BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ VÂN LY NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA CÂY SÂM CAU (Curculigo orchioides Gaertn.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SỸ KHÓA 65 HÀ NỘI -2015 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ VÂN LY NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA CÂY SÂM CAU (Curculigo orchioides Gaertn.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SỸ Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển DS. Nguyễn Bích Ngọc Nơi thực hiện: Bộ môn Dƣợc học cổ truyền Viện Dƣợc liệu HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Vơi sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo, PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển, người thầy đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến DS. Nguyễn Bích Ngọc đã hướng dẫn, đóng góp những kinh nghiệm quý báu và hỗ trợ tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Khoa Dược lý Sinh hóa -ViệnDược liệu đã giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. Em cũng xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường và các thầy cô giáo trong trường đã dạy dỗ và dìu dắt em trong năm năm học tại trường. Cuối cùng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên, khích lệ và hết lòng giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Em xin chân thành cảm ơn!!! Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Vân Ly MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. VỊ TRÍ PHÂN LOẠI, ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, PHÂN BỐ CỦA CHI CURCULIGO GAERTN. 2 1.1.1. Vị trí phân loại của chi Curculigo Gaertn. 2 1.1.2. Đặc điểm thực vật, phân bố chi Curculigo Gaertn. 2 1.2. CÂY SÂM CAU CURCULIGO ORCHIOIDES GAERTN. 4 1.2.1. Đặc điểm thực vật và phân bố cây sâm cau 4 1.2.2. Thành phần hóa học 5 1.3. ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CURCULIGO ORCHIODES GAERTN. 10 1.3.1. Độc tính 10 1.3.2. Tác dụng sinh học 11 1.3.3. Công dụng của sâm cau theo y học cổ truyền 15 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1. NGUYÊN LIỆU 18 2.2. PHƢƠNG TIỆN 18 2.2.1. Thiết bị, dụng cụ 18 2.2.2. Dung môi, hóa chất thuốc thử 18 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.3.1. Xác định mẫu nghiên cứu. 19 2.3.2. Nghiên cứu định tính các nhóm chất trong dƣợc liệu và trong các cắn n- hexan, ethyl acetat và n-butanol bằng phản ứng hóa học 19 2.3.3. Nghiên cứu định tính các nhóm chất trong dƣợc liệu bằng phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng 19 2.3.4. Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của các chất 19 2.3.5 Phƣơng pháp thử độc tính cấp 20 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 22 3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC 22 3.1.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thân rễ sâm cau bằng phản ứng hóa học 22 3.1.2. Định tính các nhóm chất trong các cắn phân đoạn của thân rễ sâm cau bằng phản ứng hóa học 27 3.1.3. Kết quả định tính nhóm chất hữu cơ trong thân rễ sâm cau bằng phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng 29 3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 34 3.2.1. Trong phân đoạn n-hexan 34 3.2.2. Trong phân đoạn ethyl acetat 36 3.3. THỬ ĐỘC TÍNH CẤP 40 3.3.1. Kết quả xác định hàm ẩm dƣợc liệu và cao dƣợc liệu 40 3.3.2. Kết quả thí nghiệm 41 BÀN LUẬN 43  VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 43  VỀ CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC 43  VỀ ĐỘC TÍNH CẤP 45 KẾT LUẬN 46 ĐỀ XUẤT 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Kết quả định tính các nhóm chất có trong thân rễ sâm cau bằng phản ứng hóa học 26 Bảng 2: Kết quả định tính cắn các phân đoạn bằng phản ứng hóa học 28 Bảng 3: Bảng giá trị R f của các vết ở phân đoạn n-hexan 30 Bảng 4: Bảng giá trị R f của các vết ở phân đoạn ethyl acetat 31 Bảng 5: Bảng giá trị R f của các vết ở phân đoạn n-butanol 32 Bảng 6: Số liệu phổ 1 H (500 MHz) và 13 C-NMR (125 MHz) của hợp chất SC2 39 Bảng 7: Kết quả xác định hàm ẩm thân rễ sâm cau 40 Bảng 8: Kết quả xác định hàm ẩm của cao thân rễ sâm cau 40 Bảng 9: Số liệu thử độc tính cấp của cao chiết sâm cau 42 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Hình ảnh Curculigo orchioides Gaertn. [phụ lục 1] 4 Hình 2: Sơ đồ chiết xuất và phân đoạn các chất từ thân rễ sâm cau 27 Hình 3: Sắc kí đồ sắc kí lớp mỏng định tính cắn phân đoạn n-hexan với hệ III 29 Hình 4: Sắc kí đồ sắc kí lớp mỏng định tính cắn phân đoạn ethyl acetat với hệ II 31 Hình 5: Sắc kí đồ sắc kí lớp mỏng định tính cắn phân đoạn n-butanol với hệ III 32 Hình 6: Sắc kí đồ sắc kí lớp mỏng định tính sự có mặt của hợp chất phenolic trong 2 cắn n-hexan và ethyl acetat 33 Hình 7: Sắc kí đồ sắc kí lớp mỏng thể hiện sự có mặt của alcaloid trong thân rễ sâm cau 34 Hình 8: Quy trình phân lập hợp chất SC1 từ cắn n-hexan của thân rễ sâm cau 35 Hình 9: Sắc kí đồ định tính sự có mặt của SC1 phân lập đƣợc trong cắn phân đoạn n-hexan và hợp chất β - sitosterol chuẩn 35 Hình 10: Công thức cấu tạo hợp chất SC1 β-sitosterol 36 Hình 11: Quy trình phân lập hợp chất SC2 từ cắnethyl acetat của thân rễ sâm cau 37 Hình 12: Sắc kí đồ định tính sự có mặt của SC2 phân lập đƣợc trong cắn phân đoạn ethyl acetat 38 Hình 13: Công thức cấu tạo SC2 Orcinol-3-O-β-D-glucosid 40 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ALP : Alkaline phosphatase ALT : Alanine aminotransferase AST : Aspartate aminotransferase CDCl 3 : CHCl 3 (với 2 H đƣợc ký hiệu là D) DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DPPH : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl FSH : Follicle Stimulating Hormone GGT : Gamma-glutamyl transferase IR : Phổ hồng ngoại LD 50 : liều làm chết 50% động vật thử nghiệm LH : Luteinizing Hormone MC3T3-E1 : Tế bào tạo hình xƣơng MMP-1 : Matrix metalloproteinase-1 MS : Khối phổ 1 H-NMR : Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân của proton 13 C-NMR : Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân của 13 C RNA : Acid ribonucleic m-RNA : ARN thông tin r-RNA : ARN ribosome SKLM, TLC : Sắc ký lớp mỏng TT : Thuốc thử UV : Phổ tử ngoại VEGF : Yếu tố tăng trƣởng nội mô mạch máu δ : Độ dịch chuyển hóa học (đơn vị tính là ppm) d : Đỉnh đôi s : Đỉnh đơn a : Đo trong CD 3 O 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thuộc họ Tỏi voi lùn (Hypoxidaceae). Trong y học cổ truyền Trung Quốc, thân rễ sâm cau đƣợc tán thành bột hoặc, sắc nƣớc làm thuốc bổ, trị suy nhƣợc cơ thể, đau lƣng, viêm khớp và viêm thận mạn tính. Ở Ấn Độ, Nepal và Philippin thân rễ sâm cau dùng làm thuốc lợi tiểu, tăng cƣờng chức năng tình dục, chữa bệnh ngoài da, loét dạ dày tá tràng, trĩ, lậu…Sâm cau còn là thành phần chính trong bài thuốc cổ truyền điều trị sỏi tiết niệu của Ấn Độ [16], [56]. Theo Y học cổ truyền Việt Nam, sâm cau có vị cay, tính ấm, có tác dụng trợ dƣơng, trừ hàn, cƣờng dƣơng, mạnh gân xƣơng. Đồng bào các dân tộc thƣờng sử dụng thân rễ cây sâm cau (thƣờng gọi là tiên mao) nhƣ một loại thuốc bổ - có thể dùng riêng hoặc kết hợp cùng với các vị thuốc khác - để điều trị các bệnh nhƣ: liệt dƣơng, đau lƣng, viêm khớp, viêm thận, vàng da, vô sinh [16].Mặc dù đã đƣợc sử dụng từ lâu trong y học cổ truyền, nhƣng chƣa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dƣợc lý của cây sâm cau ở Việt Nam đƣợc công bố. Căn cứ tài liệu tham khảo chúng tôi thu thập đƣợc, đến nay mới chỉ có công bố của Nguyễn Duy Thuần và cộng sự (2001), về một số kết quả nghiên cứuthành phần hóa học; tác dụng chống oxy hóa và tác dụng tăng lực của sâm cau thu hái tại Tuyên Quang [15]. Để có thêm cơ sở khoa học cho việc sử dụng sâm cau làm thuốc, đồng thời phát huy hơn nữa giá trị, vai trò của cây sâm cau trong y dƣợc học, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và thử độc tính cấp của cây sâm cau – Curculigo orchioides Gaertn., họ Hypoxidaceae” với các mục tiêu sau: - Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc 1-2 chất tinh khiết từ thân rễ sâm cau. - Đánh giá độc tính cấp của cao chiết cồn thân rễ sâm cau. 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. VỊ TRÍ PHÂN LOẠI, ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, PHÂN BỐ CỦA CHI CURCULIGO GAERTN. 1.1.1. Vị trí phân loại của chiCurculigo Gaertn. Theo Phạm Hoàng Hộ và Đỗ Tất Lợi chiCurculigo Gaertn. đƣợc xếp trong họ Amaryllidaceae [12], [10]. Theo Vũ Văn Chuyên, chi Curculigo Gaertn. trƣớc đây cũng đƣợc xếp vào họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) nhƣng hiện giờ đƣợc tách ra thành họ Hypoxidaceae[7]. Theo phân loại chiCurculigoGaertn. dựa trên hệ thống phân loại của A. L. Takhtajan năm 1987 về nhóm thực vật có hoa và các nhóm thực vật bậc cao có mạch khác, chỉnh lý một phần theo hệ thống năm 1996 của A. L. Takhtajan [3], [6]. + Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) + Lớp Hành (Liliopsida) + Phân lớp Hành (Liliidae) + Bộ Haemodorales + Họ Tỏi voi lùn (Hypoxidaceae) + Chi Curculigo Gaertn. 1.1.2. Đặc điểm thực vật, phân bố chi Curculigo Gaertn. Đặc điểm thực vật chi Curculigo G. Cây thảo, sống lâu năm thƣờng có thân rễ củ. Lá hình ngọn giáo hoặc hình dải, thƣờng xếp nếp, thƣờng mọc từ rễ. Cụm hoa chùm, hình trứng hoặc hình đầu, ở ngọn một cán hoa mọc từ rễ, dài nhiều hay ít. Hoa có cuống hoặc không, màu vàng, bao hoa đính trực tiếp trên bầu hoặc trên một mỏ dài nằm trên bầu. Lá đài 3, tràng 3, rời, hầu nhƣ giống nhau về hình dạng và kích thƣớc, trải ra thành hình sao. Nhị 6 xếp hai dãy, không có chỉ nhị hoặc trên một chỉ nhị dài; bao phấn dài có 2 ô sát nhau, song song, hƣớng trong. Bầu hạ, 3 ô có nhiều noãn. Quả không mở, có vỏ quả mỏng có mỏ hoặc không [6]. Phân bố của chi Curculigo G. [...]... dƣợc liệu đƣợc cung cấp từ đề tài cấp Bộ Y tế: Nghiên cứu thành phần hoá học, tác dụng sinh học và nhân giống loài sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn) .” Mẫu cây đƣợc giám định tên khoa học là: Curculigo orchioides Gaernt., họ Tỏi voi lùn (Hypoxidaceae) 2.2 PHƢƠNG TIỆN 2.2.1 Thiết bị, dụng cụ Cân kĩ thuật Precisa, ống đong các loại (10-2000 ml), bình cầu đáy tròn các loại (100-2000 ml) bình gạn 1-2 lít,... PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Xác định mẫu nghiên cứu Giám định tên khoa học của cây trên cơ sở phân tích các đặc điểm hình thái thực vật, so sánh với các khóa phân loại thực vật 2.3.2 Nghiên cứu định tính các nhóm chất trong dƣợc liệu và trong các cắn nhexan, ethyl acetat và n-butanol bằng phản ứng hóa học Định tính các nhóm chấtbằng ống nghiệm theo tài liệu Thực tập Dƣợc liệu phần hóa học [1] 2.3.3 Nghiên cứu. .. Với TT Fehling A và B +++ Có 11 Caroten Phản ứng với H2SO4 đặc ++ Có 12 Chất béo Phản ứng mờ giấy lọc + Có Ghi chú: ( -): phản ứng âm tính ( +) phản ứng dƣơng tính (+ +) dƣơng tính rõ (++ +) dƣơng tính rất rõ 27 3.1.2 Định tính các nhóm chất trong các cắn phân đoạn của thân rễ sâm cau bằng phản ứng hóa học Quá trình chiết xuất Dƣợc liệu 3,6 kg thân rễ sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn. ) độ ẩm 10,5 %... Jiao và cộng sự cho rằng tác dụng gây độc cho gan có thể do thành phần triterpenoid ketone có trong dịch chiết ethanol [39] Nghiên cứu về độc tính của C .orchioides tại Việt Nam còn chƣa nhiều và đa số các nghiên cứu đều thực hiện với dạng trà tan Tiên mao 3 g/gói, do khoa Dƣợc bệnh viện YHCT Trung ƣơng sản xuất Đề tài do Dƣơng Minh Sơn và cộng sự thực hiện (200 7) cho kết quả nghiên cứu độc tính cấp. .. Glc(2-1)Glc(3-1)Glc H [78] 8 Curculigosaponin G (3 3) Glc(2-1)Rham H [78] 9 Curculigosaponin H (3 4) Glc(2-1)Rham Ara(p) [78] 10 Curculigosaponin I (3 5) Glc(2-1)Rham(3-1)Glc H [78] 11 Curculigosaponin J (3 6) Glc(2-1)Rham(3-1)Glc Ara(p) [78] 9 Curculigenin B Curculigenin C (3 7) STT Hợp chất R1 Tài liệu H [76], [78] 1 2 Curculigosaponin K (3 9) Glc(2-1)Glc(3-1)Glc [76], [78] 3 Curculigosaponin L (4 0) Glc(2-1)Rham... ( 1), curculigoside B ( 2) và 2, 6-dimethoxylbenzoic acid [33] Trong nghiên cứu của Josep Vall và cộng sự (200 6), đã phân lập từ cây sâm cau hai phenolic cũ là 6 curculigoside A ( 1), curculigoside B ( 2) và hai phenolic mới là curculigoside C ( 3) và curculigoside D ( 4) [68] STT R1 R3 R5 Tài liệu Curculigoside ( 1) OH H OCH3 [40] Curculigoside B ( 2) OH H OH [33] Curculigoside C ( 3) OH OH OCH3 [33], [68]... µm (Merck), Sephadex LH-20, sắc ký cột pha đảo (RP-1 8), máy cất thu hồi dung môi Buchi, tủ sấy Memmert… Máy đo phổ hồng ngoại (IR) FT-IR Spectrophotometer 1650-Perkin Elmer (Viện Hóa học, VAST) Máy đo phổ khối lƣợng LC/MS/MS – Water – API – ISI (Viện Hóa học, VAST) Máy đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H- và 13C-NMR) của hãng Bruker (500MHz), Viện Hóa học, VAST 2.2.2 Dung môi, hóa chất thuốc thử - Dichloromethan... protein procollagen type I và làm giảm biểu hiện của protein MMP-1 dẫn đến có tác dụng tốt trong điều trị sự lão hóa da ngƣời [43] Tại Việt Nam, nghiên cứu của Nguyễn Duy Thuần và Nguyễn Thị Phƣơng Lan (200 1) cũng đã chỉ rõ tác dụng chống oxi hóa in vitro của polyphenol chiết từ thân rễ sâm cau là tƣơng đối cao [15] Tác dụng bảo vệ, chống độc cho gan Qua các nghiên cứu của Rao và cộng sự đã cho thấy tác... xét:Qua các phản ứng hóa học trên, chúng tôi đƣa ra kết luận sơ bộ trong dƣợc liệu thân rễ sâm cau có chứa: saponin, alcaloid, phytosterol, đƣờng khử tự do, chất béo, carotene và hợp chất phenolic Kết quả nghiên cứu trên trùng khớp với đề tàicủa Nguyễn Duy Thuần và Nguyễn Thị Phƣơng Lan (200 1)[ 11] Ngoài ra, thân rễ của cây sâm cau đƣợc thu hái tại Cao Bằng và Đắc Lắc có chứa thành phần alkaloid, tuy... phía Nam và Tây Nam Trung Quốc; Campuchia, Ấn Độ, Indonesia, Nhật Bản, Lào, Myanmar, Pakistan, Papua New Guinea, Philippines, Thái Lan, Việt Nam Ở Việt Nam: cây mọc trên các đồi cỏ nơi ẩm mát vùng núi nhƣ Lai Châu, Tuyên Quang, Cao Bằng [6] Hình 1: Hình ảnh Curculigo orchioides Gaertn [PL1] 5 1.2.2 Thành phần hóa học Hiện nay trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của sâm cau, các . TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ VÂN LY NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA CÂY SÂM CAU (Curculigo orchioides Gaertn. ) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SỸ KHÓA 65. BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ VÂN LY NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA CÂY SÂM CAU (Curculigo orchioides Gaertn. ) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC. học cho việc sử dụng sâm cau làm thuốc, đồng thời phát huy hơn nữa giá trị, vai trò của cây sâm cau trong y dƣợc học, chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học và thử độc tính