B Y T TRƯNG ĐI HC DƯC H NI LÊ THỊ NGC HIỆP GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MENTNG HP KHNG SINH TỪSTREPTOMYCES 119.112 KHÓA LUN TT NGHIỆP DƯC S H NI-2013 B Y T TRƯNG ĐI HC DƯC H NI LÊ THỊ NGC HIỆP GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TNG HP KHNG SINH TỪ STREPTOMYCES 119.112 KHÓA LUN TT NGHIỆP DƯC S Ngưi hưng dn: Ths. Võ Thị Thu Thủy Nơi thc hin: B môn Vi sinh& Sinh hc Trưng Đại hc Dưc H Ni H NI-2013 LI CẢM ƠN Tôi xin gi li cm ơn sâu sc nhất đn cô gio Ths. Võ Thị Thu Thủy ngưi đ tn tnh hưng dn tôi t nhng bưc đu tiên cho đn khi tôi hon thin kha lun ny. Tôi xin chân thnh cm ơn cc thy cô giáo, cc cn b, k thut viên ging dy, công tc ti B môn Vi sinh - Sinh hc , B môn Công nghip dưc trưng Đi hc Dưc H Ni , B môn Ha vt liu - khoa Ha trưng Đi hc Khoa hc tự nhiên H Ni đ gip đ tôi trong thi gian lm thực nghim. Nhân dịp ny tôi cng xin gi li cm ơn đn Ban gim hiu cng ton th cc thy cô gio trưng Đi hc Dưc H Ni đ dy d v to mi điu kin thun li cho tôi trong thi gian tôi hc tp ti trưng. V cui cng l li cm ơn tôi gi ti gia đnh v bn b đ đng viên , gip đ tôi trong sut thi gian thực hin kha lun. Do thi gian lm thực nghim cng như kin thc của bn thân c hn , khóa lun ny cn c nhiu thiu st . Tôi rất mong nhn đưc sự gp  của cc thy cô , bn b đ kha lun đưc hon thin hơn. Tôi xin chân thnh cm ơn! H Ni, ngày 10, tháng 5, năm 2013. Sinh viên LÊ THỊ NGỌC HIỆP MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TNG QUAN 2 1.1. Đi cương v khng sinh 2 1.1.1. Định nghĩa khng sinh 2 1.1.2. Phân loi khng sinh 2 1.1.3. Cơ ch tc dụng của khng sinh 3 1.2.Đi cương v x khuẩn 3 1.2.1. Đặc đim hnh thi của x khuẩn 4 1.2.2. Đặc đim của x khuẩn chi Streptomyces 5 1.3. Sơ đồ tổng qut sinh tổng hp khng sinh……………………………………….…6 1.4.Tuyn chn, ci to v bo qun ging x khuẩn 6 1.4.1. Mục đích 7 1.4.2. Chn chủng c HTKS cao bằng sng lc ngu nhiên 7 1.4.3. Đt bin ci to ging…. 7 1.4.4. Bo qun ging x khuẩn …………………………………………………… 8 1.5. Lên men sinh tổng hp khng sinh 8 1.5.1. Cc phương php lên men 9 1.5.2. Mt s yu t nh hưởng đn qu trnh lên men 10 1.6. Chit tch v tinh ch khng sinh t dịch lên men 10 1.6.1. Vai tr của chit tch v tinh ch khng sinh 10 1.6.2. Cc phương php chit tch 11 1.7.Bưc đu nghiên cu cấu trc khng sinh 12 1.7.1. Phổ t ngoi - kh kin 12 1.7.2. Phổ hồng ngoi 12 1.7.3. Khi phổ 13 1.8. Mt s nghiên cu liên quan…………………………………………………… 13 1.8.1. So sánh glucose và glycerol làm nguồn carbon cho sn xuất ε-poly- L-Lysin tStreptomyces sp. M-Z18………………………………………………………… 13 1.8.2. Tinh ch i lực Phosphoprotein xc định các protein tham gia vào S- adenosyl-L-methionine lm tăng cưng sn xuất khng sinh trong Streptomycescoelicolor……………………………………………………………… 14 1.8.3. Xc định định hot tính sinh hc của mt nhm gồm 51 macrolide bằng cch kích hot enzyme tổng hp polyketide trong Streptomyces ambofaciens……… 14 CHƯƠNG 2: ĐI TƯNG V PHƯƠNG PHP NGHIÊN CỨU 16 2.1. Nguyên vt liu v thit bị 16 2.1.1. Nguyên vt liu 16 2.1.2. My mc thit bị 18 2.2. Ni dung nghiên cu 18 2.2.1. Chn lc, ci to ging 18 2.2.2. Lên men, chit tch khng sinh ti ưu 18 2.2.3. Sơ b xc định mt s tính chất của khng sinh thu đưc 19 2.3. Phương php thực nghim 19 2.3.1. Nuôi cấy v gi ging x khuẩn 19 2.3.2. Đnh gi hot tính khng sinh bằng phương php khuch tn 19 2.3.3. Chn lc ngu nhiên 20 2.3.4. Đt bin ……………………… 21 2.3.5. Lên men chm tổng hp khng sinh 22 2.3.6. Chit khng sinh t dịch lên men bằng dung môi hu cơ 23 2.3.7. Tch cc thnh phn trong khng sinh bằng sc k lp mỏng 23 2.3.8. Thu kháng sinh thô bằng phương php cất quay 24 2.3.9. Tinh ch khng sinh thô bằng sc k ct 24 2.3.10. Phương php xc định khng sinh tinh khit thu đưc 25 CHƯƠNG 3: KT QUẢ THỰC NGHIỆM V NHN XÉT 26 3.1. Kt qu sng lc ngu nhiên 26 3.2. Kt qu đt bin ci to ging ln 1 27 3.3. Kt qu đt bin ci to ging ln 2 27 3.4. Kt qu đt bin ha hc bằng HNO 2 28 3.5. Kt qu chn môi trưng lên men chm 29 3.6. Kt qu chn chủng lên men 30 3.7. Kt qu chn dung môi v pH chit 30 3.8. Kt qu sc k lp mỏng chn h dung môi 31 3.9. Kt qu sc kí ct………………… 32 3.9.1. Kt qu sc k ct ln 1 32 3.9.2. Kt qu sc k ct ln 2 34 3.9.3. Kt qu sc k ct ln 3 36 3.10. Kt qu đo nhit đ nng chy, đo phổ của khng sinh tinh khit 39 KT LUN V KIN NGHỊ 41 DANH MỤC CC KÝ HIỆU, CC CHỮ VIT TẮT ISP International Streptomyces Project (Chương trnh Streptomyces quc t) ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic ATCC 6633 Trung tâm gi ging Hoa Kỳ BV 108 Bnh vin 108 B.subtilis Bacillussubtilis ATCC 6633 ĐB1 Đt bin ln 1 ĐB2 Đt bin ln 2 ĐBHH Đt bin ha hc G(+) Gram dương G(-) Gram âm HTKS Hot tính khng sinh MC Mu chng MT Môi trưng MT1dt Môi trưng dịch th 1 MT2dt Môi trưng dịch th 2 MT6dt Môi trưng dịch th 6 P. mirabilis Proteus mirabilis BV 108 SLNN Sng lc ngu nhiên VSV Vi sinh vt DANH MỤC CC BẢNG Bng 1: Cc vi khuẩn kim định Bng 2: Cc MT nuôi cấy x khuẩn Bng 3: Cc MT nuôi cấy VSV kim định Bng 4: Cc dung môi đ s dụng Bng 5: Kt qu th HTKS sng hc ngu nhiên Bng 6: Kt qu th HTKS đt bin ln 1 Bng 7: Kt qu th HTKS đt bin ln 2 Bng 8: Kt qu th HTKS đt bin ha hc Bng 9: Kt qu chn môi trưng lên men chm Bng 10: Kt qu chn chủng lên men Bng 11: Kt qu chn dung môi v pH chit Bng 12: Kt qu SKLM chn h dung môi Bng 13: Kt qu th HTKS cc phân đon sau chy sc k ln 1 Bng 14: Kt qu SKLM sau chy ct ln 1 Bng 15: Kt qu th HTKS cc phân đon sau chy sc k ln 2 Bng 16: Kt qu SKLM cc phân đon sau chy ct ln 2 Bng 17: Kt qu th HTKS nhm 2 sau chy ct Bng 18: Kt qu SKLM nhm 2 sau chy ct Bng 19: Kt qu th HTKS nhm 3 sau chy ct Bng 20: Kt qu SKLM nhm 3 sau chy ct Bng 21: Kt qu IR DANH MỤC CC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hnh 1: Sơ đồ cơ ch tc dụng của cc h khng sinh chính Hnh 2: Sơ b phân loi x khuẩn Hnh 3: Cc khuẩn ty ở x khuẩn Hnh 4: Sơ đồ tổng qut lên men sn xuất khng sinh Hnh 5: Đưng cong sinh trưởng pht trin x khuẩn Hnh 6: Pic sc k ct ln 1 Hnh 7: Pic sc k ct ln 2 Hnh 8: Pic sc k ct ln 3 nhm 2 Hnh 9: Pic sc k ct ln 3 nhm 3 Hnh PL1: X khuẩn giai đon pht trin 5-6 ngày Hnh PL2: Kt qu đt bin bằng nh sng UV Hnh PL3: Th HTKS bằng phương php khi thch(P. mirabilis) Hnh PL4: Th HTKS bằng phương php ging thch (B. subtilis) Hnh PL5: Th HTKS bằng phương php khoanh giấy lc(B. subtilis) Hình PL6: Kt qu chn MT lên men chìm Hnh PL7: Kt qu chn chủng lên men Hnh PL8: Kt qu SKLM sau chy ct ln 1 Hnh PL9: Kt qu chy sc k ct Hnh PL10: Kt qu đo phổ UV của khng sinh Hnh PL11: Kt qu đo phổ IR của khng sinh Hnh PL12: Kt qu đo phổ khi của khng sinh 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Vic khm ph v pht trin cc khng sinh đ to ra cc th lực v khí hu hiu gip con ngưi chng li vi khuẩn. Phm vi điu trị của khng sinh hin nay không chỉ dng li ở cc bnh nhiễm khuẩn, m khng sinh cn đưc dng ngy mt nhiu đ điu trị ung thư. Tuy nhiên, vic nghiên cu pht trin khng sinh mi đang c xu hưng gim theo thi gian. Trong khi đ, mô hnh cc bnh nhiễm khuẩn ngy cng đa dng, vic s dụng khng sinh ngy mt trn lan, tnh hnh khng khng sinh ngy cng gia tăng v đang l mi lo ngi ton cu. Hin trng đ đang l ting chuông cnh bo, con ngưi sẽ thua trong cuc chin chng vi khuẩn. V vy, đẩy mnh nghiên cu, sn xuất cc khng sinh c hiu qu điu trị cao, đc tính thấp v ít bị khng thuc l mt yêu cu tất yu v cấp thit trong công cuc bo v v chăm sc sc khỏe ngưi dân. Trong tất c cc khng sinh đưc bit đn hin nay th c khong 55% c nguồn gc t x khuẩn v 60% trong s đ thuc chi Streptomyces. Đ l cơ sở đ cc nh khoa hc nưc ta hin nay tp trung nghiên cu vo chi x khuẩn ny. Chính v vy, em chn đ ti: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hp kháng sinh từ Streptomyces 119.112” lm kha lun tt nghip. Chủng Streptomyces 119.112 do B môn Vi sinh – Sinh hc trưng đi hc Dưc H Ni phân lp v cung cấp. Kha lun mong mun đt đưc cc mục tiêu sau đây: - Nâng cao hiu suất sinh tổng hp khng sinh t chủng Streptomyces 119.112bằng sng lc ngu nhiên v đt bin ci to ging. - Lựa chn môi trưng v bin chủng thích hp cho qu trnh lên men. - Chit tch v tinh ch khng sinh thu đưc. - Tng bưc xc định đnh gi tính chất vt l v cấu trc ha hc của khng sinh do chủng Streptomyces 119.112. [...]... pháp giếng thạch • Chọn chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất: giống cấp 1 của các biến chủng trên MT1dt được lên men trên môi trường tối thích cho việc sinh tổng hợp kháng sinh, thử hoạt tính dịch lọc bằng phương pháp giếng thạch , sau đó lựa chọn chủng cho dịch lên men có HTKS tốt nhất 2.3.6 Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ  Mục đích: Xác định... ưu  Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tốt nhất  Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn biến chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất  Tìm dung môi hữu cơ chiết dịch lọc của dịch lên men và pH chiết tốt nhất  Tìm hệ dung môi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất  Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết... trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh 2°C và định kỳ 3-6 tháng cấy lại 1 lần [9], [13] 1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của vi sinh vật nhờ sự xúc tác của các enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cho chúng Kháng sinh là một trong những sản phẩm của quá trình lên men xạ khuẩn... tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid 1.3 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh 7 Giống truyền ủ trong phòng thí nghiệm Bình nhân giống trong phòng thí nghiệm Bình nhân giống trên thiết bị nhân giống Bình lên men tạo kháng sinh Dịch lên men Sinh khối Dịch lọc Sinh khối thô Dịch chiết kháng sinh Dịch chiết sinh khối Dịch chiết đậm đặc Sản phẩm tinh chế Sản phẩm...  Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (tetracyclin)  Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin)  Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin)  Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B)  Các kháng sinh nhóm antracyclin chống ung thư (daunorubicin) 3  Các kháng sinh nhóm actinomycin chống ung thư (dactinomycin D) 1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh Cơ chế tác dụng lên vi sinh vật... dung nghiên cứu Để đạt được các mục tiêu ban đầu của đề tài, chúng tôi tiến hành các nội dung nghiên cứu cụ thể như sau: 2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống  Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn 3 dạng chủng có HTKS cao nhất 20  Đột biến bằng ánh sáng UV từ 1 đến 2 lần để nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn gốc  Đột biến hóa học 2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh tối ưu  Từ. .. lên men liên tục 11 - Lên men mẻ (lên men có chu kỳ): VSV được nuôi cố định trong bình lên men với 1 thể tích MT xác định VSV phát triển theo giai đoạn và tạo ra sản phẩm Kết thúc quá trình, người ta thu lấy sản phẩm - Lên men có bổ sung: trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên Do đó, nâng sao hiệu quả sử dụng bình lên men - Lên men. .. cho sinh tổng hợp chất mong muốn [13] 1.6 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 1.6.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh 12 Đây là giai đoạn có vai trò rất quan trọng bởi vì sản phẩm thu được sau quá trình lên men thường không bền vững, hàm lượng kháng sinh trong dịch lên men thường thấp Do đó, cần tách riêng kháng sinh khỏi các tạp chất khác và tinh chế sản phẩm đạt được các tiêu... CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay các nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật, …) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp [9], [15] Cần phân biệt một số chất cũng do vi sinh. .. gây bệnh của mỗi chất kháng sinh thường mang đặc điểm riêng, tùy thuộc vào bản chất của kháng sinh đó.[16] Hình 1 giới thiệu sơ đồ cơ chế tác dụng của các họ kháng sinh chính Hình 1: Sơ đồ cơ chế tác dụng của các họ kháng sinh chính  Ức chế quá trình tổng hợp vách TB vi khuẩn: -lactam, nhóm Glycopeptid  Tác động lên tổng hợp protein của vi khuẩn: tetracycline, aminoglycosid (lên tiểu đơn vị 30S), . vy, em chn đ ti: Góp phần nghiên cứu lên men tổng hp kháng sinh từ Streptomyces 119. 112 lm kha lun tt nghip. Chủng Streptomyces 119. 112 do B môn Vi sinh – Sinh hc trưng đi hc. GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TNG HP KHNG SINH TỪ STREPTOMYCES 119. 112 KHÓA LUN TT NGHIỆP DƯC S Ngưi hưng dn: Ths. Võ Thị Thu Thủy Nơi thc hin: B môn Vi sinh& amp; Sinh. trnh lên men cao. • Nhưc đim: Đu tư trang thit bị k thut ban đu ln. • Cc phương php lên men chm: Lên men mẻ, lên men c bổ sung, lên men bn liên tục, lên men liên tục. 11 - Lên