BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN HUY TRÌNH GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 155.21 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Hà Nội, 05/2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN HUY TRÌNH GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 155.21 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Cao Văn Thu Nơi thực hiện : Bộ môn Vi Sinh – Sinh Học Trường Đại Học Dược Hà Nội Hà Nội, 05/2013 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gi li cm ơn sâu sc nht đn thy gio PGS -TS Cao Văn Thu - ngưi đ tn tnh hưng dn tôi t nhng bưc đu tiên cho đn khi tôi hon thin kha lun ny. Tôi xin chân thnh cm ơn cc thy cô gio , cc cn b, k thut viên ging dy, công tc ti B môn Vi sinh - Sinh hc, B môn Công nghip dưc trưng Đi hc Dưc H Ni , B môn Hóa vt liu - khoa Ha trưng Đi hc Khoa hc tự nhiên Hà Ni đ gip đ tôi trong thi gian lm thực nghim. Nhân dp ny tôi cng xin gi li cm ơn đn Ban gim hiu cng ton th cc thy cô gio trưng Đi hc Dưc H Ni đ dy d v to mi điu kin thun li cho tôi trong thi gian tôi hc tp ti trưng. V cui cng l li cm ơn tôi gi ti gia đnh v bn b đ đng viên , giúp đ tôi trong sut thi gian thực hin kha lun. Do thi gian lm thực nghim cng như kin thc ca bn thâ n còn c hn, kha lun ny cn c nhiu thiu st. Tôi rt mong nhn đưc sự gp  ca cc thy cô, bn b đ kha lun đưc hon thin hơn. Tôi xin chân thnh cm ơn! H Ni, ngày 16, tháng 5, năm 2013. Sinh viên NGUYỄN HUY TRÌNH MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Đi cương v kháng sinh 2 1.1.1. Đnh ngha khng sinh 2 1.1.2. Phân loi khng sinh 2 1.1.3. Sơ đ tng qut sản xuất kháng sinh 3 1.1.4. ng dng ca khng sinh 4 1.2. Đi cương v x khun (Actinomycetes) 4 1.2.1. Đc đim hnh thi x khun 5 1.2.2. Đc đim cấu to t bo x khun 5 1.2.3. Phân loi x khun 6 1.3. Phương php phân lp vi sinh vt sinh khng sinh 6 1.4. Tuyn chn, ci to, bo qun ging x khun 7 1.4.1. Chn chng c hot tnh cao nhờ sng lc ngu nhiên 7 1.4.2. Đt bin cải to ging 7 1.4.3. Bảo quản ging x khun 8 1.5. Lên men sinh tng hp kháng sinh 8 1.6. Chit tách v tinh ch sn phm 9 1.7. Một s phương pháp ph đ xác định cấu trúc kháng sinh 10 1.7.1. Ph hng ngoi (IR) 10 1.7.2. Ph tử ngoi (UV) 10 1.7.3. Khi ph (MS) 11 1.8. Một s nghiên cứu liên quan 11 1.8.1. Ti ưu ha thng kê ca qu trnh lên men đ tăng cường hot tính kháng sinh ca Streptomyces sp.CS392. 11 1.8.2. Mt chng Streptomyces sp với nhiều đc đim mới hứa hẹn thúc đy sự phát trin cúa nông nghiệp dch bệnh. 12 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1. Nguyên vt liệu, thit bị 13 2.1.1. Nguyên vt liệu 13 2.1.2. Máy móc, thit b, dng c 15 2.2. Nội dung nghiên cứu 15 2.3. Phương pháp thực nghiệm 16 2.3.1. Phương php nuôi cấy v gi ging 16 2.3.2. Đnh gi hot tnh khng sinh bng phương php khuch tn 16 2.3.3. Phương php xc đnh môi trường nuôi cấy thch hp 17 2.3.4. Phương php chn chng c hot tnh cao bng sng lc ngu nhiên 17 2.3.5. Phương php đt bin 18 2.3.6. Phương php lên men mẻ 19 2.3.7. Phương php xc đnh đ bền nhiệt, bền pH ca khng sinh trong dch lên men 20 2.3.8. Phương php chit khng sinh t dch lc bng dung môi hu cơ 20 2.3.9. Phương php tch khng sinh bng sc k 20 2.3.10. Phương php thu tinh th khng sinh tinh khit 22 2.3.11. Phương php xc đnh cấu trúc khng sinh tinh khit thu đưc 22 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 23 3.1. Kt qu quá trnh chn lc ngẫu nhiên 23 3.2. Kt qu đột bin ci to ging ln 1 24 3.3. Kt qu đột bin ci to ging ln 2 25 3.4.Kt qu ci to ging ln 3 bằng tác nhân hóa hc 27 3.5. Kt qu lên men sinh tng hp kháng sinh 28 3.6. Kt qu đánh giá nh hưởng của pH v nhiệt độ đn độ bn của kháng sinh trong dịch lc 30 3.7. Kt qu chn dung môi chit xuất kháng sinh 31 3.8. Kt qu sắc ký lớp mỏng chn hệ dung môi 32 3.9. Kt qu sắc ký cột 33 3.10. Kt qu đo nhiệt độ nóng chy v sơ bộ xác định các nhóm chức đặc trưng của kháng sinh thu đưc 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid 2’- deoxyribonucleic CLNN Chn lc ngu nhiên CW Thành t bào - Cell wall DMHC Dung môi hu cơ ĐB Đt bin Gr Gram IR Hồng ngoi - Infrared KH Khoa hc KS Kháng sinh L-DAP L - diaminopimelat MTdt Môi trưng dch th MTth Môi trưng thích hp TB T bào TĐC Trao đổi cht VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vt UV T ngoi – Ultraviolet B. subtilis Bacillus subtilis P. mirabilis Proteus mirabilis G(+) Gram dương G(-) Gram âm SK Sc ký DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH Bng 1: Phân loi cc cht khng sinh dựa theo cu trc ha hc. Bng 2: Cc môi trưng nuôi cy x khuẩn. Bng 3: Cc môi trưng kim đnh. Bng 4: Cc dung môi đ s dụng. Bng 5: Kt qu chn lc ngu nhiên Streptomyces 155.21. Bng 6: Kt qu hot tính KS sau đt bin UV ln 1. Bng 7: Kt qu hot tính KS sau đt bin UV ln 2. Bng 8:Kt qu hot tính KS sau đt bin ha hc. Bng 9: Kt qu chn môi trưng lên men. Bng 10: Kt qu lên men ca cc dng chng, bin chng trên MT2dt. Bng 11: Ảnh hưởng ca nhit đ đn đ bn ca khng sinh trong dch lc. Bng 12: Ảnh hưởng ca pH đn đ bn ca KS sau 1 ngy v sau 5 ngy. Bng 13: Kt qu chit khng sinh bằng 4 DMHC ở 5 pH khc nhau. Bng 14: Kt qu SK lp mỏng chn h dung môi (hin hnh VSV bằng P. mirabilis) Bng 15: Kt qu th hot tính KS ca cc phân đon sau chy ct ln 1. Bng 16: Kt qu SK lp mỏng cc phân đon 1-15 (hin hnh bằng P. mirabilis) Bng 17: Kt qu th hot tính KS ca cc phân đon sau chy ct ln 2. Bng 18: Kt qu SK lp mỏng cc phân đon 1-15 (hin hnh bằng P. mirabilis) Bng 19: Kt qu th hot tính KS ca cc phân đon sau chy ct ln 3. Bng 20: Kt qu SK lp mỏng cc phân đon 1-10 (hin hnh bằng P. mirabilis) Bng 21: Kt qu th hot tính khng sinh sau chy ct ln 4. Bng 22: Kt qu SK lp mỏng cc phân đon t 1-4 ( hin hnh bằng P.mirabilis). Hình 1: Sơ đồ tổng qut sinh tổng hp khng sinh. PHỤ LỤC Phụ lục 1: Bin chng Streptomyces 155.21 đưc cy zizag trên ng thch nghiêng vo đĩa Petri cho vào t m v đĩa Petri cha bin chng Streptomyces 155.21 sau 6 ngày nuôi cy trong t m. Phụ lục 2: Kt qu th hot tính kháng sinh bằng phương php khi thch và phương php ging thch. Phụ lục 3: Bnh lên men đưc đặt trong máy lc khi bt đu quá trình nhân ging cp 1, bình nhân ging cp 1 và bình cha sn phẩm lên men khi kt thúc quá trình lên men. Phụ lục 4: Ct sc ký trong quá trình chy ct ln 1 và kt qu th hot tính kháng sinh sau quá trình chy ct. Phụ lục 5: Phổ MS cht kháng sinh KS1 phân lp đưc. Phụ lục 6: Phổ UV cht kháng sinh KS1 phân lp đưc. Phụ lục 7: Phổ IR cht kháng sinh KS1 phân lp đưc. 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Tác dụng ca kháng sinh đưc phát hin vào tháng 10/1928 và Penicillin đưc s dụng vo năm 1943, đ mở ra kỷ nguyên mi trong y hc lâm sàng và ngành công ngh lên men sn xut kháng sinh. Ngoi đưc s dụng trong dự phng v điu tr các bnh nhiễm khuẩn, nhiễm nm, bnh ung thư cho ngưi, khng sinh cn đưc dng trong chăn nuôi, trồng trt và trong công nghip thực phẩm. Do đưc s dụng tràn lan và không đng cch nên tnh trng kháng kháng sinh ngày càng trở nên nghiêm trng. Kháng sinh là lp hot cht hu ích có tác dụng sinh hc rt mnh, đưc tổng hp t vi khuẩn, x khuẩn, vi nm hoặc t mt s thực vt bc cao. Ngày nay, vi sự phát trin mnh mẽ ca sinh hc hin đi cùng sự h tr ca nhiu ngành khoa hc khác giúp cho vic tìm kim và ng dụng khng sinh đt đưc nhng thành tựu rực r. Con ngưi không chỉ tìm kim nhng chng vi sinh vt sinh kháng sinh t tự nhiên mà còn ci to chúng bằng nhiu phương php như dng k thut di truyn, công ngh gen, gây đt bin đnh hưng, chn dòng gen sinh tổng hp Trong s hơn 15000 khng sinh hin nay đ đưc bit đn trên th gii thì khong 60% là do x khuẩn to ra, trong đ khong 55% do chi Streptomyces sn xut. Đây l chi x khuẩn ln, gồm nhiu vi sinh vt có kh năng sinh tổng hp kháng sinh, mt s loài có kh năng sinh tổng hp các cht cha ung thư, điu tr HIV Do đ, chi x khuẩn ny đang đưc trong nưc và th gii tp trung nghiên cu. Ti B môn Vi sinh- Sinh hc trưng ĐH Dưc Hà Ni, chng tôi đ chn đ tài “Góp phn nghiên cứu lên men tng hp kháng sinh nhờ Streptomyces 155.21” vi các mục tiêu như sau: - Nghiên cu ci to ging theo hưng tăng sinh tổng hp kháng sinh và lựa chn môi trưng lên men thích hp ca chng Streptomyces 155.21. - Nghiên cu mt vi đặc tính ca khng sinh đ sinh tổng hp đưc. [...]... mác,… 2.2 Nội dung nghiên cứu  Chọn lọc, cải tạo giống - Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn 3 dạng chủng có HTKS cao nhất - Đột biến bằng ánh sáng UV kết hợp bằng tác nhân hoá học từ 2 đến 3 lần để nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn gốc  Lên men, chiết tách kháng sinh - Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tốt nhất 16 - Thực hiện lên men từ các dạng... sản xuất kháng sinh Hình 1 : Giới thiệu sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh [6] Giống xạ khuẩn lưu giữ trong phòng thí nghiệm Nhân giống quy mô thí nghiệm Nhân giống trong thiết bị nhân giống Lên men tổng hợp kháng sinh Dịch lên men Lọc, ly tâm Sinh khối Dịch lọc Chiết bằng dung môi hữu cơ Dùng cột trao đổi ion… Dịch chiết sinh khối Dịch chiết Cô, tinh chế Sản phẩm... 29,15°C và pH 8,36 Đây là hướng nghiên cứu mở ra cho việc nghiên cứu sâu về chủng Streptomyces 155. 21 sau này để tăng cường hoạt tính kháng sinh bằng quy trình tối ưu hóa thành phần dinh dưỡng và điều kiện tham gia quá trình lên men 12 1.8.2 Một chủng Streptomyces sp với nhiều đặc điểm mới hứa hẹn thúc đẩy sự phát triển cúa nông nghiệp dịch bệnh [22] Chủng xạ khuẩn Streptomyces sp CIMAP-A1 được phân... tập hợp thành một khối phổ đồ [9]  Nó cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác định cấu trúc và định lượng các chất 1.8 Một số nghiên cứu liên quan 1.8.1 Tối ưu hóa thống kê của quá trình lên men để tăng cường hoạt tính kháng sinh của Streptomyces sp.CS392 [23] Nghiên cứu một chủng vi sinh vật đất mới được phân lập là Streptomyces sp CS392 cho thấy nó có hoạt tính kháng. .. chủng thu được, lựa chọn biến chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất - Tìm pH và dung môi hữu cơ chiết xuất dịch lọc của dịch lên men tốt nhất - Tìm hệ dung môi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất - Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ  Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được - Xác định nhiệt độ nóng chảy - Đo phổ IR, phổ... Chọn chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất : Các dạng chủng, biến chủng cần thử được nhân giống cấp 1 trên MT2dt, lên men trên môi trường tối thích đã chọn cho sinh tổng hợp kháng sinh Thử hoạt tính dịch lên men bằng phương pháp giếng thạch 20 2.3.7 Phương pháp xác định độ bền nhiệt, bền pH của kháng sinh trong dịch lên men  Xác định độ bền... người 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 2.1.1 Nguyên vật liệu  Chủng xạ khuẩn nghiên cứu: Chủng xạ khuẩn Streptomyces 155. 21 đã được phân lập và hiện nay được lưu giữ tại Bộ môn Vi sinh - Sinh học, trường Đai học Dược Hà Nội  Giống VSV kiểm định: Các chủng VSV kiểm định do Bộ môn Vi sinh - Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội cung... lớn.[6]  Lên men chìm : Vi sinh vật (hiếu khí và kị khí) được nuôi cấy trong toàn bộ môi trường lỏng  Ưu điểm: Dễ cơ giới hóa , tự động hóa, dễ kiểm soát toàn bộ qui trình , tốn ít diện tích, chi phí nhân lực thấp, hiệu suất quá trình lên men cao  Nhược điểm: Đầu tư trang thiết bị kỹ thuật ban đầu lớn.[10] 9  Các phương pháp lên men chìm: Lên men mẻ, lên men có... kiện nuôi cấy lên men được tối ưu hóa trong giai đoạn tiếp theo Dựa trên mô hình thực nghiệm bắt nguồn từ khung tối ưu hóa thống kê hai giai đoạn, hoạt tính kháng sinh đã tăng thêm 39,79% với các thông số tối ưu của quá trình lên men: thành phần chất dinh dưỡng tối ưu: 29,82g glucose, 7,6g peptone, 4,678g MgCl2 và 0,5005g / l axit casamino và điều kiện lên men tối ưu: Thời gian lên men 47,55 h; ủ nhiệt... thường dùng trong nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh: - Sắc ký lớp mỏng (TLC): Pha tĩnh là chất hấp phụ, được cố định trên bản mỏng (bản kính, bản nhôm, ) Pha động là một hệ dung môi đa thành phần được pha theo tỷ lệ Pha động di chuyển qua bản mỏng nhờ lực mao dẫn hoặc tác động của trọng lực [17] - Sắc ký rửa giải trên cột (CC): Pha tĩnh được giữ trên cột, pha động đi qua pha tĩnh nhờ áp suất hoặc . GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 155. 21 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Cao Văn Thu Nơi thực hiện : Bộ môn Vi Sinh – Sinh. Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN HUY TRÌNH GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 155. 21 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Hà Nội, 05/2013 . Ti B môn Vi sinh- Sinh hc trưng ĐH Dưc Hà Ni, chng tôi đ chn đ tài Góp phn nghiên cứu lên men tng hp kháng sinh nhờ Streptomyces 155. 21 vi các mục tiêu như sau: - Nghiên cu ci