BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VƢƠNG THỊ THẮM GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ Streptomyces 155.16. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VƢƠNG THỊ THẮM GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ Streptomyces 155.16. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn 1. ThS Lê Thị Thu Hương 2. TS Bùi Quang Phúc Nơi thực hiện 1. Bộ môn Vi sinh – Sinh học 2. Viện sốt rét – kí sinh trùng trung ương. HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thạc sỹ Lê Thị Thu Hƣơng, TS Bùi Quang Phúc đã trực tiếp hƣớng dẫn, ân cần chỉ bảo tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo, các cán bộ, kỹ thuật viên đang giảng dạy, công tác tại bộ môn Vi sinh – Sinh học, viện sốt rét – kí sinh trùng trung ƣơng, khoa Hóa – trƣờng Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Hóa học đã tạo điều kiện, giúp đỡ trong thời gian tôi thực hiện khóa luận. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu cùng các thầy cô giáo trong trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập tại trƣờng. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, quan tâm, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Do điều kiện hạn hẹp về thời gian, về phƣơng tiện nghiên cứu và trình độ bản thân còn hạn chế, khóa luận này không tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong nhận đƣợc các ý kiến đóng góp từ thầy cô và bạn bè để khóa luận đƣợc hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20/05/2013 Sinh viên Vƣơng Thị Thắm MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………………1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN…….………………………………………………….2 1.1.Đại cƣơng về kháng sinh.……………………………………………………….2 1.1.1. Định nghĩa kháng sinh ……….………………………………….2 1.1.2. Đặc tính của kháng sinh … 2 1.1.3. Phân loại kháng sinh ……………………………………………….2 1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh…………………………………… 3 1.1.4. Ứng dụng của kháng sinh…………………………………… 3 1.2. Đại cƣơng về xạ khuẩn………………………………………………… …….4 1.2.1. Đặc điểm chung của xạ khuẩn …………………………… ……4 1.2.2. Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptpmyces …………………… …….5 1.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn ……………………………………………………………………… 6 1.3.Tuyển chọn, cải tạo giống và bảo quản giống xạ khuẩn…………………… …7 1.3.1. Mục đích …………………………………………………………7 1.3.2. Chọn chủng có HTKS cao bằng phép sàng lọc ngẫu nhiên …………7 1.3.3. Đột biến cải tạo giống …………………………………… … 7 1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn …………………………………… … 8 1.4.Lên men sinh tổng hợp kháng sinh ………………………………… …… 8 1.4.1. Đại cƣơng …… …………………………… ………………… 8 1.4.2. Các phƣơng pháp lên men ………………………………… …… 9 1.5.Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men ………………………… 10 1.5.1. Lọc và chiết xuất………………………………………………… 10 1.5.2. Tách và tinh chế ……………………………………………… 10 1.6.Bƣớc đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh ………………………………….11 1.6.1. Phổ tử ngoại - khả kiến……………………………… … ……….11 1.6.2. Phổ hồng ngoại ……………………………………………… 11 1.6.3. Phổ khối… ……………………………………………………… 11 1.7.Một số nghiên cứu về Streptomyces và sự sinh tổng hợp kháng sinh… 11 1.7.1. Phân loại, lên men, tinh chế và xác định hoạt tính sinh học của kháng sinh Sparsomycin- đƣợc sản xuất bởi Streptomyces sp.AZ-NIOFD1 ……11 1.7.2. Phân lập, định tên và tối ƣu hóa quá trình sản xuất kháng sinh từ xạ khuẩn Streptomyces phân lập từ đất vùng Wady El Natron- Ai Cập ……12 CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………… 14 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ……………………………………………… 14 2.1.1. Chủng xạ khuẩn… ……………………………………………… 14 2.1.2. Chủng vi sinh vật kiểm định ………………………………….14 2.1.3. Môi trƣờng ……………………………………………………… 14 2.1.4. Dung môi ……………………………………………………… 15 2.1.5. Vật liệu chạy sắc ký: …………………………………………16 2.1.6. Máy móc thiết bị ……………………………………………… 16 2.2. Nội dung nghiên cứu ……………………………………………………… 17 2.2.1. Chọn lọc, cải tạo giống …………………………………………17 2.2.2. Lên men, chiết tách kháng sinh tối thích ………………………… 17 2.2.3. Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu đƣợc ……17 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ……………………………………………… 18 2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn trong ống nghiệm… ……………18 2.3.2. Phƣơng pháp sàng lọc ngẫu nhiên ………………………………… 18 2.3.3 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phƣơng pháp khuếch tán … 18 2.3.4. Đột biến bằng ánh sáng UV…… …………………………… … 19 2.3.4. Phƣơng pháp đột biến hóa học ………………………………….20 2.3.5. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh ………………………… 21 2.3.6. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ ……21 2.3.7. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng…… 22 2.3.8. Thu kháng sinh thô bằng phƣơng pháp cất quay …………… …23 2.3.9. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột ………………………… 23 2.3.10. Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu đƣợc……………………23 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT ………………… 24 3.1.Nghiên cứu cải tạo giống và lên men sinh tổng hợp kháng sinh …………….24 3.1.1. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên ………………………………….24 3.1.2. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 ………………………… 25 3.1.3. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 ………………………… 26 3.1.4. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 3 ………………………… 27 3.1.5. Kết quả chọn môi trƣờng lên men chìm ………………………… 28 3.1.6 Kết quả chọn chủng lên men ………………………………….28 3.2. Chiết tách, tinh chế kháng sinh. …………………………………………29 3.2.1. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi… ………………… 29 3.2.2. Kết quả tinh chế kháng sinh bằng SK cột…… ……………………29 3.3 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết … ………34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ……………………………………………… 36 KẾT LUẬN ………………………………………………………………………36 ĐỀ XUẤT ………………………………………………………………………37 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ATCC American Type Culture Collection ADN Acid 2’-deoxyribonucleic BLAST Basic Local Alignment Search Tool CFU Colony Forming Unit DM Dung môi ĐB Đột biến ĐBHH Đột biến hóa học HTKS Hoạt tính kháng sinh IR Infrared ( hồng ngoại ) ISP International Streptomyces Project KS Kháng sinh MS Mass Spectroscopy MT Môi trƣờng MTdt Môi trƣờng dịch thể MW Moleculer Weight NMR Nuclear magnetic resonance rRNA ribosome Ribonucleic Acid SK Sắc kí SKLM Sắc kí lớp mỏng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên T 0 n/c Nhiệt độ nóng chảy UV Ultra violet ( tử ngoại) VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định Bảng 2.2: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn Bảng 2.3: Các dung môi sử dụng trong nghiên cứu Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sau sàng lọc ngẫu nhiên Bảng 3.2: Kết quả thử HTKS sau đột biến lần 1 Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS sau đột biến lần 2 Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS sau đột biến lần 3 Bảng 3.5: Kết quả chọn môi trƣờng lên men chìm Bảng 3.6: Kết quả chọn chủng lên men Bảng 3.7: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký Bảng 3.8: Kết quả thử nghiệm sau sắc kí cột lần 1 . Bảng 3.9: Kết quả thử nghiệm sau sắc kí cột lần 2(cho hỗn hợp 1) Bảng 3.10: Kết quả thử nghiệm sau sắc kí cột lần 2(cho hỗn hợp 2) Bảng 3.11: Kết quả thử nghiệm sau sắc kí cột lần 3 Bảng 3.12: Kết quả dự đoán từ phổ MS Bảng 3.13 : Kết quả IR DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ PHỤ LỤC Hình 1.1 : Sơ đồ phân loại xạ khuẩn. Hình 1.2 : Các loại khuẩn ti ở xạ khuẩn. Hình P1: Kết quả thử HTKS các biến chủng sau ĐBHH bằng phƣơng pháp khối thạch (VSV kiểm định : S. flexneri). Hình P2: Kết quả thử HTKS của dịch lên men bằng phƣơng pháp giếng thạch (VSV kiểm định : S. flexneri). Hình P3: Kết quả thử HTKS các phân đoạn chạy sắc ký cột lần 1 bằng phƣơng pháp khoanh giấy lọc. Phụ lục 1 : Phổ UV- VIS của kháng sinh. Phụ lục 2: Phổ IR của kháng sinh. Phụ lục 3: Phổ MS của kháng sinh. . - 1 - ĐẶT VẤN ĐỀ Bước sang thế kỷ 21, con người vẫn tiếp tục phải đối mặt với nguy cơ tử vong cao đến từ các bệnh nhiễm khuẩn. Việc kiểm soát các bệnh này vấp phải những tác động bất lợi do tình trạng kháng kháng sinh ngày càng tăng, đặc biệt ở các quốc gia đang phát triển. Nhu cầu về việc tìm ra loại thuốc kháng sinh mới với phổ tác dụng rộng, độ an toàn cao, có thể làm giảm chi phí y tế, vẫn luôn là mối quan tâm của cả cộng đồng. Tuy nhiên việc nghiên cứu này đang bị bỏ ngỏ, thậm chí bởi cả các hãng dược phẩm lớn do vấn đề về kinh phí. Do đó đặt ra yêu cầu tìm ra loại kháng sinh mới tận dụng các nguồn lực sẵn có để chi phí sản suất là thấp nhất. Thực tế, có khoảng trên 80% số kháng sinh đang sử dụng được sinh tổng hợp từ xạ khuẩn, trong đó 55% do chi Streptomyces tạo ra; 50% trong số 20 000 chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học được sản xuất từ xạ khuẩn có nguồn gốc từ đất. Trong đó được phân lập dễ nhất từ đất là chi xạ khuẩn Streptomyces. Từ những nghiên cứu ban đầu cho thấy, chủng xạ khuẩn Streptomyces 155.16 do bộ môn Vi sinh – Sinh học – trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp, cho kháng sinh có hoạt tính mạnh, ổn định, có nhiều tiềm năng trong thực tế, nên chúng tôi lựa chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 155.16”. Khóa luận mong muốn đạt những mục tiêu sau đây: 1. Nâng cao được hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh thông qua chọn lọc cải tạo giống. 2. Xác định được các điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh với hiệu suất cao, chi phí thấp. 3. Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh thu được. [...]... Chọn MT lên men chìm tốt nhất - Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn biến chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất - Lọc, chiết kháng sinh từ dịch lọc, dịch lên men - Tìm hệ dung môi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất - Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ 2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh. .. lượng sinh khối, định lượng kháng sinh sinh ra Kết quả : nguồn C tốt nhất là tinh bột, nguồn N tốt nhất là từ KNO3, Ca(NO3)2, (NH4)2SO4, nguồn P : sử dụng HPO42- là tốt nhất pH cũng ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp kháng sinh, pH thích hợp xác định được theo nghiên cứu là 7,6 Thời gian nuôi cấy: Streptomyces plicatus sinh kháng sinh tối đa sau 3 ngày nuôi cấy Nồng độ oxi cũng ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng. .. khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh và định kỳ 3-6 tháng cấy lại 1 lần[9,11] 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.4.1 Đại cƣơng Lên men là quá trình phân giải hydrocarbon trong điều kiện thích hợp (hiếu khí hay kị khí) và kháng sinh là một trong những sản phẩm quan trọng của quá trình lên men sử dụng xạ khuẩn Cụ thể hơn, kháng sinh là sản phẩm trao đổi... loại theo ISP, xác định được tên của 4 loại xạ khuẩn sinh kháng sinh có hoạt tính cao, bao gồm : Streptomyces coelicolor, Streptomyces flaveous, Streptomyces plicatus, Streptomyces griseo yamaguchi Thử hoạt tính của kháng sinh sinh tổng hợp bởi các xạ khuẩn này trên vi khuẩn Gram(+), Gram(-), nấm Chọn môi trường thích hợp cho sự sinh tổng hợp kháng sinh : xạ khuẩn được nuôi cấy trên các môi trường khác... thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid.[5,6,22] 1.2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn - Nhiệt độ : nhiệt độ tối thích cho sự sinh tổng hợp kháng sinh là từ 18 – 280C.[27] - pH môi trường : thường là trung tính, môi trường quá acid hay kiềm đều ức chế tổng hợp kháng sinh. [13]... nghiên cứu về Streptomyces và sự sinh tổng hợp kháng sinh 1.7.1 Phân loại, lên men, tinh chế và xác định hoạt tính sinh học của kháng sinh Sparsomycin- đƣợc sản xuất bởi Streptomyces sp.AZ-NIOFD1.[16] Năm chủng xạ khuẩn được phân lập từ nước sông Nile - Ai Cập, được sàng lọc trên môi trường nitrate- tinh bột ở 300C trong 5 ngày, từ đó chọn ra chủng có khả năng sản xuất chất kháng sinh có phổ rộng - Streptomyces. .. Các kháng sinh chứa nhân thơm (chloramphenicol) - Các kháng sinh có cấu trúc aminoglycosid (streptomycin, gentamicin) - Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (tetracyclin) - Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin) - Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin) - Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B) - Các kháng sinh nhóm antracyclin chống ung thư (daunorubicin) - Các kháng sinh. .. TỔNG QUAN 1.1 Đại cƣơng về kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay các nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật, …) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp.[9] Kháng sinh là sản phẩm trao đổi thứ cấp, chỉ được sinh. .. Vì vậy để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cần tạo điều kiện phát triển thích hợp nhất cho VSV 1.1.3 Phân loại kháng sinh: -3- Có nhiều cách phân loại kháng sinh: theo nguồn gốc, theo tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh, theo cơ chế tác dụng, theo cấu trúc hóa học… Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất, bao gồm:[8,9,14] - Các kháng sinh có cấu trúc β-lactam (penicillin,... quá trình lên men, việc bổ sung thêm MT dinh dưỡng và rút bớt dịch lên men không được thực hiện liên tục mà định kỳ sau những khoảng thời gian nhất định - 10 - 1.5 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men Kết thúc quá trình lên men, KS có thể nằm trong sinh khối hoặc trong dịch lên men cùng với nhiều chất phụ, tạp chất Do đó cần thực hiện chiết tách, tinh chế để thu được kháng sinh đạt tiêu . đề tài: Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 155. 16”. Khóa luận mong muốn đạt những mục tiêu sau đây: 1. Nâng cao được hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh thông qua. GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ Streptomyces 155. 16. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VƢƠNG THỊ THẮM GÓP PHẦN. 1.7.Một số nghiên cứu về Streptomyces và sự sinh tổng hợp kháng sinh 11 1.7.1. Phân loại, lên men, tinh chế và xác định hoạt tính sinh học của kháng sinh Sparsomycin- đƣợc sản xuất bởi Streptomyces