Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẶT VẤN ĐỀ Liposom là một trong những hệ mang thuốc mới đang nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới nhờ có nhiều ưu điểm về khả năng mang thuốc, kiểm soát giải phóng và khả năng đưa thuốc tới đích tác dụng. Nhằm bắt kịp các tiến bộ của khoa học công nghệ trong lĩnh vực y dược học trên thế giới, trong những năm gần đây, trường đại học Dược Hà Nội đ ã tiến hành nhiều đề tài khoa học để đánh giá khả năng sử dụng liposom trong vận chuyển thuốc. Trong đó liposom doxorubicin được nghiên cứu nhiều nhất và đã thu được một số kết quả đáng khích lệ. Tuy nhiên quy trình chế tạo liposom vẫn chưa hoàn thiện, đặc biệt là trong giai đoạn giảm kích thước và đồng nhất hóa liposom. Đề tài “Ứng dụng phương pháp đẩy qua màng trong nghiên cứu tạo liposomdoxorubicin kích cỡ nano” được tiến hành nhằm áp dụng một phương pháp mớiphương pháp đẩy qua màng vào giai đoạn giảm kích thước tiểu phân, với mục đích hoàn thiện hơn nữa quy trình chế tạo
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỒ TRỌNG TOÀN ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐẨY QUA MÀNG TRONG NGHIÊN CỨU TẠO LIPOSOM-DOXORUBICIN KÍCHCỠ NANO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỒ TRỌNG TOÀN ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐẨY QUA MÀNG TRONG NGHIÊN CỨU TẠO LIPOSOM-DOXORUBICIN KÍCH CỠ NANO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ Người hướng dẫn: 1.TS. Nguyễn Thị Lập 2.ThS. Bùi Bá Minh Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Hóa sinh 2. Bộ môn Bào chế 3. Viện Công nghệ sinh học HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin biết bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: TS. Nguyễn Thị Lập Cô đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài này. Cô đã luôn động viên và chỉ cho tôi hướng giải quyết vấn đề, để tôi có thể hoàn thành các mục tiêu của đề tài. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Bùi Bá Minh, thầy đã cho tôi những lời khuyên bổ ích trong quá trình nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Lê Quang Huấn, ThS. Lê Thị Thùy Dương cùng các cán bộ công tác tại phòng Công nghệ tế bào động vật – Viện công nghệ sinh học, những người đã nhiệt tình giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành khóa luận. Tôi xin cảm ơn các thầy cô và các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa sinh, Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, những người đã luôn động viên giúp đỡ tôi hoàn thành tốt đề tài của mình. Hà Nội, 21/05/2013 Sinh viên Hồ Trọng Toàn MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………… 1 CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN………………………………………………… 2 1.1 Đại cương về liposom 2 1.2 Nguyên liệu 3 1.2.1 Doxorubicin hydroclorid………………………………………………… 3 1.2.2 Phospholipid …………………………………………………………… 5 1.2.3 Cholesterol……………………………………………………………………… 6 1.2.4 Các thành phần khác …………………………………………………………… 7 1.3 Các phương pháp chế tạo liposom……………………………………………… 7 1.3.1 Phương pháp Bangham………………………………………………………… 7 1.3.2 Phương pháp bốc hơi pha đảo (REV)…………………………………………….9 1.4 Các phương pháp làm nhỏ kích thước và đồng nhất hóa tiểu phân liposom 9 1.4.1 Tầm quan trọng của việc làm nhỏ kích thước tiểu phân………………………….9 1.4.2 Phương pháp siêu âm……………………………………………………………10 1.4.3 Phương pháp đẩy qua màng (Membrane extrusion)…………………… 11 1.5 Các phương pháp liposom hóa doxorubicin………………………………… 15 1.5.1 Cơ chế thụ động…………………………………………………………………15 1.5.2 Cơ chế chủ động……………………………………………………… 15 CHƯƠNG II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………… 18 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị………………………………………………… 18 2.1.1 Nguyên liệu…………………………………………………………………… 18 2.1.2 Hóa chất…………………………………………………………………………18 2.1.3 Thiết bị thí nghiệm………………………………………………………………18 2.2 Nội dung nghiên cứu…………………………………………………… 18 2.2.1 Chế tạo liposom DOX kích cỡ nano…………………………………… 18 2.2.2 So sánh đặc điểm và tính chất của các tiểu phân liposom thu được sau đồng nhất hóa bằng phương pháp đẩy qua màng với phương pháp siêu âm 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu……………………………………………………… 19 2.3.1 Phương pháp chế tạo liposom DOX…………………………………………… 19 2.3.2 Phương pháp đánh giá liposom tạo thành……………………………… 23 CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN …………………………………… 26 3.1 Kết quả……………………………………………………………………………26 3.1.1 Nghiên cứu ứng dụng phương pháp đẩy qua màng trong giảm kích thước và đồng nhất hóa tiểu phân liposom……………………………………………………………26 3.1.2 Hiệu suất liposom hóa doxorubicin…………………………………… 34 3.2 Bàn luận 37 3.2.1 Chế tạo liposom không mang dược chất……………………………………… 37 3.2.2 Giảm kích thước và đồng nhất hóa tiểu phân liposom ……………………… 38 3.2.2 Liposom hóa DOX và loại DOX tự do bên ngoài liposom…………………… 41 Kết luận và đề xuất………………………………………………………… 43 Tài liệu tham khảo DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DSPC 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine DPPC 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine DMPC 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine EPC Egg phosphatidylcholin HEPC Hydrogenated Egg phosphatidylcholin SPC Soy phosphatidylcholin HSPC Hydrogenated soy phosphatidylcholin LUV Large unilamellar vesicle MLV Multilamellar large vesicle PBS Phosphate buffered saline PDI Polydispersity index PEG Polyethylene glycol PEG-PE Polyethylene glycol - phosphatidylethanolamin RES Reticulo endothelial system REV Rehydration evaporation vesicle TEM Transmission electron microscopy DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Nguyên liệu chế tạo liposom DOX Bảng 3.1 Các thông số đánh giá tiểu phân liposom thu được sau các lần đẩy qua màng 400nm Bảng 3.2 Các thông số đánh giá tiểu phân liposom thu được sau các lần đẩy qua màng 80nm Bảng 3.3 Kích thước tiểu phân, chỉ số đa phân tán của hệliposom sau giảm kích thước và đồng nhất hóa theo hai phương pháp: đẩy qua màng và siêu âm đầu dò Bảng 3.4 Phân bố kích thước tiểu phân theo thể tích Bảng 3.5 Mật độ quang của dung dịch DOX ở các nồng độ khác nhau Bảng 3.6 Kết quả định lượng DOX Bảng 3.7 Hiệu suất liposom hóa DOX thu được từ 2 phương pháp đồng nhất hóa và giảm kích thước tiểu phân lên hiệu suất liposom hóa DOX : đẩy qua màng và siêu âm đầu dò DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cấu tạo liposom Hình 1.2 Cơ chế hình thành liposom theo phương pháp Bangham Hình 1.3 Cơ chế giảm kích thước liposom trong phương pháp đẩy qua màng Hình 1.4 Ảnh hưởng của số lần đẩy qua màng lên kích thước tiểu phân liposom Hình 1.5 Thể tích lõi nước trong liposom thu được sau đồng nhất hóa theo 2 phương pháp: kết hợp đông chảy và đẩy qua màng ; đẩy qua màng Hình 1.6 Cơ chế liposom hóa DOX bằng kỹ thuật gradient amoni Hình 2.1 Sơ đồ chế tạo liposom DOX Hình 3.1 Đồ thị biến thiên PDI theo số lần đẩy qua màng 400nm Hình 3.2 Biểu đồ phân bố kích thước theo % thể tích qua các lần đẩy của các phân tử kích thước nhỏ Hình 3.3 Biểu đồ phân bố kích thướctheo % thể tích qua các lần đẩy của các phân tử kích thước lớn Hình 3.4 Đồ thị biến thiên PDI theo số lần đẩy qua màng 80nm Hình 3.5 Kích thước tiểu phân liposom qua các lần đẩy qua màng 80nm Hình 3.6 Ảnh chụp TEM liposom (độ phóng đại 20000 lần) Hình 3.7 Mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ DOX ĐẶT VẤN ĐỀ Liposom là một trong những hệ mang thuốc mới đang nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới nhờ có nhiều ưu điểm về khả năng mang thuốc, kiểm soát giải phóng và khả năng đưa thuốc tới đích tác dụng. Nhằm bắt kịp các tiến bộ của khoa học công nghệ trong lĩnh vực y dược học trên thế giới, trong những năm gần đây, trường đại học Dược Hà Nội đã tiến hành nhiều đề tài khoa học để đánh giá khả năng sử dụng liposom trong vận chuyển thuốc. Trong đó liposom doxorubicin được nghiên cứu nhiều nhất và đã thu được một số kết quả đáng khích lệ. Tuy nhiên quy trình chế tạo liposom vẫn chưa hoàn thiện, đặc biệt là trong giai đoạn giảm kích thước và đồng nhất hóa liposom. Đề tài “Ứng dụng phương pháp đẩy qua màng trong nghiên cứu tạo liposom-doxorubicin kích cỡ nano” được tiến hành nhằm áp dụng một phương pháp mới- phương pháp đẩy qua màng vào giai đoạn giảm kích thước tiểu phân, với mục đích hoàn thiện hơn nữa quy trình chế tạo liposom. Đề tài được thực hiện với 2 mục tiêu : Nghiên cứu ứng dụng phương pháp đẩy qua màng để giảm kích thước tiểu phân liposom So sánh ưu nhược điểm của phương pháp đẩy qua màng với phương pháp siêu âm được sử dụng ở các nghiên cứu trước đó. CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về liposom Liposom có cấu tạo bao gồm một nhân nước ở giữa được bao bọc bởi một hay nhiều lớp phospholipid kép, có kích thước thay đổi từ hàng chục đến hàng ngàn nanomet [5]. Cấu tạo liposom được minh họa trên hình 1.1. Liposom cấu tạo chính từ 2 thành phần: phospholipid (PL) và cholesterol. Hình 1.1 Cấu tạo liposom Trong dược học, liposom được ứng dụng làm hệ mang thuốc vì có rất nhiều ưu điểm. Liposom có khả năng mang thuốc rất đa dạng có thể là phân tử thuốc, protein, nucleotid, thậm chí cả plasmid [26]. 1.2 Nguyên liệu 1.2.1 Doxorubicin hydroclorid (DOX) 1.2.1.1 Công thức [...]... u tiờn ỏp dng k thut y qua mng trong ch to liposom T ú k thut y qua mng tr thnh mt trong nhng k thut tt nht trong ch to liposom LUVs [21] Nguyờn lý: Mu liposom MLVs c y bng ỏp sut cao qua mng cú kớch thc l xỏc nh y nhiu ln qua mi mng v cỏc mng cú kớch thc l gim dn thu c SUVs hoc LUVs cú kớch thc mong mun C ch chi tit ca quỏ trỡnh hỡnh thnh SUVs, LUVs t MLVs trong quỏ trỡnh y qua mng vn cũn cha sỏng... nghiờn cu 2.2.1 Ch to liposom DOX kớch c nano - Nghiờn cu ch to liposom DOX kớch thc c nano, ng dng phng phỏp y qua mng trong gim kớch thc v ng nht húa tiu phõn liposom - Kho sỏt cỏc thụng s ỏnh giỏ tiu phõn liposom thu c : nh hng ca s ln y qua mng lờn kớch thc tiu phõn ca liposom nh hng thi gian thuc lờn hiu sut liposom húa DOX 2.2.2 So sỏnh c im v tớnh cht ca cỏc tiu phõn liposom thu c sau ng... thy mu chun 60oC trong 1h, v nhit phũng, lc trờn thit b vortexer trong vũng 30 giõy em hn hp i o quang, xỏc nh hp th quang 480nm.T mt quang o c v ng chun ó thit lp ta tớnh ra nng DOX cú trong h liposom 2.3.2.4 Phng phỏp xỏc nh hiu sut liposom húa DOX nh lng DOX trong h liposom trc v sau khi thm tỏch theo phng phỏp o quang ó trỡnh by mc 2.3.2.3 Cụng thc tớnh H(%)= CS/ CT x 100% Trong ú: CT , CS... y qua mng ng nht húa Nghiờn cu ch ra rng t l liposom n lp thu c khi phi hp hai phng phỏp cao hn khi ch s dng phng phỏp y qua mng, t l ny lờn ti 90% mu liposom thu c sau khi y nhiu ln qua mng cú kớch thc l 200nm [20] 1.5 Cỏc phng phỏp liposom húa doxorubicin Dc cht cú th a vo trong liposom theo c ch th ng hoc ch ng 1.5.1 C ch th ng Quỏ trỡnh a thuc vo liposom din ra ng thi vi quỏ trỡnh hỡnh thnh liposom. .. thnh trong mụi trng pH thp, sau ú mụi trng bờn ngoi liposom c thay i cú pH cao hn pH bờn trong liposom (pH trong . trong giai đoạn giảm kích thước và đồng nhất hóa liposom. Đề tài Ứng dụng phương pháp đẩy qua màng trong nghiên cứu tạo liposom- doxorubicin kích cỡ nano được tiến hành nhằm áp dụng một phương. TOÀN ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐẨY QUA MÀNG TRONG NGHIÊN CỨU TẠO LIPOSOM- DOXORUBICIN KÍCHCỠ NANO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỒ TRỌNG TOÀN ỨNG DỤNG PHƯƠNG. Nghiên cứu ứng dụng phương pháp đẩy qua màng để giảm kích thước tiểu phân liposom So sánh ưu nhược điểm của phương pháp đẩy qua màng với phương pháp siêu âm được sử dụng ở các nghiên cứu trước