TRƯ QUÁCH TH NGHIÊN C VÀ THÀNH PH LOÀI THU ỘC CHI BÀ R KHÓA BỘ Y TẾ TRƯ ỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI QUÁCH TH Ị THÚY NGA NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT ỘC CHI STEPHANIA LOUR. BÀ R ỊA – VŨNG TÀU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯ ỢC SĨ HÀ NỘI – 2015 ỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT ẦN HÓA HỌC CỦA MỘT LOUR. Ở ỢC SĨ BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI QUÁCH THỊ THÚY NGA NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT LOÀI THUỘC CHI STEPHANIA LOUR. Ở BÀ RỊA – VŨNG TÀU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Nguyễn Quốc Huy 2. ThS.NCS. Hoàng Văn Thủy Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Thực vật HÀ NỘI – 2015 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện khóa luận này em đã nhận được sự giúp đỡ, tạo điều kiện của Ban Giám Hiệu, phòng Đào Tạo, Trường Đại Học Dược Hà Nội, sự hướng dẫn, giúp đỡ tận tình của các thầy cô ở Bộ Môn Thực vật, gia đình và bạn bè. Em xin được gửi tới lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS.Nguyễn Quốc Huy, ThS.NCSHoàng Văn Thủy, các thầy đã trực tiếp hướng dẫn em tận tình trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp tại bộ môn. Em cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô Bộ môn Thực Vật, Trường ĐH Dược Hà Nội đã luôn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình làm thực nghiệm tại bộ môn. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới DS. Nguyễn Thị Thùy Linh, bạn Phạm Thị Việt Hồng lớp M2K65, Lương Thị Lan lớp M1K65, Tống Xuân Quang lớp A3K65, em Nguyễn Thị Mai Hạnh lớp M3K66, em Lê Thiên Kim lớp P1K66, những người đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện, và em xin gửi tới gia đình, bạn bè, những người đã động viên, khích lệ em trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận. Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2015 Sinh viên Quách Thị Thúy Nga MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1.ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CHI STEPHANIA LOUR 2 1.1.1.Vị trí phân loại chi Stephania Lour 2 1.1.2.Đặc điểm của chi Stephania Lour 2 1.1.3.Đặc điểm một số loài có dịch màu đỏ trong chi Stephania Lour 3 1.2.PHÂN BỐ CỦA CHI STEPHANIA LOUR 5 1.2.1.Trên thế giới 5 1.2.2.Ở Việt Nam 5 1.3.THÀNH PHẦN HÓA HỌC 8 1.3.1.Những nghiên cứu về alcaloid trong chi Stephania Lour. trên thế giới 8 1.3.2.Những nghiên cứu về oxostephanin trong chi Stephania Lour. 9 1.4.TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO 9 1.4.1.Sắc ký lớp mỏng 9 1.4.2.Đặc điểm chung về HPTLC 10 1.4.3.Ứng dụng của HPTLC trong nghiên cứu dược liệu 11 1.5.CÔNG DỤNG, TÁC DỤNG CỦA OXOSTEPHANIN 12 CHƯƠNG 2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1.NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 13 2.1.1.Nguyên liệu 13 2.1.2.Hóa chất và dụng cụ 13 2.2.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 14 2.2.1.Nghiên cứu về thực vật 14 2.2.2.Nghiên cứu về hóa học 14 2.3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.3.1.Phương pháp nghiên cứu về thực vật 14 2.3.2.Phương pháp nghiên cứu về hóa học 14 CHƯƠNG 3.THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1.THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 20 3.1.1.Kết quả về thực vật 20 3.1.2.Kết quả về thành phần hóa học 24 3.2.BÀN LUẬN 35 3.2.1.Về thực vật 35 3.2.2.Về hóa học 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 PHỤ LỤC 1 PHỤ LỤC 2 PHỤ LỤC 3 PHỤ LỤC 4 PHỤ LỤC 5 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT HPTLC High Performance Thin Layer Chromatigraphy (Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao) SKLM Sắc ký lớp mỏng STT Số thứ tự S. Stephania TLC Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1.Phân bố của các loài thuộc chi Stephania Lour.ở Việt Nam 6 Bảng 1.2.Các nhóm chất chính trong chi Stephania Lour. 8 Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học 29 Bảng 3.2. Kết quả định lượng alcaloid toàn phần 32 Bảng 3.3. Bảng nồng độ và diện tích pic của các mẫu chuẩn 33 Bảng 3.4. Giá trị R f và diện tích pic của các mẫu chuẩn 33 Bảng 3.5. Kết quả định lượng oxostephanin 35 Bảng 3.6. Đặc điểm làm cơ sở giám định tên khoa học 37 Bảng 3.7. So sánh tiêu bản loài nghiên cứu với tiêu bản các phòng tiêu bản nước ngoài 39 Bảng 3.8. So sánh đặc điểm thực vật giữa 2 loài S.venosa (Bl.) Spreng và S.dielsiana Y.C.Wu 40 Bảng 3.9. So sánh hàm lượng oxostephanin giữa loài S.venosa (Bl.) Spreng và S.dielsiana Y.C.Wu 42 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của oxostephanin 9 Hình 3.1. Đặc điểm hình thái của loài nghiên cứu 21 Hình 3.2. Đặc điểm bột dược liệu 22 Hình 3.3.Vi phẫu thân 22 Hình 3.4.Vi phẫu cuống lá 23 Hình 3.5.Vi phẫu lá 23 Hình 3.6. SKLM dịch chiết tổng 31 Hình 3.7. SKLM của 3 hệ dung môi khác nhau 31 Hình 3.8. Mối liên hệ giữa nồng độ và diện tích pic 33 Hình 3.9. Sác ký đồ của các mẫu chuẩn và thử 34 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Chi Bình vôi Stephania Lour.là một chi lớn trong họ Tiết dê (Menispermaceae). Ở Việt Nam, Ngô Thị Tâm đã nghiên cứu loài Stephania pierrei Diels.mọc ở Nghĩa Bình [22]. Nguyễn Tiến Vững đã nghiên cứu loài Stephania glabra (Roxb.)Miers.mọc ở Ninh Bình và loài Stephania kuinanensis H.S.Lo et M.Yang. mọc ở Lạng Sơn[27]. Nguyễn Quốc Huy đã nghiên cứu 3 loài: Stephania brachyandra Diels, Stephania dielsiana Y.C.Wu, Stephania sinica Diels [17]…. Tuy nhiên vẫn có nhiều loài chưa được nghiên cứu kỹ về thực vật và hóa học, nhất là các loài bình vôi thu hái ở các tỉnh phía Nam. Loài Stephania dielsiana Y.C.Wu thu hái ở Ba Vì có đặc điểm nổi bật là có dịch màu đỏ và đã phân lập ra được chất oxostephanin – một hoạt chất được nghiên cứu gần đây là có tác dụng gây độc trên một số dòng tế bào ung thư [17]. Gần đây, một loài Bình vôi thu hái ở Bà Rịa-Vũng Tàu có dịch màu đỏ giống với loài Stephania dielsiana Y.C.Wu chưa thấy có tài liệu nào ở Việt Nam nghiên cứu. Để có định hướng phát triển, sử dụng và bảo tồn loài bình vôi này, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của một loài thuộc chi Stephania Lour.ở Bà Rịa-Vũng Tàu” được thực hiện với 3 mục tiêu sau:  Mô tả đặc điểm thực vật, giám định tên khoa học của loài nghiên cứu; mô tả đặc điểm vi phẫu và bột dược liệu.  Định tính các nhóm chất bằng các phản ứng hóa học, định tính alcaloid trong dược liệu bằng SKLM.  Định lượng alcaloid toàn phần trong dược liệu; bán định lượng oxostephanin bằng phương pháp HPTLC. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CHI STEPHANIA LOUR. 1.1.1. Vị trí phân loại chi Stephania Lour. Theo tài liệu [6], [24], [32], chi Stephania Lour.thuộc: Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae) Liên bộ Hoàng liên (Ranunculanae) Bộ Hoàng liên (Ranunculales) Phân bộ Tiết dê (Menispermineae) Họ Tiết dê (Menispermaceae) 1.1.2. Đặc điểm của chi Stephania Lour. Theo tài liệu [2], [19], [24], [32], chi Stephania Lour.được mô tả như sau: Dây leo, sống lâu năm, hầu hết mảnh khảnh. Thân cỏ. Thân non thường nhẵn, xanh nhạt, xanh bóng hay xanh thẫm. Thân già thường có rãnh dọc, mụn cóc sần sùi màu nâu xám, nâu đen hoặc màu nâu đất. Rễ dạng sợi hoặc phình to thành rễ củ.Rễ củ thường có dạng hình cầu, hình trứng, hình trụ hay có hình dạng bất định. Tùy thuộc vào loài, tuổi cây và điều kiện môi trường sống mà vỏ củ có nhiều thay đổi (nhẵn, xù xì, màu nâu xám nhạt, xám tro hay đen,…) Lá mọc so le.Cuống lá thường gấp khúc ở gốc, hai đầu phình lên, đính vào phiến lá khoảng 1/5-1/3 chiều dài phiến lá. Phiến lá mỏng hoặc dày, nhẵn bóng hoặc rải rác có lông, hình lọng, thường hình trứng hay gần tròn, có cạnh hoặc tam giác tròn, mép lá nguyên hoặc chia thùy, gân lá hình chân vịt, gồm 8-13 gân xuất phát từ đỉnh cuống lá. Cụm hoa mọc ở kẽ lá hay trên thân cây già không lá, thường có dạng tán đơn, tán kép, xim tán kép, hình đầu đến tán ngù, có cuống, đơn độc hay xếp theo kiểu chùm ít nhất ở các nhánh của tán cấp 1, các nhánh cuối cùng đôi khi không đều, hoặc đôi khi các xim tụ họp thành đầu hình đĩa. Hoa đơn tính khác gốc. Hoa đực có 6 - 8 đài rời nhau, xếp thành 2 vòng, bằng nhau hay không bằng nhau, hoặc [...]... 1.3 THÀNH PHẦN HÓA HỌC Cùng với việc nghiên cứu về đặc điểm thực vật của chi Stephania Lour. , các nhà khoa học đã đi sâu nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài trong chi này.Alcaloid là thành phần hóa học chính và được nghiên cứu nhiều nhất 1.3.1 Những nghiên cứu về alcaloid trong chi Stephania Lour trên thế giới Các alcaloid đã phân lập được từ các loài trong chi Stephania Lour. có thể xếp vào... ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 2.1.1 Nguyên liệu  Mẫu nghiên cứu được thu hái tại Bà Rịa- Vũng Tàu, được phân tích và mô tả đặc điểm thực vật, sau đó được đem về trồng tại vườn thực vật trường Đại học Dược Hà Nội và vườn nghiên cứu ở Ba Vì để theo dõi sự phát triển của cây, thu các cơ quan sinh trưởng và sinh sản trong 2 năm 2013 và 2014 để giám định tên khoa học Mẫu... nhọn gờ lên ở phía lưng, mỗi hàng gồm 14-18 gai nhỏ, chi u dài hạt khoảng 6-7 mm, chi u rộng 4-5 mm Giá noãn có lỗ ở giữa Mùa hoa: tháng 5-7, mùa quả: tháng 6-8 Qua các đặc điểm của loài nghiên cứu và tham khảo các tài liệu như khóa phân loại của Thực vật chí Trung Quốc [32], của Nguyễn Chi u [8], nhất là khóa 21 phân loại chi Stephania Lour trong thực vật chí Thái Lan [30], so sánh tiêu bản mẫu tại Phòng... Dichloromethan, Nước cất, Ammoniac đặc, Ethylacetat, n – hexan  Chất chuẩn oxostephanin ( độ tinh khiết 99.90%) [21] 14 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.2.1 Nghiên cứu về thực vật  Mô tả đặc điểm hình thái thực vật  Mô tả đặc điểm bột dược liệu  Mô tả đặc điểm vi phẫu thân, vi phẫu cuống lá, vi phẫu lá 2.2.2 Nghiên cứu về hóa học  Định tính các nhóm chất bằng các phản ứng hóa học  Định tính alcaloid trong... alcaloid toàn phần trong dược liệu  Bán định lượng oxostephanin bằng phương pháp HPTLC 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu về thực vật - Nghiên cứu đặc điểm thực vật: Quan sát bằng mắt thường, kính lúp soi nổi, chụp ảnh và mô tả theo phương pháp mô tả phân tích [3] - Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu: Sử dụng phương pháp nhuộm kép, quan sát trên kính hiển vi, chụp ảnh và mô tả theo... gỗ ở phía trên bắt màu xanh Mô giậu (5): gồm 2 hàng tế bào hình chữ nhật xếp vuông góc với hàng tế bào biểu bì trên và kéo dài vào sâu trong phần gân lá Mô xốp (6): gồm 4-5 hàng tế bào hình nhiều cạnh, kích thước không đều, để hở khoảng gian bào hẹp 3.1.2 Kết quả về thành phần hóa học 3.1.2.1 Định tính các nhóm chất bằng các phản ứng hóa học a) Định tính alcaloid Lấy khoảng 5g bột dược liệu cho vào... dược liệu, độ đúng của phương pháp có thể được chấp nhận với khoảng sai số rộng hơn do nền mẫu lớn và quá trình chi t tách phức tạp, giới hạn RSD có thể dao động từ ± 2,0% đến ± 10,0% hoặc hơn, tuy nhiên cần có biện giải về giới hạn này [26] 20 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1.1 Kết quả về thực vật 3.1.1.1 Đặc điểm thực vật, giám định tên khoa học Cây leo, thân... và mô tả theo phương pháp mô tả phân tích [3] - Nghiên cứu đặc điểm bột dược liệu: Quan sát bằng mắt thường, kính hiển vi, chụp ảnh và mô tả theo phương pháp mô tả phân tích [3] 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu về hóa học 2.3.2.1 Định tính các nhóm chất bằng các phản ứng hóa học Định tính các nhóm chất trong dược liệu bằng phương pháp hóa học theo tài liệu Thực tập dược liệu” [4], [23] 2.3.2.2 Định tính... Trung: Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Bình, Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Bình Định, Phú Yên, Lâm Đồng, Đắc Lắc  Miền Nam: An Giang, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu 6 Bảng 1.1.Phân bố của các loài thuộc chi Stephania Lour. ở Việt Nam STT Tên loài Tên Việt Nam Phân bố Tài liệu 1 S brachyandra Diels Bình vôi núi Lai Châu, Lào Cai 7, 9, 17 cao, Bình vôi nhị ngắn 2 S cambodia Gagnep Bình vôi Đắc Campuchia 3 S cepharantha... hoa ở nách lá, mang vài tán dày Hoa đực: đài 6, cánh hoa 3 Hoa cái có cuống; đài 1, màu cam; cánh hoa 2.Quả hạch hình gần trứng, dẹp nhỏ.Hạt hình trứng bầu, dẹt, dọc chi u lưng bụng có 4 hàng gai, mỗi hàng có 12 - 20 gai nhỏ 1.2 PHÂN BỐ CỦA CHI STEPHANIA LOUR 1.2.1 Trên thế giới Chi Stephania Lour phân bố ở vùng nhiệt đới, á nhiệt đới, có ở các nước: Indonesia, Myanmar, Malaysia, Thái lan, Campuchia, . phát triển, sử dụng và bảo tồn loài bình vôi này, đề tài Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của một loài thuộc chi Stephania Lour. ở Bà Rịa- Vũng Tàu được thực hiện với 3 mục. HỌC DƯỢC HÀ NỘI QUÁCH THỊ THÚY NGA NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT LOÀI THUỘC CHI STEPHANIA LOUR. Ở BÀ RỊA – VŨNG TÀU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng. 13, 17 1.3. THÀNH PHẦN HÓA HỌC Cùng với việc nghiên cứu về đặc điểm thực vật của chi Stephania Lour. , các nhà khoa học đã đi sâu nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài trong chi này.Alcaloid