BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ NGUYỄN QUỲNH ANH GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪSTREPTOMYCES 156.11 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ NGUYỄN QUỲNH ANH GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪSTREPTOMYCES 156.11 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS. Cao Văn Thu Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh và Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thy gio PGS- TS Cao Văn Thu– bộ môn Vi sinh - Sinh học, người đ tn tnh hướng dn tôi t nhng bước đu tiên cho đến khi tôi hoàn thành kha lun này. Tôi xin chân thành cảm ơn cc thy cô gio, cc cn bộ, k thut viên giảng dy, công tc ti Bộ môn Vi sinh - Sinh học, Bộ môn Công Nghiệp Dược trường Đi học Dược Hà Nội, Bộ môn Ha vt liệu - khoa Ha trường Đi học Khoa học tự nhiên Hà Nội đ gip đ tôi trong thời gian làm thực nghiệm. Nhân dp này tôi cng xin gửi lời cảm ơn đến Ban gim hiệu cng toàn th các thy cô gio trường Đi học Dược Hà Nội đ dy d và to mọi điu kiện thun lợi cho tôi trong thời gian tôi học tp ti trường. Và cui cng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đnh và bn b đ động viên , gip đ tôi trong sut thời gian thực hiện kha lun. Do hn chế v thời gian, điu kiện trang thiết b và phương tiện nghiên cứu, kha lun này còn c nhiu thiếu st . Tôi rt mong nhn được sự gp  ca cc thy cô, bn b đ kha lun được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 5năm 2013. Sinh viên Ngô Nguyễn Quỳnh Anh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Đi cương v khng sinh 2 1.1.1.Lch sử nghiên cứu khng sinh 2 1.1.2. Đnh nghĩa khng sinh 2 1.1.3. Phân loi khng sinh 2 1.1.4. Cơ chế tc dụng ca khng sinh 3 1.1.5. Ứng dụng ca khng sinh 4 1.1.6. Sơ đồ tổng qut lên men sản xut kháng sinh 4 1.1.7. Khng sinh chng ung thư 4 1.1.8. Khi niệm v tính khng khng sinh 5 1.2.Đi cương v x khuẩn 5 1.2.1. X khuẩnvà sự hnh thành cht khng sinh t x khuẩn 6 1.2.2. Đặc đim ca x khuẩn chi Streptomyces 6 1.2.3.Phương php phân loi x khuẩn thuộc chi Streptomyces 7 1.3.Tuyn chọn, cải to và bảo quản ging x khuẩn 8 1.3.1.Chọn chng c HTKS cao bằng phép chọn lọc ngu nhiên 8 1.3.2. Đột biến cải to ging 8 1.3.3. Bảo quản ging x khuẩn 8 1.4. Lên men sinh tổng hợp khng sinh 9 1.4.1.Cc phương php lên men 10 1.4.3. Một s yếu t ảnh hưởng đến qu trnh lên men 10 1.5.Chiết tch và tinh chế khng sinh t dch lên men 10 1.5.1.Vai trò ca chiết tch và tinh chế khng sinh 11 1.5.2. Cc phương php chiết tch 11 1.6.Bước đu nghiên cứu cu trúc kháng sinh 11 1.6.1.Phổ tử ngoi - khả kiến 11 1.6.2.Phổ hồng ngoi 11 1.6.3. Phân tích khi phổ 12 1.6.4. Phổ cộng hưởng t ht nhân 12 1.7. Sàng lọc gen hot ha Streptomycesnâng cao hiệu sut sinh tổng hợp khng sinh 12 1.8. Qu trnh tiến ho ca một Dps cảm ứng c tính thm trong chi Streptomyces 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. Nguyên vt liệu và thiết b 14 2.1.1. Nguyên vt liệu 14 2.1.2. My mc thiết b 16 2.2. Nội dung nghiên cứu 17 2.2.1.Chọn lọc, cải to ging 17 2.2.2.Lên men, chiết tch khng sinh ti ưu 17 2.2.3.Sơ bộ xc đnh một s tính cht ca khng sinh thu được 17 2.3. Phương php thực nghiệm 17 2.3.1.Nuôi cy và gi ging x khuẩn 17 2.3.2.Đnh gi hot tính khng sinh bằng phương php khuếch tn 18 2.3.3.Chọn lọc ngu nhiên 18 2.3.4. Đột biến bằng UV 19 2.3.5.Phương php đột biến ha học 20 2.3.6. Lên men chm tổng hợp khng sinh 21 2.3.7. Chiết khng sinh t dch lên men bằng dung môi hu cơ 22 2.3.8. Tch cc thành phn trong khng sinh bằng sắc k lớp mỏng 22 2.3.9.Thu khng sinh thô bằng phương php ct quay 23 2.3.10.Tinh chế khng sinh thô bằng sắc k cột 23 2.3.11. Sơ bộ xc đnh khng sinh tinh khiết thu được 24 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 25 3.1. Kết quả sàng lọc ngu nhiên 25 3.2. Kết quả đột biến cải to ging ln 1 25 3.3. Kết quả đột biến cải to ging ln 2 26 3.4. Kết quả đột biến cải to ging ln 3 27 3.5. Kết quả chọn môi trường lên men chm 28 3.6. Kết quả chọn chng lên men 29 3.7. Kết quả chọn pH chiết 30 3.8. Kết quả sắc k lớp mỏng chọn hệ dung môi 31 3.9. Kết quả tch và tinh chế khng sinh 32 3.9.1. Kết quả sắc k cột ln 1 32 3.9.2. Kết quả sắc k cột ln 2 35 3.10. Kết quả đo nhiệt độ nng chảy, đo phổ ca khng sinh tinh khiết 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ISP International Streptomyces Project (Chương trnh Streptomyces quc tế) B. subtilis Bacillus subtilis P. mirabilis Proteus mirabilis KS Kháng sinh HTKS Hot tính khng sinh MT Môi trường MT2dt Môi trường dch th 2 ATCC American type culture collection (Trung tâm gi ging quc gia M) ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic VSV Vi sinh vt MC Mu chứng SLNN Sàng lọc ngu nhiên ĐB1 Đột biến ln 1 ĐB2 Đột biến ln 2 ĐBHH Đột biến ha học Gr(+) Gram dương Gr(-) Gram âm DMHC Dung môi hu cơ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Cc khng sinh tự nhiên và ứng dụng ca chng Bảng 2: Cc vi khuẩn kim đnh. Bảng 3: Cc môi trường nuôi cy x khuẩn. Bảng 4: Cc môi trường nuôi cy VSV kim đnh. Bảng 5: Các dung môi đ sử dụng. Bảng 6: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngu nhiên. Bảng 7: Kết quả thử HTKS đột biến ln 1. Bảng 8: Kết quả thử HTKS đột biến ln 2. Bảng 9: Kết quả thử HTKS đột biến ln 3. Bảng 10: Kết quả chọn môi trường lên men chm. Bảng 11: Kết quả chọn chng lên men. Bảng 12: Kết quả chọn pH chiết. Bảng 13: Kết quả chọn hệ dung môi chy sắc k(VSV kim đnh P. mirabilis). Bảng 14: Kết quả chy sắc k cột ln 1. Bảng 15: Kết quả sắc k lớp mỏng cc phân đon 1, 2, 3 (VSV kim đnh P. mirabilis). Bảng 16: Kết quả chy sắc k cột ln 2 – nhóm 2. Bảng 17: Kết quả sắc k lớp mỏng sau chy cột nhóm 2 (VSV kim đnh P. mirabilis). Bảng 18: Kết quả chy sắc k cột ln 2 – nhóm 3. Bảng 19: Kết quả sắc k lớp mỏng sau chy cột nhm 3. Bảng 20: Kết quả IR. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hnh 1.1: Khng sinh được pht hiện qua cc năm. Hình 1.2: Sơ đồ cơ chế tc dụng ca cc họ khng sinh chính. Hình 1.3: Sơ đồ tổng qut lên men sản xut khng sinh. Hình 1.4: Hnh ảnh v VSV khng khng sinh. Hình 1.5: Phân loi bộ Actinomycetales. Hình 1.6: Cu trc khuẩn ty x khuẩn. Hình 1.7: Đường cong sinh trưởng pht trin ca x khuẩn. Hình 1.8: Bản đồ v trí DPS trong s 17 nhiễm sắc th Streptomycetales. Hnh 3.9: Kết quả chọn chng lên men chm tt nht Hnh 3.10: Biu đồ kết quả chọn pH chiết với dung môi n - butanol. Hình 3.11: Sắc k cột ln 1 Hình 3.12: Sắc k cột ln 2 - nhóm 2. Hnh 3.13: Sắc k cột ln 2 - nhóm 3. Hình P.14: Khuẩn lc x khuẩn sau 5 - 6 ngày. Hình P.15: Đĩa cy zigzag sau 5 – 6 ngày. Hình P.16: Kết quả thử HTKS đột biến ln 1 bằng phương php khi thch (VSV kim đnh P. mirabilis). Hình P.17: Hnh ảnh sau lên men chm tổng hợp khng sinh chng Streptomyces156.11 Hình P.18: Kết quả thử hot tính khng sinh dch lên men sau lên men chm bằng phương php giếng thch (VSV kim đnh P. mirabilis) Hình P.19: Kết quả hiện hnh vi sinh vt (VSV kim đnh P. mirabilis). Hình P.20: Phổ UV ca khng sinh do Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp. Hình P.21: Phổ IR ca khng sinh do Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp. Hình P.22: Phổ MS ca khng sinh do Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp. [...]... khả năng sinh tổng hợp kháng sinh và từ đó phát hiện hoạt chất mới Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ khuẩn tổng hợp thì có tới 55% là từ Streptomyces Bộ môn Vi sinh – Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội đã nghiên cứu và bước đầu có kết quả với chi xạ khuẩn Streptomyces Chính vì vậy, chúng tôi lựa chọn đề tài: Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nh Streptomyces1 56.11” làm... mục tiêu sau: 1 Nghiên cứu cải tạo giống nâng cao năng suất sinh tổng hợp kháng sinh 2 Lựa chọn môi trường và biến chủng thích hợp cho quá trình lên men 3 Tách chiết và tinh chế để thu được kháng sinh tinh khiết 4 Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh 2 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về kháng sinh 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu kháng sinh Chất kháng sinh (antibiotic) trước đây gọi là chất kháng khuẩn (antimicrobic)... biến hóa học để nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn 2.2.2 Lênmen, chiết tách kháng sinh - Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tốt nhất - Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn biến chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất - Tìm dung môi hữu cơ chiết dịch lọc của dịch lên men và pH chiết tốt nhất - Tìm hệ... hình 1.1) Việc cải tiến trong từng lớp kháng sinh tiếp tục thu được nhiều kháng sinh phổ rộng hơn, hoạt tính kháng vi sinh vật cao hơn, như các kháng sinh họ β – lactam Cùng với việc tìm ra những kháng sinh mới, công nghệ lên men sản xuất kháng sinh cũng ra đời và dần hoàn thiện Con đường tổng hợp và bán tổng hợp cũng dần phát triển Việc phát hiện và phát triển kháng sinh của thế kỷ XX đã làm giảm... về tính kháng kháng sinh Kháng thuốc là hiện tượng vi sinh vật mất đi tính nhạy cảm ban đầu của nó trong một thời gian hay vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh hay hóa trị liệu [22] Hình 1.4: Vi khuẩn kháng kháng sinh Có 2 kiểu kháng thuốc: kháng thuốc tự nhiên và kháng thuốc mới nhận Kháng thuốc tự nhiên là đặc trưng của từng nòi sinh vật nhất định đối với một số kháng sinh nhất định nào đó Kháng thuốc... cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh ở 2°C và định kỳ 3 – 6 tháng cấy lại 1 lần [3] 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của vi sinh vật nhờ sự xúc tác của các enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cho chúng [3] Kháng sinh là sản phẩm trao đổi bậc hai,... ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh nước ta là: một mặt cải tiến các chất kháng sinh cũ và phát triển công nghệ sản xuất kháng sinh, mặt khác phải thúc đẩy việc tìm ra kháng sinh mới Đây là yêu cầu tất yếu và cấp thiết trong công cuộc bảo vệ và chăm sóc sức khỏe nhân dân Trong các phương pháp sản xuất kháng sinh, bên cạnh tổng hợp và bán tổng hợp, phương pháp phân lập kháng sinh từ xạ khuẩn vẫn là con... Lên men: Sau 48h nhân giống, tiến hành lên men trên một số MTdt khác nhau để chọn MT lên men tốt nhất Giống cấp 1 được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa các MT dinh dưỡng với tỷ lệ Vgiống:Vmôi trường = 1:10 Các bình lên men được lắc ở nhiệt độ 28°C ± 0,1°C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 120h Để chọn chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất: giống cấp 1 trên MT2dt được lên men. .. Các kháng sinh chứa nhân thơm (chloramphenicol) 3 Các kháng sinh có cấu trúc aminoglycosid (streptomycin, gentamicin) 4 Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (tetracyclin) 5 Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin) 6 Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin) 7 Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B) 8 Các kháng sinh nhóm antracyclin chống ung thư (daunorubicin) 9 Các kháng sinh. .. hoạt tính kháng sinh được tiến hành tương tự như phương pháp đột biến UV 2.3.6 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh - Nguyên tắc: Sau khi có kết quả xác định được các môi trường nuôi cấy bề mặt tối ưu cho việc sản xuất kháng sinh, sử dụng giống cấp 1 để lên men gián đoạn trong các môi trường lỏng tương ứng - Tiến hành + Tạo giống cấp 1: Chủng giống Streptomyces 156.11 sau khi nuôi cấy trên thạch nghiêng . GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH T STREPTOMYCES 156. 11 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS. Cao Văn Thu Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh và Sinh. Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ NGUYỄN QUỲNH ANH GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH T STREPTOMYCES 156. 11 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 . 8 1.4. Lên men sinh tổng hợp khng sinh 9 1.4.1.Cc phương php lên men 10 1.4.3. Một s yếu t ảnh hưởng đến qu trnh lên men 10 1.5.Chiết tch và tinh chế khng sinh t dch lên men 10