BỘYTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI _ ______ ***** _______ _ LÊ THỊ THỌ NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT MỘT số GLYCOSID TỪ CÂY cỏ NGỌT (STEVIA REBAUDIANA (BERT.) HEMSL.), HỌ CÚC (ASTERACEAE) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ Người hướng dẫn: 1. TS. Nguyễn Văn Tài 2. TS. Nguyễn Thu Hằng Nơi thực hiện: 1. Khoa Hóa thực vật -Viện Dược Liệu 2. Bộ môn Dược Liệu ỊĩR Ư Ờ N a ĐH Noàv V ’ HÀ NỘI-2011 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, với sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, tôi đã hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp của mình. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới: TS. Nguyễn Văn Tài - Phó khoa - Khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu. TS. Nguyễn Thu Hằng - Phó trưởng Bộ môn Dược liệu , Trường ĐH Dược Hà Nội. Là những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm khóa luận. Tiếp theo, tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị trong Khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu đã luôn quan tâm, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa luận. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới các thầy cô giáo trong trưcmg, tới gia đình và bạn bè đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống. Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên khóa luận của tôi không thể tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong có được sự góp ý quý báu của các thầy cô và các bạn sinh viên. Hà Nội, tháng 5 năm 2011 Sinh viên Lê Thị Thọ MỤC LỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN Đ Ề 1 Chương 1. TÔNG QUAN 3 1.1 VỀ THỰC VẬT 3 1.1.1 VỊ trí phân loại 3 1.1.2 Đặc điểm thực vật 3 1.1.3 Phân bố 4 1.1.4 Sinh thái 4 1.2 VỀ HÓA HỌC 4 1.3 ỨNG DỤNG CỦA CẦY c ỏ NGỌT 8 1.3.1 Công dụng 8 1.3.2 Tác dụng sinh học 8 1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT GLYCOSID TỪ CÂY c ỏ NGỌT 14 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 17 2.1 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ 17 2.1.1 Nguyên liệu 17 2.1.2 Thiết bị, hóa chất 17 2.2 NỘI DƯNG NGHIÊN CÚXJ 18 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 Chương 3. THựC NGHIỆM , KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1 THỰC NGHIỆM VÀ KÉT QUẢ 20 3.1.1. Dự kiến các giai đoạn chính trong quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt 20 3.1.2 Khảo sát khả năng chiết glycosid từ dịch chiết nước cỏ ngọt bằng n-butanol bão hòa nước 20 3.1.3. Khảo sát khả năng tách glycosid của một số cột nhựa hấp phụ23 3.1.4. Khảo sát hệ dung môi rửa giải cột Diaion HP-20 25 3.1.5. Khảo sát nhiệt độ của quá trình chiết suất 26 3.1.6. Khảo sát thời gian chiết suất 27 3.1.7. Khảo sát tỷ lệ dược liệu/dung môi của quá trình chiết suất 28 3.1.8. Khảo sát số lần chiết suất 30 3.1.9. Đánh giá khối lượng và độ tinh khiết của CNl trong quá trình tinh chế 31 3.1.10. Xây dựng quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt sử dụng cột nhựa hấp phụ Diaion HP-20 33 3.1.11. Xác định cấu trúc của chất phân lập (Chất CN1) 36 3.1.12. Định lượng steviosid chiết được từ cỏ ngọt bằng phương pháp HPLC 40 3.2 BÀN LUẬN 41 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGÍỈỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADI - Acceptable Daily Intake CN1 - Chất chiết từ cỏ ngọt EFSA - European Food Safety Authority GFR - Glomerular filtration rate Glc - Glucose NOAEL - No Observed Adverse Effect Level Rha - Rhamnose RPF - Renal plasma flow SPiR - Spontaneously hypertensive rats SKLM - Sắc ký lớp mỏng SPT - Skin Prick Test STT - Số thứ tự Xyl - Xylose DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Cấu trúc của các Steviol glycosid chiết xuất từ cỏ ngọt 6 Bảng 2. Hiệu suất chiết glycosid từ dịch chiết nước cỏ ngọt bằng n-butanol bão hòa nước 23 Bảng 3. Khảo sát hiệu suất chiết glycosid từ cỏ ngọt của một số cột nhựa hấp phụ 26 Bảng 4 : Sự ảnh hưởng của dung môi rửa giải cột đến hiệu suất chiết glycosid từ cỏ ngọt 27 Bảng 5. Sự phụ thuộc của hiệu suất chiết glycosid từ cỏ ngọt vào nhiệt độ 28 Bảng 6. Sự phụ thuộc hiệu suất chiết glycosid từ cỏ ngọt vào thời gian chiết dược liệu 29 Bảng 7. Sự phụ thuộc tỷ lệ dược liệu/dung môi (w/v) trong quá trình chiết dược liệu đến hiệu suất chiết glycosid từ cỏ ngọt 31 Bảng 8. Sự ảnh hưởng của số lần chiết xuất đến hiệu suất chiết glycosid từ cỏ ngọt 32 Bảng 9. Khối lượng CNl thu được sau mỗi lần kết tinh lại 33 Bảng 10: Dữ liệu phổ IH-NMR và 13C-NMR của chất C N l 39 DANH MỤC HÌNH Hình 1. Khung cấu trúc hóa học của các steviol glycosid 5 Hình 2. Cấu trúc hóa học của Steviosid 7 Hình 3. Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất glycosid từ lá cỏ ngọt của Bùi Thị Song Sơn 16 Hình 4. Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất glycosid từ lá cỏ ngọt của Giovanetto 18 Hình 5. Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn chính chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt 24 Hình 6. Ảnh chụp sắc ký đồ của CNl trong hệ dung môi CHClsiMeOHiHiO (15:8:1), hiện vết bằng dung dịch H 2SO 4 10% trong EtOH, sấy 2 phút ở 100°c 34 Hình 7. Qui trình chiết glycosid từ cỏ ngọt sử dụng cột nhựa Diaion HP-20 37 Hình 8. Cấu trúc hóa học của CNl: Steviosid 41 ĐẶT VẤN ĐÈ Hiện nay, số người bị mắc các bệnh béo phì, tiểu đường, tim mạch, đang ngày càng gia tăng trên toàn thế giới. Nguyên nhân là do thói quen ăn nhiều đường và các thực phẩm có nhiều năng lượng nhưng lại ít vận động. Vì thế, các nhà sản xuất thực phẩm và đồ uống luôn trong cuộc chạy đua tìm kiếm các chất làm ngọt mà ít có tính dinh dưỡng. Việc sử dụng các sản phẩm hóa học tạo vị ngọt có thể được dùng để thay thế đưòng (saccharin, sodium cyclamat, sucralose và phổ biến nhất là aspartam) mặc dù rẻ và tiện lợi nhưng người ta vẫn e ngại ảnh hưởng về lâu dài của chúng đối với sức khoẻ. Hiện nay, saccharin đã bị cấm sử dụng tại một số quốc gia, vì bằng thực nghiệm đã chứng minh chất này gây ung thư bàng quang ở chuột. Aspartam không nên dùng cho những người bị bệnh Phenylketonuria. Chính vì thế, cây cỏ ngọt và các chất chiết xuất từ cỏ ngọt đang ngày càng được nhiều người chú ý đến như là chất điều vị tuyệt vời, có thể thay thế đường, không chứa calo, thích hợp dùng cho cả người bị bệnh tiểu đường và béo phì. Từ lâu, nhiều quốc gia trên thế giới đã sử dụng cỏ ngọt và các chất chiết từ cỏ ngọt. Trung Quốc xem cỏ ngọt như một dược liệu thiên nhiên rất tốt để giúp làm giảm cân, ăn ngon và tiêu hóa tốt. Nhật Bản là quốc gia sử dụng cây cỏ ngọt nhiều nhất trên thế giới. Mỗi năm kỹ nghệ Nhật tiêu thụ từ 700 tấn đến 1000 tấn lá cỏ ngọt. Một khối lượng lớn cỏ ngọt cần phải được nhập thêm từ Hàn Quốc, Đài Loan và Trung Quốc. Việc sử dụng cỏ ngọt trên thế giới đã gây nhiều tranh cãi trong thời gian qua vì một số nghiên cứu trước đây cho rằng việc sử dụng steviosid - hoạt chất chính chiết từ cỏ ngọt có thể ảnh hưởng đến khả năng sinh sản trên chuột thí nghiệm. Mới đây nhất, ủy ban châu Âu về an toàn thực phẩm đã đưa ra két luận về sự an toàn của các glycosid chiết từ cỏ ngọt dựa trên rất nhiều dữ liệu và thí nghiệm đã được công nhận [15]. ở Việt Nam, mặc dù được nhập về trồng từ trước năm 1990 ở quy mô sản xuất nhưng việc sử dụng cây cỏ ngọt mới chỉ dừng lại ở những dạng dùng đơn giản và chủ yếu dùng cho xuất khẩu. Đây là một loại cây có giá trị kinh tế cao và hiện việc trồng cỏ ngọt đã được mở rộng ra nhiều vùng trên cả nước. Việc trồng cỏ ngọt ở Việt Nam có nhiều thuận lợi vì vốn đầu tư ban đầu không lớn, việc chăm sóc không quá khó khăn và cho năng suất cao. Do đó, việc nghiên cứu chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt để thay thế đường đang được các nhà khoa học quan tâm. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chiết xuất một số glycosid từ cây cỏ ngọt {Stevia rehaudỉana (Bert.) Hemsl.), họ Cúc (Asteraceae)” với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt 2. Xác định cấu trúc hóa học của chất phân lập được CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. VÈ THựC VẬT 1.1.1. Vị trí phân loại Theo các tài liệu về phân loại thực vật [2], cây cỏ ngọt có vị trí phân loại như sau: Giới Thực vật (Plantae) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta ) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Cúc (Asteridae) Bộ Cúc (Asterales) Họ Cúc (Asteraceae) Chi Stevia Cav. 1.1.2. Đăc điểm thưc vât • • • Tên khoa học; Stevia rebaudiana (Bert.) Hemsl. Tên Việt Nam: cỏ ngọt, cỏ mật, cúc ngọt. Cây thảo nhỏ, sống nhiều năm, cao 0,5-0,6m, có khi đến Im. Thân cứng mọc thẳng, có tiết diện tròn, có rãnh dọc và nhiều lông mịn, ít phân nhánh. Lá mọc đối, hình mác hoặc bầu dục, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn, dài 5-7 cm, rộng 1-1,5 cm, có 3 gân, 4-6 đôi răng nhọn ở phần nửa về phía đầu lá, hai mặt có lông trắng mịn, nhấm lá thấy có vị ngọt rất đậm; cuống lá rất ngắn. Hoa lưỡng tính, tụ họp thành đầu màu trắng ở ngọn thân. Quả bế, không có mào lông, hạt không có nội nhũ [1], [12' Mùa hoa: tháng 5-9. [...]... trong quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt Để xây dựng quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt, chúng tôi dự kiến quy trình sẽ gồm các giai đoạn chính được trình bày ở sơ đồ hinh 5 3.1.2 Khảo sát khả năng chiết glycosid từ dịch chiết nước cỏ ngọt bằng nbutanol bão hòa nước Nguyên tắc: Chiết glycosid từ cỏ ngọt theo quy trình mô tả ở hình 5 Cân khối lượng tinh thể CNl và tính hiệu suất chiết theo công... trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt - Khảo sát khả năng chiết glycosid từ dịch chiết nước cỏ ngọt bằng nbuthanol và cột nhựa hấp phụ - Khảo sát các thông số của quá trình chiết xuất: nhiệt độ chiết, thời gian chiết, số lần chiết, tỷ lệ dược liệu/dung môi - Hiệu suất chiết xuất tính theo dược liệu khô theo công thức ( *): m A( %) = - X 100 Trong đó: A : Hàm lương phần trăm ( %) M(l-b) m; Khôi lượng... ý trong cây cỏ ngọt là các steviol glycosid Các glycosid này chiếm 10-20% khối lượng lá cỏ ngọt khô và có bộ khung cấu trúc được trình bày ở hình 1 Hình 1 Khung cấu trúc hóa học của các steviol glycosid CHn Steviol Ri = R 2 = H Cho đến nay đã có 9 steviol glycosid được phân lập từ lá cỏ ngọt được tổng kết ở bảng 1 [ 1],[ 12],[20 ] Bảng 1 Cấu trúc của các steviol giycosid chiết xuất từ cỏ ngọt STT... hành chiết glycosid từ cỏ ngọt theo quy trình mô tả ở hình 5 ở giai đoạn ( 1) chúng tôi tiến hành chiết cỏ ngọt trong khoảng thời gian khác nhau (3h, 4h, 5h) với khối lưọng dược liệu 15g, dung môi chiết là H 2O, tỉ lệ dược liệu/ dung môi = l/ 35 (w/v), nhiệt độ chiết là 65°c ở giai đoạn ( 4) sử dụng cột Diaion HP-20 và ở giai đoạn ( 5) rửa giải cột với hệ dung môi EtOHH2O (v/v) 75/25.Tính hiệu suất chiết. .. quá trình chiết suất Tiến hành chiết glycosid từ cỏ ngọt theo quy trình mô tả ở hình 5 ở giai đoạn ( 1) chúng tôi tiến hành chiết cỏ ngọt ở nhiệt độ khác nhau (55 °c, 65°c, 75 ) với khối lượng dược liệu 15g, dung môi chiết là H 2O, tỉ lệ dược liệu/ dung môi (w/v) = 1/35, thời gian chiết là 4h ở giai đoạn ( 4) sử dụng cột Diaion HP-20 và ở giai đoạn ( 5) rửa giải cột với hệ dung môi Et0 H-H20 (v/v) 75/25... phương pháp chiết glycosid từ dịch chiết nước cỏ ngọt bằng n-butanol cho hiệu suất thấp, hơn nữa sử dụng dung môi nbutanol rất độc hại, giá thành cao do đó việc chiết với n-butanol không thể tiến hành ở qui mô lớn Vì vậy, trong các quy trình chiết xuất về sau chúng tôi không tiến hành giai đoạn chiết glycosid bằng n-butanol 22 Hình 5 Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn chính chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt 23... theo công thức ( *) ở mục 2 3 Kết quả được trình bày ở bảng 6 Bảng 6 Sự phụ thuộc hiệu suất chiết glycosid từ cỏ ngọt vào thời gian chiết dươc liêu • STT • Thời gian Khối lượng dược Khối lượng tinh Hiệu suất chiết (h) liệu (g) thể (g) chiết ( %) 1 3 15,03 0,30 2,27 2 4 15,23 0,31 2,31 3 5 15,01 0,29 2,20 Nhận xét: Bảng 6 cho thấy khi tăng thời gian chiết từ 3h đến 4h thì hiệu suất chiết thu được tăng... suất chiết theo công thức ( *) ở mục 2.3 Kết quả được trình bày ở bảng 5 Bảng 5 Sự phụ thuộc của hiệu suất chiết glycosid từ cỏ ngọt vào nhiệt độ STT Nhiệt độ chiết Khối lưọng dược Khối lượng tinh Hiệu suất liệu (g) thể (g) chiết ( %) 1 55°c 15,21 0,29 2,17 2 65°c 15,23 0,31 2,31 3 75°c 15,13 Không kết tinh được Nhân xét: Từ kết quả ở bảng 5 cho thấy nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chiết glycosid. .. Quy trình chiết xuất glycosid từ lá cỏ ngọt được tóm tắt ở sơ đồ hình 3 1.4.2 Phương pháp 2: Phương pháp của Giovanetto 1988 Phương pháp này được coi là nền tảng cho rất nhiều nghiên cứu về sau trong việc sử dụng cột trao đổi ion để loại tạp màu trong dịch chiết nước cỏ ngọt [27] Quy trình chiết xuất được tóm tắt ở sơ đồ hình 4 1.4.3 Phương pháp 3: Phương pháp của Payzant 1999 Quy trình chiết xuất của... trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích; MeOH, EtOH, Chloroform, n-Butanol, Ca(0 H)2, FeCla, Acid Citric monohydrat, nhựa Amberlite XAD-2, nhựa Amberlite XAD-7, nhựa Diaion HP-20 , H 2SO4 đặc 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN c ứ u - Xây dựng quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt theo hướng áp dụng vào sản xuất - Xác định cấu trúc hóa học chất phân lập được 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u Xây dựng quy trình chiết xuất . BỘYTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI _ ______ ***** _______ _ LÊ THỊ THỌ NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT MỘT số GLYCOSID TỪ CÂY cỏ NGỌT (STEVIA REBAUDIANA (BERT. ) HEMSL .), HỌ CÚC (ASTERACEAE) KHÓA LUẬN TỐT. được các nhà khoa học quan tâm. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài Nghiên cứu chiết xuất một số glycosid từ cây cỏ ngọt {Stevia rehaudỉana (Bert. ) Hemsl .), họ Cúc (Asteraceae) với các mục tiêu. suất chiết glycosid từ cỏ ngọt của một số cột nhựa hấp phụ 26 Bảng 4 : Sự ảnh hưởng của dung môi rửa giải cột đến hiệu suất chiết glycosid từ cỏ ngọt 27 Bảng 5. Sự phụ thuộc của hiệu suất chiết glycosid