BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ TH Ị LOAN ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ BỎNG CỦA EB12 TRÊN THỰC NGHIỆM HÀ NỘI-2013 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. Ths. Nguyễn Thu Hằng 2. Ts. Lê Minh Hà Nơi thực hiện: Bộ môn Dược Lực LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cám ơn chân thành tới Ths. Nguyễn Thu Hằng, Ts. Lê Minh Hà và Ths. Đỗ Thị Nguyệt Quế - những người thầy đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực nghiệm, truyền đạt nhiều kinh nghiệm và kiến thức chuyên môn quý báu giúp em hoàn thành khóa luận này. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Dược lực, bộ môn Vi sinh-Sinh vật, bộ môn Bào chế- Công nghiệp dược đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian làm thực nghiệm tại bộ môn. Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể cán bộ, giảng viên trường Đại Học Dược Hà Nội vì đã dìu dắt, dạy bảo tận tình trong suốt thời gian em học tập tại đây. Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, người thân và bạn bè - những người đã luôn bên cạnh động viên, yêu quý và chăm lo cho em trong cuộc sống. MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 5 DANH MỤC CÁC BẢNG 6 DANH MỤC CÁC HÌNH 7 ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về bỏng 3 1.1.1. Định nghĩa và dịch tễ bỏng 3 1.1.2. Mức độ nặng của tổn thương bỏng 3 1.1.3. Diễn biến của tổn thương bỏng 7 1.1.4. Hậu quả của bỏng 12 1.1.5. Các thuốc điều trị tại chỗ tổn thương bỏng 12 1.2. Tổng quan về mô hình nghiên cứu bỏng 14 1.2.1. Các phương pháp gây bỏng nhiệt thực nghiệm 14 1.2.2. Động vật thực nghiệm 16 1.2.3. Chỉ tiêu đánh giá 17 1.3. Tổng quan về chất liệu nghiên cứu 19 1.3.1. Nguồn gốc, cấu trúc hóa học, tính chất 19 1.3.2. Tác dụng 20 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu 22 2.1.1. Mẫu nghiên cứu 22 2.1.2. Hóa chất, thuốc thử 22 2.1.3. Thiết bị, máy móc phục vụ nghiên cứu 23 2.1.4. Động vật, vi sinh vật nghiên cứu 23 2.2. Nội dung nghiên cứu 24 2.3. Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1. Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm in vitro của EB12 24 2.3.2. Nghiên cứu tác dụng điều trị tại chỗ của EB12 trên bỏng nhiệt thực nghiệm… 25 2.4. Phương pháp xử lý số liệu 28 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29 3.1. Triển khai mô hình gây bỏng nhiệt thực nghiệm 29 3.2. Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm in vitro của EB12 31 3.3. Tác dụng điều trị tại chỗ của EB12 trên bỏng nhiệt thực nghiệm 32 3.3.1. Tình trạng chung của thỏ 32 3.3.2. Diễn biến đại thể tại vết bỏng 32 3.3.3. Diễn biến cấu trúc vi thể tại vết bỏng 37 3.3.4. Diễn biến của quần thể vi khuẩn tại vết bỏng 38 Chương 4: BÀN LUẬN 40 4.1. Về mô hình nghiên cứu 40 4.1.1. Lựa chọn mô hình nghiên cứu 40 4.1.2. Lựa chọn thời gian gây bỏng 40 4.2. Về tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm in vitro của EB12… 41 4.3. Về tác dụng điều trị tại chỗ của EB12 trên bỏng nhiệt thực nghiệm 43 4.3.1. Tác dụng kháng khuẩn khi điều trị tại chỗ vết bỏng 43 4.3.2. Tác dụng chống viêm, làm sạch vết bỏng 46 4.3.3. Tác dụng trên quá trình liền vết bỏng 48 KẾT LUẬN 50 KIẾN NGHỊ 50 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Aci. Lwofii : Acinetobacter lwoffii AND : acid 2’-deoxyribonucleic ARN m : acid Ribonucleic messenger E. american : Eleutherin american E. bulbosa : Eleutherin bulbosa E. cloacea : Enterobacter cloacea E.coli : Escherichia coli EGF : epidermal growth factor E. indica : Eleutherin indica Ent. Faecium : Enterococcus faecium FGF : fibroblast growth factor GAG : glycosaminoglycan HE : hematoxylin-eosin K. pneumoniae : KlEB12siella pneumoniae PDGF : platelet derived growth factor Pro. Mirabillis : Proteus mirabilis S.aureus : Staphylococcus aureus Str. Agalactiae : Streptoccus agalactiae TGF- β : transforming growth factor β VEGF : vascular endothelial growth factor VK : vi khuẩn. DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Phân loại độ sâu tổn thương bỏng 5 Bảng 1.2: Phân loại mức độ nặng của bỏng 7 Bảng 2.1: Thang điểm đánh giá tình trạng đại thể tại vết bỏng 26 Bảng 3.1: Đường kính vòng vô khuẩn của các mẫu thử đối với các loài vi khuẩn 31 Bảng 3.2: Kết quả đánh giá diễn biến đại thể tại vết bỏng 35 Bảng 3.3: Mức độ thu hẹp diện tích vết bỏng 36 Bảng 3.4: Thời gian liền vết bỏng 36 Bảng 3.5: Tỷ lệ các vi khuẩn phân lập được tại vết bỏng 38 Bảng 3.6 Số lượng vi khuẩn S. aureus trên 1 cm 2 diện tích vết bỏng 39 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1: Phân loại độ sâu tổn thương bỏng 5 Hình 1.2: Mô hình 3 vùng trong chấn thương bỏng của Jackson D. 7 Hình 1.3: Cấu tạo hóa học của eleutherin và isoeleutherin 20 Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu tác dụng của EB12 trên bỏng nhiệt thực nghiệm 25 Hình 3.1: Quá trình gây bỏng thực nghiệm 29 Hình 3.2: Hình ảnh vết thương sau khi gây bỏng 29 Hình 3.3: Hình ảnh vi thể vết bỏng với thời gian gây bỏng 35 giây 30 Hình 3.4: Hình ảnh vi thể vết bỏng với thời gian gây bỏng 40 giây 30 Hình 3.5: Hình ảnh vi thể vết bỏng với thời gian gây bỏng 50 giây 31 Hình 3.6: Hình ảnh các vết bỏng vào ngày thứ 0 và ngày thứ 7 bôi mẫu thử 33 Hình 3.7: Hình ảnh các vết bỏng vào ngày thứ 14 và 21 bôi mẫu thử 34 Hình 3.8: Hình ảnh mô hạt tái tạo, có viêm mạn tính 37 Hình 3.9: Hình ảnh tổn thương bỏng đang tái tạo 37 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bỏng là chấn thương thường gặp trong lao động sản xuất cũng như sinh hoạt thường ngày. Ở nước ta, bỏng đứng hàng thứ 3 trong số các chấn thương ngoại khoa nói chung [13] với 844.000 bệnh nhân mỗi năm, chiếm gần 1% dân số [12]. Bỏng có thể do nhiều nguyên nhân gây ra, trong đó bỏng nhiệt thường gặp nhất chiếm khoảng 84-94% số ca bỏng [17]. Bệnh nhân bỏng thường phải điều trị dài ngày, tốn kém. Nếu không được điều trị tốt, bỏng có thể để lại nhiều di chứng lâu dài, ảnh hưởng tới sinh hoạt hàng ngày, khả năng lao động, thẩm mỹ và tâm lý của người bệnh [17], [23]. Điều trị tại chỗ có vai trò quan trọng đối với quá trình điều trị bỏng. Mục đích điều trị tại chỗ là loại bỏ mô hoại tử, ngăn ngừa nhiễm khuẩn, đẩy nhanh quá trình liền vết thương, hạn chế di chứng. Có nhiều nhóm thuốc được sử dụng để điều trị tại chỗ vết thương bỏng như: thuốc kháng khuẩn, thuốc làm rụng hoại tử, thuốc làm khô se vết bỏng, thuốc kích thích biểu mô hóa,… [17]. Tuy nhiên, ngay cả những thuốc được sử dụng phổ biến nhất vẫn có rất nhiều tác dụng không mong muốn, thậm chí làm chậm quá trình liền vết thương. Chính vì vậy, việc tìm kiếm các thuốc mới tốt hơn nhằm hỗ trợ hoặc thay thế các thuốc hiện tại luôn là yêu cầu bức thiết đối với công tác điều trị bỏng hiện nay. Sâm đại hành là dược liệu phổ biến, mọc hoang và được trồng ở nhiều nơi ở nước ta để làm thuốc. Từ lâu, Sâm đại hành đã được sử dụng rộng rãi trong dân gian để chữa các bệnh ngoài da như viêm da, mụn nhọt, chốc đầu, lở loét [4], [9]. Nghiên cứu của một số tác giả trong và ngoài nước cho thấy các hoạt chất chính trong Sâm đại hành là eleutherin và isoeleutherin có tác dụng kháng khuẩn tốt đối với một số vi khuẩn [5], [42]. Từ nguồn dược liệu rẻ tiền, sẵn có, với quy trình đơn giản, viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, viện Khoa học quốc gia Việt Nam đã chiết xuất và phân lập thành công hỗn hợp 2 hoạt chất eleutherin và isoeleutherin với tỷ lệ 1:1 (gọi là EB12) từ thân rễ Sâm đại hành. 2 Với mong muốn tìm được loại thuốc mới từ nguồn nguyên liệu sẵn có trong nước, dựa vào các tài liệu tham khảo và các nghiên cứu thăm dò, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Đánh giá tác dụng điều trị bỏng của EB12 trên thực nghiệm” với 2 mục tiêu sau: 1. Nghiên cứu tác dụng ức chế vi khuẩn, vi nấm in vitro của EB12. 2. Nghiên cứu tác dụng điều trị tại chỗ của kem EB12 trên bỏng nhiệt thực nghiệm. 3 Chương 1: TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ BỎNG 1.1.1. Định nghĩa và dịch tễ bỏng Bỏng là các tổn thương do nhiệt độ, hóa chất hoặc dòng điện gây ra. Tổn thương bỏng thường chỉ ở da, nhưng cũng có trường hợp bỏng sâu tới các lớp dưới da như gân, cơ, xương khớp và các tạng. Bỏng là chấn thương ngoại khoa thường gặp. Theo thống kê, nước Anh có khoảng 250.000 bệnh nhân bỏng mỗi năm [26]. Con số này ở Mỹ lên đến hơn 1 triệu người [48]. Việt Nam ước tính mỗi năm có khoảng 844.000 người bị bỏng, chiếm gần 1% dân số, trong đó 25% là trẻ em từ 1 đến 5 tuổi [12]. Tai nạn bỏng là một trong những gánh nặng đối với ngành y tế các nước. Hàng năm, số bệnh nhân bỏng cần điều trị nội trú ở Pháp khoảng 10.000 người [17], ở Hoa Kỳ khoảng 75.000 người [48], ở Anh khoảng 112.000 người [26]. Tại Việt Nam, chỉ tính riêng Viện Bỏng Quốc Gia mỗi năm đã tiếp nhận và điều trị cho hơn 2.500 bệnh nhân bỏng mức độ từ nặng đến rất nặng [17]. Bỏng để lại những gánh nặng thương tật nặng nề, đồng thời là nguyên nhân gây tử vong đáng lo ngại. Thống kê của tổ chức Y tế Thế giới năm 2004 cho thấy mỗi năm có hơn 310.000 bệnh nhân tử vong do bỏng lửa, chưa kể đến các loại bỏng khác, trong đó hơn 30% bệnh nhân dưới 20 tuổi [23]. Tại Việt Nam, nghiên cứu “Gánh nặng bệnh tật và chấn thương ở Việt Nam 2008” của Nguyễn Thị Trang Nhung cho thấy tỷ lệ tử vong do bỏng là 243/100.000 dân, cao hơn rất nhiều so với tỷ lệ chung của khu vực và thế giới [13]. Cũng theo nghiên cứu này, số năm sống tàn tật hiệu chỉnh (DALYs) mà tai nạn bỏng để lại lên tới 15.717/100.000 dân [13]. 1.1.2. Mức độ nặng của tổn thương bỏng Đối với tổn thương bỏng, phản ứng của cơ thể, diễn biến của quá trình liền vết thương, nguy cơ xuất hiện các biến chứng và hậu quả do bỏng để lại tùy thuộc vào mức độ nặng của tổn thương. Để đánh giá mức độ nặng của tổn thương bỏng, có thể dựa vào các yếu tố sau: độ sâu của tổn thương, diện tích vết bỏng, tác nhân gây [...]... vô khuẩn trên đĩa thạch (mm) d: đường kính giếng thạch (mm) 2.3.2 Nghiên cứu tác dụng điều trị tại chỗ của kem EB12 trên bỏng thực nghiệm 2.3.2.1 Triển khai mô hình gây bỏng nhiệt thực nghiệm Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội Gây bỏng nhiệt cho thỏ theo phương pháp đã được Pocidalo J.J (1955) và Hladovec J (1961) mô tả với dụng cụ gây bỏng là... xanh 24 Mốc đen 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU  Nghiên cứu tác dụng ức chế vi khuẩn, vi nấm in vitro của EB12  Nghiên cứu tác dụng điều trị tại chỗ của kem EB12 trên bỏng nhiệt thực nghiệm 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm in vitro của EB12 Phương pháp: đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán trên thạch Nguyên tắc: mẫu thử được cho vào thạch dinh... thực nghiệm Sơ đồ nghiên cứu: Gây bỏng -8 -3 Nuôi ổn định Đo diện tích vết bỏng Lấy mẫu vi khuẩn tại bề mặt vết bỏng 0 7 14 Bôi thuốc Xét nghiệm vi thể 21 Ngày Quan sát, đánh giá đại thể Hình 2.2: Sơ đồ nghiên cứu tác dụng của EB12 trên bỏng nhiệt thực nghiệm 26 Sau khi lựa chọn thời gian gây bỏng thích hợp, gây bỏng cho thỏ như đã mô tả ở mục 2.3.2.1, với thời gian gây bỏng 35 giây, phân thỏ thành 4... nhập cộng đồng… cũng là những gánh nặng mà bỏng để lại [23] 1.1.5 Các thuốc điều trị tại chỗ tổn thương bỏng Điều trị tại chỗ giữ vai trò quan trọng trong quá trình điều trị bỏng Mục đích điều trị tại chỗ là nhằm nhanh chóng loại bỏ mô hoại tử, ức chế sự phát triển của VK, kích thích quá trình biểu mô hóa, hạn chế biến chứng Tùy vào tác dụng, các thuốc điều trị tại chỗ có thể được phân thành các nhóm... dầu sến [14] Trong số các thuốc điều trị tại chỗ vết bỏng, Kem sulfadiazin-bạc 1% (SSD) là thuốc được sử dụng rộng rãi ở nước ta và nhiều nước trên thế giới do có phổ kháng khuẩn rộng, tác dụng lên hầu hết các VK và một số vi nấm gây bệnh [16], [18], [19], [29], [37], [48], [49] Tác dụng của SSD chủ yếu do tác dụng diệt khuẩn của bạc phối hợp với tác dụng kìm khuẩn của sulfadiazin [29], [55] Tuy nhiên,... [60] 1.2.3 Chỉ tiêu đánh giá Các chỉ tiêu đánh giá trong một nghiên cứu tùy thuộc vào nội dung và mục đích nghiên cứu đó Tuy nhiên dựa vào diễn biến sinh lý của bỏng, có thể đánh giá tình trạng tại chỗ của vết thương bỏng thông qua hai nhóm vấn đề chính: (1) quá trình tái tạo tổn thương, (2) mức độ nhiễm khuẩn vết bỏng 1.2.3.1 Đánh giá quá trình tái tạo tổn thương bỏng Có thể đánh giá quá trình tái tạo... HÌNH NGHIÊN CỨU BỎNG Nghiên cứu tác dụng của thuốc trên các mô hình động vật là giai đoạn bắt buộc đối với quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc nói chung cũng như nghiên cứu và phát triển thuốc điều trị bỏng nói riêng Vì vậy, các mô hình thực nghiệm trên động vật có vai trò rất quan trọng Nhiều mô hình nghiên cứu về bỏng đã được phát triển, đề xuất dựa trên nguyên tắc chung là sử dụng tác nhân thích... tạo tổn thương bỏng trên động vật sao cho các tổn thương này có diễn biến sinh lý tương tự trên người [60] Yêu cầu chung của mô hình thực nghiệm nghiên cứu bỏng là tạo ra những tổn thương đồng nhất, kiểm soát được độ sâu vết bỏng, thực hiện trên động vật sẵn có, dụng cụ đơn giản, dễ tiến hành Nội dung của một mô hình nghiên cứu bao gồm: phương pháp tạo tổn thương bỏng và các chỉ tiêu đánh giá 1.2.1 Các... tượng - Bỏng độ I Bỏng mức độ - Bỏng độ II có diện tích nhỏ hơn 15% diện tích cơ thể với nhẹ người lớn và nhỏ hơn 10% với trẻ em - Bỏng độ III với diện tích nhỏ hơn 2% Bỏng mức độ trung bình - Bỏng độ II có diện tích từ 15-25% ở người lớn, từ 10-20% ở trẻ em - Bỏng độ III có diện tích từ 2-10% - Bỏng độ II trên 25% ở người lớn, trên 20% ở trẻ em - Bỏng độ III trên 10% Bỏng mức độ - Bỏng điện nặng - Bỏng. ..4 bỏng, vị trí bỏng trên cơ thể và thể trạng bệnh nhân [21] Cụ thể: 1.1.2.1 Tác nhân gây bỏng Các tác nhân gây bỏng có thể chia thành ba nhóm chính là nhiệt độ, hóa chất và dòng điện [23], [26] Mức độ nặng của tổn thương phụ thuộc vào loại tác nhân và đặc điểm của tác nhân gây bỏng Các tác nhân nhiệt độ như ngọn lửa, các vật rắn nóng, các chất lỏng nóng hoặc khí nóng gây bỏng nhiệt Mức . Đánh giá tác dụng điều trị bỏng của EB12 trên thực nghiệm với 2 mục tiêu sau: 1. Nghiên cứu tác dụng ức chế vi khuẩn, vi nấm in vitro của EB12. 2. Nghiên cứu tác dụng điều trị tại chỗ của. gây bỏng 40 4.2. Về tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm in vitro của EB12 41 4.3. Về tác dụng điều trị tại chỗ của EB12 trên bỏng nhiệt thực nghiệm 43 4.3.1. Tác dụng kháng khuẩn khi điều trị. gây bỏng nhiệt thực nghiệm 29 3.2. Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm in vitro của EB12 31 3.3. Tác dụng điều trị tại chỗ của EB12 trên bỏng nhiệt thực nghiệm 32 3.3.1. Tình trạng chung của thỏ