BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI DƢƠNG QUỲNH TRÂM XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG METHAMPHETAMIN TRONG TÓC BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI DƢƠNG QUỲNH TRÂM XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG METHAMPHETAMIN TRONG TÓC BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. ThS. Phạm Lê Minh 2. ThS. Phạm Quốc Chinh Nơi thực hiện: Khoa Hóa pháp – Viện Pháp y Quốc gia HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn đến ThS. Phạm Lê Minh, giảng viên Bộ môn Hóa phân tích và độc chất trường ĐH Dược HN đã tạo mọi điều kiện cho em tham gia hoàn thành khóa luận tại Viện Pháp y Quốc Gia. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS. Phạm Quốc Chinh, cán bộ Khoa Hóa pháp – Viện Pháp y Quốc gia, người đã trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời gian, tâm huyết, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này. Em xin gửi lời cám ơn tới Ban Giám đốc Viện Pháp y Quốc gia và Khoa Hóa phân tích và độc chất– Trường ĐH Dược HN đã luôn tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Em cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị cán bộ ở Khoa Hóa pháp – Viện Pháp y Quốc gia đã nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong quá trình tiến hành thí nghiệm. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người đã luôn động viên khích lệ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này. Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Dƣơng Quỳnh Trâm MỤC LỤC Đặt vấn đề 1 Chƣơng 1: Tổng quan 3 1.1. Tổng quan về nhóm ATS 3 1.2. Tổng quan về methamphetamin 5 1.2.1. Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa 5 1.2.2. Tác dụng dược lý 5 1.2.3. Dược động học và phân bố trong tóc 7 1.3. Tổng quan về chiết methamphetamin trong tóc 9 1.3.1. Cấu trúc của tóc 9 1.3.2. Các phương pháp chiết methamphetamin trong tóc 9 1.4. Tổng quan về sắc kí khí khối phổ (GC-MS) 10 1.4.1. Khái niệm 10 1.4.2. Hệ thống GC-MS 11 1.4.3. Một số kỹ thuật MS 14 1.5. Các phương pháp xác định methamphetamin trong tóc 15 1.5.1. Phương pháp sắc ký khí khối phổ 15 1.5.2. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) 15 1.5.3. Phương pháp miễn dịch 15 Chƣơng 2: Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu 16 2.1. Nguyên liệu, thiết bị 16 2.2. Nội dung nghiên cứu 17 2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng MA trong tóc 17 2.2.2. Ứng dụng phân tích MA trong mẫu thực 17 2.3. Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1. Lấy mẫu, chuẩn bị mẫu nghiên cứu 17 2.3.2. Pha các dung dịch chuẩn 17 2.3.3. Xử lý mẫu, chiết và tạo dẫn xuất 18 2.3.4. Định lượng methamphetamin trong mẫu tóc 19 2.3.4.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký 19 2.3.4.2. Lựa chọn nội chuẩn 19 2.3.4.3. Thẩm định phương pháp phân tích 19 2.3.5. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng định lượng MA trong mẫu tóc 20 2.4. Phương pháp xử lý số liệu 20 Chƣơng 3: Thực nghiệm và kết quả 22 3.1. Xây dựng phương pháp định lượng MA bằng GC-MS 22 3.1.1. Thiết lập chương trình GC-MS xác định MA 22 3.1.2. Khảo sát phổ khối của MA-TFA và AM-d5-TFA 22 3.2. Thẩm định phương pháp 25 3.2.1. Tính phù hợp hệ thống 25 3.2.2. Tính chọn lọc - độ đặc hiệu 26 3.2.3. Độ tuyến tính 28 3.2.4. Độ đúng và độ chính xác 29 3.2.5. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 31 3.2.6. Hiệu suất chiết 31 3.3. Ứng dụng phân tích MA trong mẫu tóc thực 32 Bàn luận 36 Kết luận và kiến nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AM Amphetamin AM-d5 Amphetamin-D5 ATS Các chất kích thích thần kinh dạng amphetamin (Amphetamine Type Stimulants) CTPT Công thức phân tử DMA 2,5-Dimethoxyamphetamin ELISA Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) GC-FID Sắc ký khí với detector ion hóa ngọn lửa (Gas Chromatography – Flame Ionization Detector) GC-MS Sắc ký khí khối phổ (Gas Chromatography–Mass Spectrometry) HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) KLPT Khối lượng phân tử LC-MS Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid Chromatography–Mass Spectrometry) LOD Giới hạn phát hiện (Limit Of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit Of Quantitation) MA Methamphetamin MDA 3,4-Methylendioxyamphetamin MDMA 3,4-Methylendioxymethamphetamin RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) TFAA Trifluoroacetic anhydrid DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Công thức một số ATS điển hình 4 3.1 Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của phương pháp 25 3.2 Kết quả khảo sát độ tuyến tính 29 3.3 Kết quả khảo sát độ đúng và độ chính xác 30 3.4 Kết quả khảo sát hiệu suất chiết 32 3.5 Kết quả định lượng một số mẫu thực 32 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Tên hình Trang 1.1 Một số dạng ma túy tổng hợp ATS trên thị trường ma túy Việt Nam 4 1.2 Cơ chế tác dụng lên thần kinh trung ương của MA 7 1.3 Sơ đồ chuyển hóa của MA 8 1.4 Giả thuyết cơ chế MA đi vào trong tóc 8 1.5 Cấu trúc của tóc 9 1.6 Sơ đồ máy sắc ký khí khối phổ 11 1.7 Sơ đồ khối của máy khối phổ 14 2.1 Máy sắc ký khí khối phổ Agligent Technologies 6980N 16 3.1 Sắc ký đồ TIC của chất chuẩn (MA+AM-d5) 100ng tạo dẫn xuất với TFAA 23 3.2 Sắc ký đồ sau xử lý tách ion của AM-d5-TFA với SIM mảnh 144 (trên) và MA-TFA với mảnh SIM 154 (dưới). 23 3.3 Phổ khối của MA-TFA 24 3.4 Phổ khối của AM-d5-TFA 24 3.5 Sắc ký đồ TIC mẫu tóc trắng 26 3.6 Sắc ký đồ mẫu tóc trắng sau xử lý tách ion với mảnh 144 (trên) và mảnh 154 (dưới) 27 3.7 Sắc ký đồ TIC mẫu tóc trắng + chuẩn 27 3.8 Sắc ký đồ mẫu tóc trắng + chất chuẩn sau xử lý tách ion với mảnh 144 (trên) và mảnh 154 (dưới) 28 3.9 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa tín hiệu đáp ứng (tỷ số diện tích pic MA/AM-d5) với hàm lượng mẫu nhiễm 29 3.10 Sắc ký đồ TIC mẫu Quách Trường S 33 3.11 Sắc ký đồ của mẫu Quách Trường S sau xử lý tách ion với mảnh 144 (trên) và 154 (dưới) 33 3.12 Sắc ký đồ TIC của mẫu Nguyễn Văn M 34 3.13 Sắc ký đồ của mẫu Nguyễn Văn M sau xử lý tách ion với mảnh 144 (trên) và mảnh 154 (dưới). 34 1 Đặt vấn đề Từ rất lâu, ma túy đã trở thành một vấn đề nóng và nhạy cảm trong cộng đồng. Sử dụng ma túy không chỉ gây ra những hậu quả nghiêm trọng cho cá nhân mà còn kéo theo nhiều tệ nạn và hệ lụy xã hội. Vì thế việc phát hiện, phòng chống hoạt động tàng trữ, buôn bán, sử dụng loại hàng cấm này luôn được chú trọng đặt lên hàng đầu. Tuy nhiên theo thời gian, hình thức của ma túy cũng thay đổi muôn hình vạn trạng với rất nhiều dạng hoạt chất mới để đáp ứng nhu cầu đa dạng của con nghiện cũng như để dễ dàng luồn lách qua mạng lưới hệ thống pháp lý, đã mang đến nhiều khó khăn cho công việc này. Cụ thể hiện nay, có một nhóm ma túy mới đã có sự “bùng nổ” ở nhiều quốc gia và khu vực, đó là các chất kích thích dạng Amphetamine (ATS). Theo một những báo cáo của cơ quan Phòng chống ma túy và tội phạm của Liên hợp quốc, trong những năm gần đây thì methamphetamine (MA) là loại ATS có sự gia tăng mạnh và ngày càng tăng trên thị trường ma túy [1][31]. Để thực hiên tốt công tác phòng chống các hành vi bất hợp pháp liên quan tới loại ma túy trên, công việc kiểm nghiệm phát hiện ra MA cũng đóng một vai trò không nhỏ. Trên thế giới hiện nay đã sử dụng nhiều phương pháp để phân tích MA trong máu, nước tiểu, tóc như các kit phát hiện nhanh bằng ELISA, các phương pháp xác định bằng LC-MS, HPLC, GC-MS, GC-FID,….Còn ở Việt Nam chỉ mới phổ biến ở dùng các test thử nhanh, sắc lỏng hay sắc kí khí; một số cơ quan giám định đã bắt đầu nghiên cứu dùng sắc kí khí khối phổ GC-MS, sắc kí lỏng khối phổ LC-MS để phân tích trên mẫu vật máu, nước tiểu, tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào sử dụng GC-MS phân tích trên mẫu tóc trong khi mẫu tóc là mẫu vật tiện lợi hơn cả để xác định nhanh chóng methamphetamin. Với lý do đó, chúng tôi đã đặt vấn đề xác định methamphetamin trong tóc bằng phương pháp GC-MS nhằm đưa ra quy trình chuẩn giám định methamphetamin trong tóc để ứng dụng trong các phòng xét nghiệm hình sự trong cả nước với hy vọng sẽ góp phần phục vụ tốt hơn cho công tác phòng chống tội phạm ma túy. Để thực hiện mục tiêu trên, nội dung luận văn sẽ có 2 phần sau: 2 1. Xây dựng phương pháp định tính và định lượng MA trong tóc bằng kỹ thuật GC-MS. 2. Thẩm định phương pháp đã xây dựng, đề ra quy trình phân tích thường quy để xác định MA trong tóc và áp dụng vào mẫu tóc thực tế. [...]... phương pháp xác định methamphetamin trong tóc 1.5.1 Phương pháp sắc ký khí khối phổ Phương pháp sắc ký khí khối phổ ngày càng được sử dụng rộng rãi trong phân tích MA Máy sắc ký khí tách MA và đưa vào detector khối phổ, có khả năng định tính, định lượng MA với độ nhạy và độ chính xác cao Để sử dụng phương pháp này, MA cần được tạo dẫn xuất để tăng khả năng bay hơi và bền với điều kiện sắc ký [16][18][20][27][30][34]... sắc ký khí khối phổ Agligent Technologies 6980N  Thiết bị dụng cụ: - Máy sắc kí khí khối phổ - Máy lắc siêu âm - Máy ly tâm - Tủ sấy - Hệ thống làm khô bằng Nitơ 17 - Bình định mức, bình nón, ống nghiệm, và các dụng cụ khác 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng MA trong tóc  Xây dựng phương pháp định lượng MA trong tóc bằng GC-MS: bao gồm các nội dung - Xử lý mẫu: đưa ra quy. .. lỏng trong sắc ký khílỏng (GLC) còn gọi là sắc ký khí phân bố hay chất rắn trong sắc ký khí- rắn (GSC) còn gọi là sắc ký khí hấp phụ, nhưng vì quá trình hấp phụ có nhiều hạn chế nên GSC ít được ứng dụng ngoại trừ phân tích một số chất khí [2][35] Khối phổ (MS) là một kỹ thuật dựa trên việc đo tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) để cung cấp thông tin định tính xác định cấu trúc và định lượng. .. hành sắc ký 19 2.3.4 Định lượngmethamphetamin trong mẫu tóc 2.3.4.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký Dựa theo quy trình sắc ký khí khối phổ được ghi nhận trong tài liệu Quy trình giám định pháp y (2014 ) - Bộ Y tế [3], tiến hành khảo sát mảnh phổ của MA chuẩn để có điều kiện khối phổ phù hợp 2.3.4.2 Lựa chọn nội chuẩn Dựa trên CTHH của MA, tham khảo cá tài liệu về định lượng MA bằng GCMS và tính sẵn có hóa... nang tóc vào nang tóc, nằm chủ yếu ở tủy tóc MA tồn tại trong tóc trong vài tháng đến thậm chí hàng năm [17][19][30] Hình 1.4 Giả thuyết cơ chế MA đi vào trong tóc 9 1.3 Tổng quan về chiết methamphetamin trong tóc 1.3.1 Cấu trúc của tóc Sợi tóc gồm 2 phần là nang tóc và thân tóc Nang tóc còn gọi là chân tóc, nằm phía dưới bề mặt da sâu từ 3-5mm Nó được bao quanh bởi hệ thống mao mạch máu nuôi dưỡng tóc. .. máy sắc ký khí khối phổ  Khí mang Pha động trong sắc ký khí hay còn gọi là khí mang giữ vai trò vận chuyển chất phân tích qua cột Khí mang thường là khí có phân tử lượng nhỏ, phải đảm bảo yêu cầu trơ về mặt hóa học, đảm bảo tinh khiết và phù hợp với từng loại detector Một số loại khí mang thường dùng là heli, nitơ, hydro, argon,… Đi kèm với bình cấp khí mang còn có van giảm áp, đồng hồ kiểm tra lưu lượng. .. xuất với lượng cùng lượng chất chuẩn đem đi tạo mẫu nhiễm Đo và so sánh kết quả sắc ký hai mẫu 2.3.5 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng định lượng MA trong mẫu tóc Hàm lượng MA trong mẫu tóc (tính theo ng MA trên 1mg tóc) được tính theo công thức: 𝐻𝐿 = 𝑆 𝑀𝐴 /𝑆 𝐴𝑀−𝑑5 − 𝑏 𝑎 × 𝑚 Trong đó: SMA: Diện tích pic của MA (mảnh 154) SAM-d5: Diện tích pic của AM-d5 (mảnh 144) a, b: Là các tham số trong phương trình. .. [16][18][20][27][30][34] 1.5.2 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ cũng là một phương pháp đã được sử dụng nhiều để phát hiện MA Với mẫu tóc, chiết MA bằng phương pháp thích hợp rồi đưa vào hệ thống LC-MS mà không cần tạo dẫn xuất như với GC-MS Bộ phận LC có chức năng chia tách MA trong dung dịch, đưa vào bộ phận khối phổ với vai trò detector để định tính , định lượng [18][22][23][30]... đưa ra quy trình xử lý mẫu chiết lỏng lỏng sau khi thủy phân trong môi trường kiềm - Lựa chọn điều kiện sắc ký, lựa chọn chuẩn nội: đưa ra chương trình sắc ký khối phổ để định lượng, chất chuẩn nội phù hợp  Thẩm định phương pháp: bao gồm các nội dung - Tính phù hợp hệ thống sắc ký - Tính chọn lọc – độ đặc hiệu - Độ tuyến tính - Độ đúng - Độ chính xác - Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 2.2.2... proteinase K, protease E, protease VIII, biopurase,… 1.4 Tổng quan về sắc ký khí khối phổ (GC-MS) 1.4.1 Khái niệm Sắc ký khí (GC) là một phương pháp tách các chất từ một hỗn hợp ở thể khí bay hơi với pha động là một chất khí thường là khí trơ Mẫu phân tích được đưa vào đầu cột và quá trình rửa giải được thực hiện nhờ dòng khí trơ qua cột sắc ký, tuy nhiên pha động không tương tác với chất phân tích mà chỉ . vào trong tóc 8 1.5 Cấu trúc của tóc 9 1.6 Sơ đồ máy sắc ký khí khối phổ 11 1.7 Sơ đồ khối của máy khối phổ 14 2.1 Máy sắc ký khí khối phổ Agligent Technologies 6980N 16 3.1 Sắc ký. 1. Xây dựng phương pháp định tính và định lượng MA trong tóc bằng kỹ thuật GC-MS. 2. Thẩm định phương pháp đã xây dựng, đề ra quy trình phân tích thường quy để xác định MA trong tóc và. GC có thể là chất lỏng trong sắc ký khí- lỏng (GLC) còn gọi là sắc ký khí phân bố hay chất rắn trong sắc ký khí- rắn (GSC) còn gọi là sắc ký khí hấp phụ, nhưng vì quá trình hấp phụ có nhiều