BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGÔ THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 184.225 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2015 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGÔ THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 184.225 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. Nguyễn Liên Hương Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh - Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2015 LỜI CẢM ƠN Với sự biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô giáo ThS. Nguyễn Liên Hương - người đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ và chỉ bảo tận tình để giúp tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên đang giảng dạy và công tác tại bộ môn Vi sinh – sinh học, bộ môn Công nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy giáo, cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã chỉ dạy, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường. Đồng thời, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên, hỗ trợ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu khoa học. Do điều kiện nghiên cứu, thời gian có hạn và trình độ của bản thân còn hạn hẹp nên không thể tránh khỏi những sai sót trong bài luận. Vì vậy, tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của các thầy cô để khóa luận được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn. Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Ngô Thanh Huyền MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 2 1.1. Đại cương về kháng sinh 2 1.2. Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes) 3 1.3. Cải tạo giống và bảo quản giống vi sinh vật 5 1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 7 1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh 8 1.6. Sơ lược một số phương pháp xác định cấu trúc của kháng sinh. 10 1.7. Một số nghiên cứu về kháng sinh có nguồn gốc từ Streptomyces. 11 CHƢƠNG II. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1. Đối tượng nghiên cứu 13 2.1.1. Giống xạ khuẩn 13 2.1.2. Vi sinh vật kiểm định 13 2.1.3. Các loại môi trường nuôi cấy 13 2.1.4. Dụng cụ, hóa chất 15 2.2. Nội dung nghiên cứu 17 2.2.2. Chọn lọc và cải tạo giống 17 2.2.3. Lên men, chiết tách kháng sinh 17 2.2.4. Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được 17 2.3. Phương pháp thực nghiệm 18 2.3.1. Phương pháp nuôi cấy giữ giống 18 2.3.2. Phương pháp xác định hình thái xạ khuẩn 18 2.3.3. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 19 2.3.4. Phương pháp chọn môi trường nuôi cấy thích hợp 20 2.3.5. Phương pháp cải tạo và chọn giống 20 2.3.6. Phương pháp lên men chìm tổng hợp kháng sinh 23 2.3.7. Phương pháp xác định độ bền nhiệt, độ bền pH của kháng sinh trong dịch lọc dịch lên men 24 2.3.8. Các phương pháp chiết tách kháng sinh 24 2.3.8.2. Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký 24 2.3.9. Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết 26 2.3.10. Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được 26 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 27 3.1. Xác định hình thái xạ khuẩn Streptomyces 184.225 27 3.2. Kết quả chọn MT nuôi cấy thích hợp và xác định tác dụng của kháng sinh 27 3.3. Kết quả cải tạo giống 28 3.3.1. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên 28 3.3.2. Kết quả đột biến 29 3.4. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh 32 3.5. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến độ bền của kháng sinh trong dịch lọc 33 3.6. Kết quả chọn dung môi hữu cơ chiết xuất kháng sinh 34 3.7. Kết quả tách kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng. 36 3.8. Kết quả chạy sắc kí cột 37 3.9. Sơ bộ xác định cấu trúc hóa học và một số đặc điểm của KS thu được. 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT AND Acid 2'- deoxyribonucleic B.subtilis Bacillus subtilis DM Dung môi DMHC Dung môi hữu cơ ĐB Đột biến Gr(-) Gram âm Gr(+) Gram dương HTKS Hoạt tính kháng sinh ISP International Streptomyces Project (chương trình Streptomyces quốc tế) KS Kháng sinh KTCC Khuẩn ty cơ chất KTKS Khuẩn ty khí sinh MC Mẫu chứng MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể P.mirabilis Proteus mirabilis s Sai số chuẩn đã hiệu chỉnh SKLM Sắc ký lớp mỏng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên TB Tế bào UV Ultra violet (tử ngoại) V Thể tích VSV Vi sinh vật DANH MỤC BẢNG, DANH MỤC PHỤ LỤC Bảng 1.1. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học 2 Bảng 2.1. Các vi sinh vật kiểm định 13 Bảng 2.2: Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml) 14 Bảng 2.3. Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định 15 Bảng 2.4. Các dung môi sử dụng và một số đặc tính của nó 15 Bảng 3.1. Các đặc điểm của Streptomyces 184.225 27 Bảng 3.2. Kết quả thử HTKS với 10 VSV kiểm định. 27 Bảng 3.3. Kết quả thử nghiệm HTKS sàng lọc ngẫu nhiên 29 Bảng 3.4. Kết quả thử HTKS đột biến lần 1. 29 Bảng 3.5: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2. 30 Bảng 3.6: Kết quả thử HTKS đột biến hóa học. 31 Bảng 3.7. Kết quả thử HTKS chọn môi trường lên men. 32 Bảng 3.8. Kết quả lên men các biến chủng tốt nhất trên MT2dt. 32 Bảng 3.9. Kết quả ảnh hưởng của pH đến độ bền kháng sinh. 33 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ bền của kháng sinh trong dịch lọc. 34 Bảng 3.11. Kết quả chiết kháng sinh bằng DMHC ở các pH khác nhau. 35 Bảng 3.12. Kết quả tách kháng sinh trong dịch chiết bằng SKLM 36 Bảng 3.13. Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy cột lần 1. 37 Bảng 3.14. Kết quả SKLM với các phân đoạn 2-18. (hiện hình bằng B.subtilis) 38 Bảng 3.15. Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy cột lần 2. 39 Bảng 3.16. Kết quả SKLM các PĐ 2-15 của lần chạy cột lần 2 tách KS1, KS2. 40 Bảng 3.17. Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy cột lần 3. 41 Bảng 3.18. Kết quả SKLM các PĐ 2-12 của lần chạy cột lần 3 tách KS2, KS3. 41 Phụ lục 1. Bảng 3.3. Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên 49 Phụ lục 2. Bảng 3.4. Kết quả thử HTKS đột biến lần 1. 50 Phụ lục 3. Bảng 3.5: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2. 52 Phụ lục 4. Bảng 3.6: Kết quả thử HTKS đột biến hóa học. 54 Phụ lục 5. Sơ đồ cơ chế tác dụng của kháng sinh. 56 Phụ lục 6. Ống nghiệm chứa Streptomyces 184.225 sau 6 ngày nuôi cấy. 56 Phụ lục 7. Kết quả thử HTKS Streptomyces 184.225 bằng PP giếng thạch. 57 Phụ lục 8. Kết quả thử HTKS Streptomyces 184.225 bằng PP khoanh giấy lọc. 57 Phụ lục 9. SKLM các phân đoạn tách các chất kháng sinh. 58 Phụ lục 10. Hình dạng chuỗi bào tử (a) và bề mặt bào tử (b) của Streptomyces 184.225 58 Phụ lục 11. Phổ tử ngoại vết KS2 của Streptomyces 184.225 59 Phụ lục 12. Phổ hồng ngoại vết KS2 của Streptomyces 184.225. 60 Phụ lục 13. Phổ khối lượng vết KS2 của Streptomyces 184.225. 60 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Năm 1928 khi Alexander Fleming ngẫu nhiên phát hiện ra sự ức chế phát triển S.aureus của Penicillin notatum, đến năm 1941, ông đã chiết ra được Penicillin từ chủng Penicilium chrysogenium có hoạt tính cao hơn nhiều lần và đã cứu được hàng ngàn thương binh trong chiến tranh thế giới lần 1. Từ đó, các công trình nghiên cứu kháng sinh liên tục được tiến hành, ứng dụng rộng rãi trong y học lâm sàng, và ngành công nghệ lên men sản xuất kháng sinh đã ra đời. Mặc dù đã có rất nhiều thành công trong việc phát hiện ra kháng sinh và những tiến bộ trong kỹ thuật sản xuất kháng sinh, nhưng hiện nay các bệnh nhiễm khuẩn vẫn đang là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn thế giới, khoảng hơn 17 triệu người chết mỗi năm. Tự sử dụng thuốc và lạm dụng kháng sinh là một yếu tố quan trọng gây hiện tượng kháng kháng sinh, giảm tuổi thọ của thuốc. Do đó thấy được sự cấp thiết phải liên tục cho nghiên cứu và phát triển các loại thuốc kháng sinh mới. Khí hậu Việt Nam có điều kiện rất thuận lợi cho sự phát triển đa dạng của hệ VSV, đáng chú ý là các xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, trong số đó 55% là do chi Streptomyces sản xuất. Chi này còn có nhiều VSV ngoài khả năng sinh tổng hợp kháng sinh còn tổng hợp các chất khác: chất điều trị ung thư (actinomycin D), chất kích thích tăng trưởng được sử dụng nhiều trong chăn nuôi… Chính vì vậy tôi chọn đề tài “Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 184.225” với các mục tiêu sau: - Sơ bộ xác định hình thái của Streptomyces 184.225 theo ISP. - Cải tạo giống theo hướng nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh. - Xác định, lựa chọn môi trường lên men thích hợp, chiết xuất, tinh chế KS. - Sơ bộ xác định một vài đặc tính vật lí, hóa học của kháng sinh tổng hợp được. 2 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. Đại cƣơng về kháng sinh 1.1.1. Định nghĩa kháng sinh Theo quan niệm truyền thống: "Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất tự nhiên được các vi sinh vật tạo ra, có tác dụng ức chế phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật khác". Theo quan niệm hiện nay: Kháng sinh đại diện cho tất cả các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật nhiễm sinh (cũng như cả với tế bào ung thư) ở nồng độ thấp, mà không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên người, động vật hoặc thực vật bằng con đường cung cấp chung. Kháng sinh là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp chỉ được sinh tổng hợp mạnh mẽ ở giai đoạn phát triển sau (pha logarit muộn, pha dừng, hoặc pha suy tàn) của sinh trưởng VSV [9]. 1.1.2. Phân loại kháng sinh Kháng sinh được phân loại dựa vào cấu trúc hóa học, cơ chế tác dụng,…trong đó phân loại theo cấu trúc hóa học được áp dụng phổ biển nhất vì nó giúp người nghiên cứu nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của chất kháng sinh mới phát hiện thông qua cấu trúc hóa học của nó. Các chất được phân loại theo cấu trúc hóa học chia làm 10 nhóm theo bảng 1.1 [8], [5]. Bảng 1.1. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học. Nhóm kháng sinh Ví dụ β – lactam Penicillin, cephalosporin,… Quinolon Ciprofloxacin, ofloxacin,… Aminoglycosid Streptomycin, gentamicin Tetracyclin Tetracyclin, doxycyclin Macrolid Erythromycin, clarithromycin, … Polypeptid Polymycin, vancomycin, Imidazol Metronidazol,… Lincosamid Lincomycin, clindamycin, Sulphonamid Cotrimoxazol Nhóm khác Mupirocin [...]... bảo quản giống vi sinh vật 1.3.1 Cải tạo giống vi sinh vật  Mục đích: Do các VSV sinh tổng hợp kháng sinh phân lập được từ cơ chất thường có hoạt tính rất thấp, vì vậy để thu được các chủng có hoạt tính cao đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo chọn giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp nhằm: 6 - Tăng cường hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh - Cải tạo các... VSV kiểm định cho các nghiên cứu về sau - Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn 3 dạng chủng có HTKS cao nhất - Đột biến bằng ánh sáng UV từ 1 đến 2 lần để nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn gốc - Đột biến bằng tác nhân hóa học để tiếp tục nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn gốc 2.2.3 Lên men, chiết tách kháng sinh - Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất,... 2.3.9 Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết Các phân đoạn chính tinh khiết sau chạy cột được gộp vào cất quay chân không đến khô, cạo thu bột kháng sinh tinh khiết vào ống nghiệm sạch Kết tinh kháng sinh nhiều lần bằng hỗn hợp DMHC thích hợp Lọc, sấy, cân lượng kháng sinh tinh khiết thu được 2.3.10 Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được Bột kháng sinh tinh khiết đem đi đo các... thấy bột kháng sinh thô có ít nhất 4 thành phần Tiến hành tinh chế các thành phần chính thu được hiệu suất là 66% [20] 13 CHƢƠNG II ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1 Giống xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn nghiên cứu: chủng xạ khuẩn Streptomyces 184.225 đã được phân lập và tuyển chọn, do bộ môn Vi sinh – Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp và lưu giữ 2.1.2 Vi sinh vật... 1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh Khái quát theo đích tác dụng của kháng sinh: - Tổng hợp thành tế bào: β –lactam, vancomycin… - Màng tế bào chất: Polyen, amphotericin,… - Tổng hợp ADN: Actinomycin, anzamycin - Tổng hợp protein: Aminoglycosid (ribosome), macrolid (liên kết t-ADN)… - Trao đổi chất hô hấp: Antimycin,… - Trao đổi chất folat: Sulfamid,… Sơ đồ cơ chế tác dụng kháng sinh được trình bày ở... lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được từ những lần cải tạo giống, lựa chọn biến chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất - Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH của dịch lọc kháng sinh - Tìm dung môi hữu cơ chiết dịch lọc của dịch lên men và pH chiết tốt nhất - Tìm hệ dung môi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất - Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch... giá kết quả Căn cứ kết quả vòng vô khuẩn, lựa chọn và giữ lại 3 chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo 2.3.5.2 Đột biến cải tạo giống bằng ánh sáng UV * Mục đích: Cải tạo những chủng có hoạt tính cao sau sàng lọc ngẫu nhiên nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh * Tiến hành: - Pha hỗn dịch bào tử: lấy 1 vòng que cấy bào tử biến chủng tốt... phương pháp giếng thạch - Chọn chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất: các dạng chủng, biến chủng cần thử được nhân giống cấp 1 trên MT2dt, lên men trên môi trường tối thích đã chọn cho sinh tổng hợp kháng sinh Thử hoạt tính dịch lên men 24 bằng phương pháp giếng thạch 2.3.7 Phương pháp xác định độ bền nhiệt, độ bền pH của kháng sinh trong dịch lọc dịch lên men - Xác định độ bền nhiệt:... trong nồng độ thấp Mg2+) Kết luận rằng khả năng tổng hợp protein bất thường này trong giống đột biến Streptomyces là kết quả của việc gia tăng sự ổn định của phức hợp 70S, tác động trực tiếp đến việc tăng cường sản xuất Salinomycin [26] 1.7.3 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 15.29 Streptomyces microflavus Tiến hành nghiên cứu trên chủng Streptomyces 15.29: theo phân loại... điểm của Streptomyces 184.225 Đặc điểm Streptomyces 184.225 Màu sắc khuẩn ty khí sinh vàng (Y) Màu sắc khuẩn ty cơ chất 1 Sắc tố hòa tan 1 Chuỗi bào tử Rf Bề mặt bào tử Sm 3.2 Kết quả chọn MT nuôi cấy thích hợp và xác định tác dụng của kháng sinh do Streptomyces 184.225 tổng hợp Tiến hành nuôi cấy chủng Streptomyces 184.225 trên 5 môi trường khác nhau, sau đó thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp . vi sinh vật 5 1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 7 1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh 8 1.6. Sơ lược một số phương pháp xác định cấu trúc của kháng sinh. 10 1.7. Một số nghiên cứu. xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, trong số đó 55% là do chi Streptomyces sản xuất. Chi này còn có nhiều VSV ngoài khả năng sinh tổng hợp kháng sinh còn tổng hợp các chất khác: chất. NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 184. 225 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. Nguyễn Liên Hương Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh - Sinh