BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ NGÂN BÌNH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG ATENOLOL BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ NGÂN BÌNH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG ATENOLOL BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS. Phạm Thị Thanh Hà Nơi thực hiện: Bộ môn Hoá phân tích và Độc chất ! HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới TS. Phạm Thị Thanh Hà – Bộ môn Hoá phân tích và Độc chất - Trường Đại học Dược Hà Nội, đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp. Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, anh/ chị kỹ thuật viên tại Bộ môn Hóa phân tích và độc chất- Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện tốt nhất về cơ sở vật chất để em hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, các phòng ban, bộ môn và các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian em học tập tại trường. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người luôn động viên, khích lệ và tạo động lực cho em trong suố t quá trình học tập và thực hiện đề tài. Hà Nội, ngày 12 tháng 06 năm 2015 Sinh viên Vũ Ngân Bình MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ iii ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Phân tích đồng phân đối quang 2 1.1.1. Đồng phân đối quang 2 1.1.2. Phân tích đồng phân đối quang 4 1.2. Tổng quan về atenolol 9 1.3. Tổng quan về phân tích đồng phân đối quang atenolol 10 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. Đối tượng nghiên cứu, hoá chất, trang thiết bị 14 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 14 2.1.2. Hoá chất 14 2.1.3. Trang thiết bị 14 2.2. Nội dung nghiên cứu 15 2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng đồng phân đối quang atenolol bằng điện di mao quản 15 2.2.2. Thẩm định phương pháp 15 2.2.3. Ứng dụng 16 2.3. Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện điện di 16 2.3.2. Thẩm định phương pháp phân tích 17 2.4. Phương pháp xử lý số liệu 19 Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn, dung dịch mẫu và các dung dịch làm việc 20 3.2. Khảo sát và lựa chọn điều kiện điện di 21 3.2.1. Một số điều kiện ban đầu 21 3.2.2. Lựa chọn cột mao quản 21 3.2.3. Lựa chọn dung dịch điện ly nền 23 3.2.4. Lựa chọn điện thế áp vào hai đầu mao quản 24 3.2.5. Lựa chọn nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang 26 3.2.6. Xác định thứ tự di chuyển của hai đồng phân (R)- và (S)-atenolol 27 3.2.7. Xác định hàm lượng đồng phân (R)- và (S)- atenolol trong chuẩn (R,S)-atenolol 29 3.3. Thẩm định phương pháp 29 3.3.1 Độ phù hợp hệ thống 29 3.3.2. Độ đặc hiệu 30 3.3.3. Khoảng nồng độ tuyến tính 32 3.3.4. Độ chính xác 33 3.3.5. Độ đúng 34 3.3.6. Ứng dụng phương pháp định lượng hai đồng phân đối quang atenolol trong chế phẩm 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AGP Acid α1-glycoprotein BGE (Background Electrolyte) Dung dịch điện ly nền β-CD Beta cyclodextrin CD cyclodextrin CE (Capillary Electrophoresis) Điện di mao quản CM-β-CD Carboxymethyl beta cyclodextrin EOF (Electroosmotic flow) Dòng điện thẩm GC (Gas Chromatography) Sắc ký khí HPLC (High Performance Liquid Chromatography) Sắc ký lỏng hiệu năng cao I.D. (inner diameter) Đường kính trong kl/tt Khối lượng trên thể tích L e (effective length) Chiều dài hiệu dụng ppm (part per million) Phần triệu R s (Resolution) Độ phân giải RSD (Relative Standard Deviation ) Độ lệch chuẩn tương đối SD (Standard Deviation) Độ lệch chuẩn SĐK Số đăng ký TLC (Thin Layer Chromatography) Sắc ký lớp mỏng t m (migration time) Thời gian di chuyển Tris Tris (Hydroxymethy) amimomethan ii DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Số bảng Tên bảng Trang 1.1 Một số nghiên cứu phân tích đồng phân đối quang Atenolol bằng HPLC 10 1.2 Một số nghiên cứu tách đồng phân đối quang atenolol bằng CE 11 3.1 Xác định hàm lượng các đồng phân trong chuẩn (R,S)- atenolol 29 3.2 Độ phù hợp hệ thống 30 3.3 Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của (R,S)- atenolol và (R)-, (S)-atenolol 32 3.4 Kết quả đánh giá độ chính xác của phương pháp 33 3.5 Kết quả đánh giá độ đúng của (R)-,(S)-atenolol 34 3.6 Kết quả xác định hàm lượng (R)- và (S)-atenolol trong các mẫu chế phẩm 35 iii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Số hình Tên hình Trang 1.1 Cấu trúc và kích thước của các cyclodextrin tự nhiên [11] 7 1.2 Tương tác giữa chất phân tích mang điện dương và cyclodextrin mang điện âm. Tương tác tĩnh điện khiến phức 1 bền hơn phức 2 (K1>K2) [4] 8 1.3 Công thức cấu tạo của hai đồng phân đối quang Atenolol 9 3.1 Điện di đồ của dung dịch (R,S)-atenolol 100 ppm khi sử dụng mao quản dài 48,5 cm 21 3.2 Điện di đồ khi sử dụng các dung dịch điện ly nền khác nhau a) Đệm phosphate 50 mM b)Đệm 50 mM Tris – H 3 PO 4 22 3.3 Điện di đồ dung dịch chuẩn (R,S)-atenolol ở 4 điện thế a) 15 kV; b) 20 kV; c) 25 kV; d) 30 kV 24 3.4 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của thời gian di chuyển các đồng phân quang học của atenolol vào giá trị điện thế sử dụng 25 3.5 Điện di đồ dung dịch (R,S)-atenolol 100 ppm khi thay đổi nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang a) CM-β-CD 6 mM; b) CM-β-CD 8 mM; c) CM-β-CD 10 mM 26 3.6 Điện di đồ dung dịch a) chuẩn (S)-atenolol và b) chuẩn (R,S)- atenolol 28 3.7 Điện di đồ: a) mẫu placebo; b) mẫu S-atenolol; c) mẫu chuẩn (R,S)-atenolol; d) mẫu viên nén atenolol STADA 50 mg 31 3.8 Điện di đồ dung dịch thử viên nén Ternomin 50 mg 36 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay trên thị trường có rất nhiều thuốc có chứa hoạt chất là các đồng phân quang học. Các đồng phân đối quang có thể có hoạt tính sinh học rất khác nhau. Một xu hướng phổ biến trong nghiên cứu thuốc là chuyển hoạt chất từ dạng hỗn hợp racemic sang dạng đơn đồng phân, nếu đồng phân đó có tác dụng chính và độc tính thấp hơn đồng phân còn lại. Phân tích các đồng phân đối quang có ý nghĩa ngày càng quan trọng, do có thể giúp phân biệt đặc điểm dược động học và dược lực học của hai đồng phân và phân tích tạp đối quang. Atenolol là dẫn chất của aryloxypropanolamin, có tác dụng ức chế chọn lọc trên thụ thể β 1 - adrenergic dùng điều trị tăng huyết áp [2]. Atenolol có hai đồng phân đối quang là (S)-atenolol và (R)-atenolol, trong đó (S)-atenolol có vai trò chính ức chế beta giao cảm đồng thời độc tính cũ ng thấp hơn so với (R)-atenolol [22],[29]. Do đó atenolol cũng là một đối tượng tiềm năng của sự chuyển dạng đồng phân từ hỗn hợp racemic sang đơn đồng phân (S)-atenolol. Điều này đòi hỏi phải xây dựng phương pháp phân tách và định lượng được từng dạng đơn đồng phân trong hỗn hợp racemic của atenolol. Hiện nay, kỹ thuật điện di mao quản được dùng phổ biến để tách các đồng phân quang học do tính linh hoạt, hiệu lực tách cao, lượng mẫu sử dụ ng ít. Tuy nhiên ở Việt Nam kỹ thuật này vẫn còn được áp dụng khá hạn chế. Do đó chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng đồng phân đối quang atenolol bằng điện di mao quả n” với hai mục tiêu: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản. 2. Ứng dụng phương pháp này định lượng các đồng phân đối quang của atenolol trong chế phẩm. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Phân tích đồng phân đối quang 1.1.1 Đồng phân đối quang Đồng phân đối quang là một đồng phân lập thể được hình thành do sự sắp xếp không gian đối nghịch nhau của các nhóm thế trên một nguyên tử bất đối, thường gặp nhất là nguyên tử carbon. Hầu hết các tính chất lý hoá của hai đồng phân đối quang tư ơng tự nhau, trừ khả năng làm quay mặt phẳng ánh sánh phân cực theo hai góc bằng nhau nhưng ngược chiều nhau. Đồng phân đối quang làm quay mặt phẳng ánh sang phân cực theo chiều cùng chiều với kim đồng hồ được gọi là đồng phân (+) hoặc d (tiếng Latin dextro), đồng phân đối quang là quay mặt phẳng ánh sáng phân cực theo chiều ngược chiều với kim đồng hồ đư ợc gọi là đồng phân (-) hoặc l (tiếng Latin là levo). Ngoài ra tuỳ theo thứ tự sắp xếp của các nhóm chức trong không gian xung quanh vị trí nguyên tử bất đối mà đồng phân đối quang có thể được gọi là đồng phân (R) hoặc (S), (D) hoặc (L). Do danh pháp d, l và (D), (L) dễ bị nhầm lẫn, các đồng phân đối quang thường được gọi là đồng phân (+), (-) hoặc (R), (S). Tuy tính chất lý hoá của hai đồng phân rất giống nhau, hoạt tính sinh học của hai đồng phân đối quang có thể rất khác nhau. Rất nhiều thuốc trên thị trường có hoạt chất là các chất hoạt quang, được sử dụng ở dạng racemic (là hỗn hợp của hai đồng phân đối quang, với tỷ lệ thường là 50:50), hoặc ở dạng đơn đồng phân. Việc nghiên cứu các đặc tính dược lực học, dược đ ộng họ c của hai đồng phân đối quang là quan trọng, do chúng có thể có những đặc điểm hoàn toàn khác nhau và khác với hỗn hợp racemic. [...]... mao quản dưới tác dụng của điện trường do thể zeta tạo ra trên giao di n tiếp xúc giữa bề mặt mao quản và dung dịch trong mao quản Các đồng phân đối quang được phân tích bằng điện di mao quản phần lớn là theo phương pháp trực tiếp: thêm chất chọn lọc đối quang vào dung dịch điện ly nền (Background Electrolyte – BGE) hoặc gắn vào thành của điện di mao quản hoặc pha tĩnh Khi phân tích đồng phân đối quang. .. bình định mức với thể tích khác nhau - Các dụng cụ khác: cốc có mỏ, giấy lọc, phễu thủy tinh… 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng đồng phân đối quang atenolol bằng điện di mao quản - Lựa chọn cột mao quản - Lựa chọn dung dịch điện ly nền - Lựa chọn hiệu điện thế - Lựa chọn nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang - Xác định thứ tự di chuyển của hai đồng phân đối quang - Xác định. .. gian di chuyển của các đồng phân trên điện di đồ, xác định thứ tự di chuyển của hai đồng phân Xác định hàm lượng của đồng phân (S) -atenolol và (R) atenolol trong chuẩn (R,S) -atenolol Do đơn đồng phân (R) -atenolol có giá rất cao, nồng độ của hai đồng phân đối quang của atenolol trong mẫu chuẩn racemic được xác định từ việc so sánh di n tíc pic của pic đồng phân (S) -atenolol trong hỗn hợp (R,S) -atenolol. .. quang Nhu cầu phát triển phương pháp cho phân tích đồng phân đối quang ngày càng tăng Trong nghiên cứu dược, việc phân tích các đồng phân đối quang có ý nghĩa đặc biệt quan trọng do có thể thực hiện được các nhiệm vụ sau: - Phân biệt dạng đơn đồng phân và racemic 5 - Phân tích tạp đồng phân đối quang - Phân biệt dược động học và dược lực học của hai dạng đồng phân Do các đồng phân quang học rất giống nhau... tác động của điện trường Điện di mao quản là quá trình điện di được thực hiện trong mao quản có kích thước rất nhỏ, dưới 100 µm Dưới tác dụng của dòng điện di và dòng điện thẩm, các chất phân tích được di chuyển trong ống mao quản [3], [4] Dòng điện di là dòng điện tạo ra do các ion hoặc các phần tử điện di chuyển dọc theo mao quản về phía cực trái dấu dưới tác dụng của lực điện trường Dòng điện thẩm... lọc đối quang Tuy nhiên độ phân giải giữa hai pic của đồng phân đối quang atenolol chưa tốt Trong nghiên cứu của Wuhong et al 2010 [20], tác giả đã tách được hai đồng phân đối quang của atenolol hoàn toàn khỏi nhau và thời gian di chuyển của hai đồng phân không quá dài Tuy nhiên tác giả chưa xác định được thứ tự di chuyển của hai đồng phân 12 Bảng 1.2: Một số nghiên cứu tách đồng phân đối quang atenolol. .. tắc của phương pháp này là cho hai đồng phân đối quang phản ứng với một hợp chất bất đối tạo thành một hỗn hợp hai đồng phân lập thể không đối quang, sau đó phân tách bằng các phương pháp tách thông thường như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) hoặc điện di mao quản (CE) Tuy nhiên phương pháp này có nhiều nhược điểm như tốn thời gian xử lý mẫu, thuốc thử bất đối phải có độ tinh khiết cao, hai đồng phân. .. một số điều kiện điện di ban đầu và khảo sát thêm một số điều kiện điện di: cột mao quản, dung dịch điện ly nền, nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang, điện thế Lựa chọn cột mao quản Chúng tôi tiến hành điện di dung dịch chuẩn (R,S) -atenolol 100 ppm (kl/tt) với điều kiện điện di trên, sử dụng các cột mao quản khác nhau Lựa chọn dung dịch điện ly nền Tiến hành điện di dung dịch chuẩn (R,S) -atenolol 100 ppm... của atenolol, chỉ đồng phân (S) -atenolol có tác dụng chẹn beta giao cảm Đồng phân (R) -atenolol không những không có tác dụng dược lý này, thậm chí còn có nhiều tác dụng không mong muốn hơn đồng phân (S) -atenolol Do đó atenolol cũng là một đối tượng tiềm năng của sự chuyển dạng đồng phân như đã đề cập ở trên [30] 1.3 Tổng quan về phân tích đồng phân đối quang atenolol Các nghiên cứu ở nước ngoài Các đồng. .. (S) -atenolol trong hỗn hợp (R,S) -atenolol với di n tích pic của đồng phân (S) -atenolol trong chuẩn đơn (S) -atenolol phân tích trong cùng điều kiện điện di Từ nồng độ của hai đồng phân trong hỗn hợp racemic và nồng độ của đơn đồng phân (S) -atenolol, tính ra nồng độ của đơn đồng phân (R) -atenolol trong chuẩn hỗn hợp 2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích Nghiên cứu được thẩm định theo hướng dẫn của ICH [19] và . tài Xây dựng phương pháp định lượng đồng phân đối quang atenolol bằng điện di mao quả n” với hai mục tiêu: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng. nghiên cứu 15 2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng đồng phân đối quang atenolol bằng điện di mao quản 15 2.2.2. Thẩm định phương pháp 15 2.2.3. Ứng dụng 16 2.3. Phương pháp nghiên cứu 16. 1.1. Phân tích đồng phân đối quang 2 1.1.1. Đồng phân đối quang 2 1.1.2. Phân tích đồng phân đối quang 4 1.2. Tổng quan về atenolol 9 1.3. Tổng quan về phân tích đồng phân đối quang atenolol