nghiên cứu một vài đặc tính của kháng sinh: nhiệt. GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH ĐƯỢC TỔNG HỢP BỞI STREPTOMYCES 21. 123 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn : Ds .Tạ Thu Lan Nơi thực hiện : Bộ môn Vi sinh - Sinh học